羊痘病毒及其疫苗研究進(jìn)展.docx

1、幼物2010.31(4),7781ProgreKHinVeterinaryMedicine羊痘病毒及其疫苗研究進(jìn)展趙忠荀點(diǎn)，矢國(guó)華。翩析敏'，張強(qiáng)'(1.中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院蘭州停醫(yī)研究所家俗佼病病旅生物學(xué)國(guó)家柬點(diǎn)實(shí)臉室農(nóng)業(yè)部備腐病存學(xué)重點(diǎn)開(kāi)放實(shí)驗(yàn)室,甘肅蘭州730046,2.甘雨農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物氏學(xué)院，什雨蘭州730070)摘要：國(guó)內(nèi)外已時(shí)羊痕病畚及對(duì)*痕的預(yù)防控制做了大受的研究工作。¥痘痛毒的流行病學(xué)特征、分離及體外培恭、體外檢測(cè)已有了枝快的發(fā)展,而其致痛機(jī)制和基因蛆姑構(gòu)、分子衣位、餡構(gòu)蛋由及麻姑構(gòu)殳血等分子生物學(xué)特征的研究尚待逐浙批入更加深入的稀究.近年來(lái)的研咒主奏是奸對(duì)

2、站構(gòu)基因如p32的各臭找體的構(gòu)建、表達(dá)和對(duì)非飴構(gòu)思因如TK基因的研究及其缺失栽體的杓建、】RT的功能研究等等。會(huì)面而深入的分子生物學(xué)和免疫學(xué)丞礎(chǔ)的研究.將為發(fā)展更為有效的檢測(cè)珍斷方法，并為安會(huì)有效的亞單位疫苗、受組疫苗及枇酸疫苗的研制奠定基命。關(guān)鍵詢；羊痛病毒，毒力相關(guān)其因及蛋白TR基因及分子診斷，疫苗申圖分類(lèi)號(hào)；幽52,654文獻(xiàn)標(biāo)熾碼；A文SWI#：1007-5038(2010)04-0077-05收稿日期|2009-10-15基金項(xiàng)目：甘肅省科技重大寺頊計(jì)劃碩目(O92NKDAO32)作者簡(jiǎn)介；必志茍(1984-),男(白棟).貴州人.碩去研完生，主婆從事前物痛去分子生物學(xué)學(xué)鳥(niǎo)允秋防治研

3、完.*通訊作者RNAiandItsApplicationonTreatmentofAnimalVirusDiseasesDUBin.HANLi-mei.ZHANGLeHei.LITiandai<ShenytmuAur'iculiuratUnivanUyShtnyang»Liaaning*1)0161.China)AbstrwctiRNAiisbeingwidelyused心anefficientgenesilencinKmethodduetoitsspecificitynndefficiency,EndogenousRNAiplnysanimportHnlroleinn

4、ntivirtilimmunityinplants.nemfltodvsandinsects,WhileinnuimmwlH.ititstilluncertainwhethertherearevirusspecificsiRNAandprotectiveRNAidefensesys-tem,loplemadeeffortstosetupnnefficaciouslyantiviralsysteminmammalianH.gainedmanyremarkableachievenieniH.Hndestablishedhnewpathforthepreventionandtrefttmentofv

5、irnldiseases.ThemechanismofRNAianditsapplientioninontivirnldiseasesinanimalwerereviewed.KeywordsiRNAinierferenceianimaliviraldisenae羊痘！W尚(upripfhrvirus.CPV)是最重要的動(dòng)物痘陰毒在分類(lèi)地位上屬于痘病毒科(Paruiridae)樣椎動(dòng)物痘病毒業(yè)科(Oiordopo.rrimif)中的羊痘病毒屬(QipripaErus)成員，包括山羊痘病毒(Goatpax-viruatGPV)»綿羊痘病毒(Sheep/>arvirus§

6、PV)和牛姑背疹病毒(iMf/ipyskindiseasevirus.LS-DV)。作為山羊痘、綿羊痘和牛結(jié)節(jié)疹耕的致痛因子.CPV能引起這些動(dòng)物最為嚴(yán)重的疾病孔在非洲、中東，中亞以及印度,SPV、GPV對(duì)小反芻獸產(chǎn)生r極大影響,在這個(gè)些地方它們的流行常常導(dǎo)致易慰動(dòng)物很高的發(fā)病書(shū)和死亡卒f而相fi.LSDV限于非洲大陸和馬達(dá)加斯加存在，而且牛的納節(jié)性疹塊典發(fā)枕率不定，死亡率低最近幾十年.科研人員對(duì)CPV進(jìn)行了大鼠:研究,許多實(shí)臉室都做了大量工作，試圖通過(guò)一步步深入的研究,能夠控制、消滅羊痘。隨著CPV基因組的公布，兒年的時(shí)間內(nèi)，大M文獻(xiàn)報(bào)道了CPV研究情況.文章就CPV的分子生物學(xué)以及其相關(guān)疫

7、苗的研究進(jìn)展做一蹤述.1病毒基本特征CPV為卵圓形或磚形病壽，胞漿內(nèi)復(fù)制.共琪因組是雙饒D、A,其大小約為290nmX27Onm.CPV由1個(gè)核、2個(gè)側(cè)體和2層脂質(zhì)外膜組成，屬于較小的痘病毒病毒粒子。CPV的衣殼有囊膜，囊膜內(nèi)含有病毒特異性蛋白。核是由DNA和蛋白質(zhì)組成的核蛋白復(fù)合體，位于病毒粒子的中央，呈兩面凹陷，凹陷內(nèi)分布有2個(gè)側(cè)體。核和側(cè)體一起由脂蛋白性表面膜包圍，其間充填有可溶性蛋白，一層?xùn)艡跔畹暮诵哪ぞo貼于核心周?chē)PV對(duì)干燥有較強(qiáng)的抵抗力.在干燥的痂皮內(nèi)可存活3個(gè)月6個(gè)月，在干燥羊舍內(nèi)可存活6個(gè)月8個(gè)月反復(fù)凍融對(duì)其沒(méi)有明顯的滅活作用，但對(duì)直射陽(yáng)光、常用消毒藥以及乙酰或氯仿敏感，放

8、線菌素-D和漠脂氧尿苜可抑制病毒復(fù)制。CPV可在牛、綿羊、山羊源的組織培養(yǎng)細(xì)胞上生長(zhǎng)，原代、次代羔羊睪丸細(xì)胞和腎細(xì)胞最為敏感，也可用Ver。細(xì)胞等細(xì)胞系對(duì)CPV進(jìn)行培養(yǎng)。CPV接種細(xì)胞后最早可在感染后4d使少量細(xì)胞出現(xiàn)細(xì)胞病變，之后的4d6d細(xì)胞病變迅速擴(kuò)展到整個(gè)細(xì)胞層。觀察是否有CPE出現(xiàn)最多可達(dá)14d。2CPV的基因組結(jié)構(gòu)CPV基因組較大，由143kb147kb堿基組成,A+T含地約為75%。CPV含有147個(gè)開(kāi)放閱讀框(openingreadframe,ORF),編碼密度約為93%,能夠編碼53個(gè)2027個(gè)氨基酸。CPV的基因組由中間編碼區(qū)和兩端相同的反向末端重復(fù)序列(invertedt

9、erminalrepeatJTR)構(gòu)成。中間編碼區(qū)(ORFs024123)是一個(gè)與痘苗病毒(Vaccineavirus,VV)基因的所有保守基因同源的核心編碼區(qū)域，其左側(cè)和右側(cè)的1027kb的基因結(jié)構(gòu)中包含有重要的編碼功能的基因序列，含有基因編碼病毒復(fù)制的必需因子其參與病毒轉(zhuǎn)錄、RNA修正、病毒DNA復(fù)制、病毒粒子的構(gòu)建和裝配等。兩端ITR(ORFsOOl023,ORFsl24156)長(zhǎng)度均約為2.3kb,保守性較低.但含有一些功能基因家族，與病毒感染的宿主范圍、毒力等將性有關(guān)。這些基因家族包含5個(gè)ankyrin基因重復(fù)序列和3個(gè)kelch基因重復(fù)序列，還有一些細(xì)胞因子結(jié)合蛋白、IL10、表皮

10、生長(zhǎng)因子樣蛋白、PKP抑制因子、絲氨酸蛋白酶抑制劑、痘病毒特異性毒力基因等的同源序列，它們編碼的蛋白質(zhì)與病毒的修飾、病譚在宿主細(xì)胞中的逃逸、細(xì)胞凋亡以及免疫應(yīng)答等有關(guān)"刃。ITR最末端是兩條鏈交叉連接的發(fā)卡環(huán)，緊接著是由兩套獨(dú)特序列隔開(kāi)的串聯(lián)重復(fù)序列。SP-PV的ITR上的串聯(lián)重復(fù)序列大小為46bp,LSDV的為5bp,而在GTPV的ITR上則不存在串聯(lián)重復(fù)序列。3CPV毒力相關(guān)基因及蛋白研究概況3.1P32基因及其編碼蛋白3.1.1p32基因p32基因位于CPV基因組的6465kbp處，由第74號(hào)()RF編碼，是CPV基因組的長(zhǎng)3.7kbp、PstI片段的一部分。HindDI、Ps

11、tJ片段含有5個(gè)ORF,分別與VV的J6R、H1L、H2L、H3L、H4L基因同源，即P32基因與編碼位于胞內(nèi)成熟VV病毒粒子表面的p35蛋白的基因具有同源性。SPPV、GTPV的p32基因的閱讀框分別由323.322個(gè)氯基酸組成，分別由972bp、969bp的堿基編碼。它們?cè)诨蚪M成上高度保守，在核昔酸水平和氨基酸水平上分別有97.5%和94.7%的同源性皿。兩者P32基因最主要的區(qū)別是在SPPV的P32序列中的55位處是天冬氨酸，而在GTPV和LSDV中不存在。GTPV和SPPV的P32基因有兩個(gè)&oRV酶切位點(diǎn)，而在LSDV中則沒(méi)有EcoRV酶切位點(diǎn)的存在。3.1.2結(jié)構(gòu)蛋白p3

12、2p32蛋白是從CPV感染細(xì)胞中分離得到的結(jié)構(gòu)蛋白，分子質(zhì)量為32ku°此蛋白為CPV的各毒株所共有且含有重要的抗原決定簇，它能夠刺激豚鼠迅速產(chǎn)生抗CPV的中和抗體。p32蛋白是CPV的囊膜蛋白，由319個(gè)324個(gè)氨基酸組成，具有跨膜的螺旋結(jié)構(gòu)，該結(jié)構(gòu)位于C端287位307位氨基酸處?，F(xiàn)已證實(shí)p32蛋白是羊痘病毒屬特有的蛋白，存在于所有已分離的CPV毒株中，其單一血清可以中和CPV感染早期產(chǎn)生的抗體。因此P32基因可作為羊痘PCR診斷的目的基因。3.1.3P32基因克隆、表達(dá)及應(yīng)用p32蛋白是目前世界各地分離、鑒定的CPV共有且特異很強(qiáng)的結(jié)構(gòu)蛋白。獲得可溶性的P32蛋白是進(jìn)行CPV抗

13、體檢測(cè)以及進(jìn)行亞單位疫苗研制的前提條件。因此到目前為止，基于P32結(jié)構(gòu)蛋白進(jìn)行的克隆、表達(dá)已相當(dāng)多。國(guó)內(nèi)外研究人員已構(gòu)建了各種各樣的連接載體和表達(dá)載體，也取得了不同程度的成果。早在1994年,ChandP等利用大腸埃希菌表達(dá)了谷胱U肽S轉(zhuǎn)移酶融合和多聚組氨酸融合的重組P32蛋白，并以該重組蛋白作為抗原建立間接ELISA方法，而且證明了重組蛋白與正痘病毒和副痘病毒陽(yáng)性血清均沒(méi)有反應(yīng)。全長(zhǎng)P32蛋白可溶性最大，且在ELISA中的反應(yīng)性最好。近年來(lái)，國(guó)內(nèi)不少研究人員擴(kuò)增了P32基因，克隆至不同載體，并分別在原核和真核細(xì)胞中表達(dá)了有一定活性的目的蛋白。但由于P32蛋白的跨膜區(qū)對(duì)細(xì)胞具有毒性作用，使其表

14、達(dá)氐低，很難純化到重組P32蛋白以”。于是.國(guó)內(nèi)外研究者便以截去跨膜區(qū)的P32基因?yàn)檠芯繉?duì)象，研究其重組蛋白的用途。Chand'，等曾用截去跨膜區(qū)的重組p32蛋白為抗原，研究了檢測(cè)抗體的間接ELISA方法，該法快速、可靠，且沒(méi)有傳染性。但是最近的研究結(jié)果表明，全長(zhǎng)P32蛋白截去跨膜區(qū)后，對(duì)其免疫原性有一定的影響3.2非結(jié)構(gòu)基因及相關(guān)基因3.2.1TK基因的研究多種DNA病毒具有胸腺喧嚏核甘激醵基因(TK基因)編碼的胸腺啥嚏核存激酶。CPV的TK基因位于基因組中部ORF66處，距離兩端的ITR分別為52kb和91kb。TK基因編碼174個(gè)氨基酸的多肽，這些多肽與VV的J2R基因編碼多肽的

15、同源性約66%。在痘病毒科中不同屬的痘病毒TK基因的位置不同.在CPV.VV、雞痘病毒(Fowlpoxvirus.FPV)中TK基因分別位于基因組的3個(gè)不同的位置。AmanoH等猜測(cè)，這種位置的不固定性很可能是在痘病毒進(jìn)化過(guò)程中，由于痘病毒的基因組重排造成的。盡管存在位置不固定，但TK基因均位于基因組的中間區(qū)域而且具有較高的保守性。CPV擁有龐大的基因組和許多非必需區(qū)，具有研究基因缺失疫苗和病毒活載體的巨大潛力。TK基因是CPV的主要毒力基因，也是病毒復(fù)制的非必需基因，缺失TK基因的CPV突變株在細(xì)胞中的復(fù)制能力極大減弱，因而使疫苗更安全。目前國(guó)內(nèi)外已有不少關(guān)于TK基因重組病毒的構(gòu)建。Bhan

16、uprakashV等口們利用TK基史作為非必需區(qū)構(gòu)建了重組CPV。郭巍等i克隆了我國(guó)山羊痘弱毒疫苗(GTPV-TY)的TK基因，并利用同源重組構(gòu)建了帶有同源重組曾和篩選標(biāo)記的轉(zhuǎn)移載體。鄭敏5通過(guò)試驗(yàn)研究獲得一株性狀穩(wěn)定并保持形態(tài)、生長(zhǎng)性能和免疫原性不變，但對(duì)山羊致病力降低的TK基因缺陷毒株；其整個(gè)試驗(yàn)結(jié)果還證實(shí)了GTPV的scrpin蛋白可通過(guò)抑制caspase-8活性而抑制細(xì)胞凋亡。不過(guò)，目前GTPV缺失疫苗和活載體的研究依然處于起步階段。但是卜.述研究無(wú)疑也將會(huì)對(duì)活載體缺失疫苗的研制進(jìn)一步奠定基礎(chǔ)。3.2.21TR基因及其在CPV分子診斷中的應(yīng)用目前，國(guó)內(nèi)應(yīng)用PCR方法檢測(cè)CPV主要是針對(duì)

17、P32蛋白基因，但是針對(duì)p32蛋白基因檢測(cè)往往也存在不足.而對(duì)于同一樣本針對(duì)ITR基因片段進(jìn)行擴(kuò)增，能夠較容易的檢測(cè)出病毒的存在。因此，有人便基于ITR基因片段進(jìn)行研究，試圖另外找到可應(yīng)用PCR方法檢測(cè)的更為保守、敏感的CPV的基因片段。ManganaVO等頃用CPV的KS-1株和InS-1株的ITR為為目的基因設(shè)計(jì)引物建立了鑒別SSPV的簡(jiǎn)單、快速、特異的PCR方法，能將SPPV與GTPV和皰疹病毒(Herpesviruses)區(qū)分開(kāi)；Markoula-tosP等“a用ITR和a微管蛋巾為目的基因設(shè)計(jì)引物，建立了檢測(cè)皮膚組織中的SPPV和羊傳染性膿皰病毒(Contagiousecthymav

18、irus,CEV)的多重PCR技術(shù)，該技術(shù)采用3對(duì)引物、一步擴(kuò)增方法，比用單一引物的PCR方法更快、更敏感。徐春志等:和王開(kāi)功等分別應(yīng)用PCR方法擴(kuò)增山羊痘病毒QL、LD、Y、B-株反向ITR片段，并將其克隆至PMD18-T載體，構(gòu)建了重組質(zhì)粒PMD18-ITR,再將該重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化DH5a感受態(tài)細(xì)胞進(jìn)行培芥，對(duì)通過(guò)PCR、酶切鑒定為陽(yáng)性的重組菌進(jìn)行序列測(cè)定。徐春志等將所得序列與Gen-Bank收錄的2株山羊病毒、3株綿羊痘病毒全基因序列進(jìn)行比較分析。結(jié)果所測(cè)4個(gè)毒株序列與GenBank上收錄的GTPV的該片段核昔酸序列的同源性均100%，與SSPV的該片段核曹酸序列的同源性均為98.3%。王開(kāi)

19、功等研究也表明，4株病毒都可得到一條長(zhǎng)度均為289bp的DNA片段，該片段可被內(nèi)切酶AZ”I特異識(shí)另L而旦該P(yáng)CR的DNA模板最小檢出量為24.40pg。與此同時(shí)，羅阿東等根據(jù)CPV的ITR的核甘酸序列設(shè)計(jì)引物，以CPV的DNA為模板，建立并優(yōu)化了SYBRGreenI模式熒光PCR檢測(cè)GPV的ITR基因的方法，并與普通PCR方法進(jìn)行敏感性比較。結(jié)果表明，建立的檢測(cè)GPV的SYBRGreenI熒光PCR方法能檢測(cè)出7X102拷貝數(shù)的DNA模板比文獻(xiàn)報(bào)道的普通PCR法更敏感、準(zhǔn)確、快速。他們的研究結(jié)果均表明，ITR基因片段在羊痘病毒屬中也很保守，可以針對(duì)ITR基因建立CPV的PCR檢測(cè)方法。4CP

20、V分子檢測(cè)目前國(guó)內(nèi)基于CPV不同的基因建立了不同的分子檢測(cè)方法，但是每個(gè)方法都不是完美的。如建立在P32基因的PCR方法，以及最近BalamuruganV等:偵構(gòu)建的熒光定量:PCR方法均各自有不同的不足。而盡管基于重組P32建立的ELISA方法具有高度的特異性且與正痘病毒和副痘病毒沒(méi)有交叉反應(yīng)，但由于全長(zhǎng)P32表達(dá)量低，很難得以推廣使用。因此國(guó)內(nèi)外不少研究人員K26）正研究CPV的其他特異性強(qiáng)、表達(dá)量高的功能基因，試圖建立出cPv的診斷檢測(cè)的新途徑。5疫苗研制、CPV傳統(tǒng)疫苗'國(guó)內(nèi)外科研人員通過(guò)廣泛使用許多CPV毒株作為活疫苗，成功制備了二十多種滅活或弱毒疫苗。有的免疫后保護(hù)力可長(zhǎng)達(dá)

21、1年以上.有的甚至終生免疫。我國(guó)使用的疫苗主要是1958年沈榮顯等將分離得到的GTPV太原株經(jīng)過(guò)雞胚化致弱而制成的弱毒疫苗，其免疫期可達(dá)1年。而滅活苗往往只能提供暫時(shí)性的保護(hù)，因?yàn)橐越M織培養(yǎng)細(xì)胞制備的滅活疫苗的病毒粒子不具備完糖囊膜，接種動(dòng)物后不能有效刺激機(jī)體產(chǎn)生對(duì)帶有完整囊膜的病毒粒子的免疫力。而且滅活疫苗通常不能有效激活細(xì)胞免疫，而CPV的免疫反應(yīng)則主要是細(xì)胞免疫。所以滅活苗的效果常常不是很好。而旦活疫苗在非疫區(qū)使用時(shí)存在有病毒擴(kuò)散的可能，所以尚需科研人員對(duì)CPV疫苗做進(jìn)一步研究，期望在深入了解CPV的毒性和宿主范圍的基因基礎(chǔ)上，能夠增加疫苗設(shè)計(jì)的有效性和多功能性。5.1 CPV亞單位疫苗

22、P32蛋白是目前世界各地分離、鑒定的所有CPV共有且特異很強(qiáng)的結(jié)構(gòu)蛋白，但是要獲得基于P32的CPV亞單位疫苗,必須先得到町溶性的P32蛋白。CarnVM等曾研究了大腸埃希菌表達(dá)的GST融合重組p32蛋白混合弗氏佐劑對(duì)試驗(yàn)山羊進(jìn)行肌肉注射接種，并對(duì)重組蛋白的保護(hù)性進(jìn)行了研究。試驗(yàn)結(jié)果證明將GSTP32配以佐劑接種山羊可以提高病毒中和抗體水平，降低CPV強(qiáng)毒感染.引起的臨床癥狀。雖然不能阻止病毒在攻毒部位的復(fù)制，但是可以阻止病毒向周?chē)臄U(kuò)散，并旦使動(dòng)物對(duì)病毒的反應(yīng)更加敏感。但是在由于P32蛋白在表達(dá)的過(guò)程中會(huì)出現(xiàn)表達(dá)量低、表達(dá)不穩(wěn)定等問(wèn)題，這就在一定程度E制約著P32蛋白開(kāi)發(fā)成亞單位疫苗的應(yīng)用前

23、景。因此在CPV中尋找到免疫原性更好、表達(dá)量更大、表達(dá)更穩(wěn)定的基因是十分重要的。5.2 CPV基因缺失疫苗CPV的宿主范圍專(zhuān)一，僅感染山羊、綿羊和牛這類(lèi)反芻動(dòng)物，因此更具有用作載體研制活載體疫苗的優(yōu)勢(shì)。使用基因工程技術(shù)去除CPV的毒力相關(guān)的特定基因或基因片段可進(jìn)-步獲得的缺失疫苗。目前大多數(shù)研究者都試圖通過(guò)缺失TK基因來(lái)實(shí)現(xiàn)。如王芳等構(gòu)建TK基因缺失重組病毒以為獲得能區(qū)分自然感染和疫苗免疫的基因工程標(biāo)記疫苗，郭巍等將LacZ基因表達(dá)盒插入TK基因缺失轉(zhuǎn)移載體篩選了TK基因缺失的GTP-VTY突變株。但是截至目前仍沒(méi)有正式使用CPV缺失疫苗進(jìn)行免疫預(yù)防CPV的報(bào)道。隨著分子生物學(xué)的發(fā)展，人們對(duì)C

24、PV的認(rèn)識(shí)逐漸深入。在基因組結(jié)構(gòu)與功能、基因定位和基因表達(dá)調(diào)控等方面的研究不斷取得進(jìn)展，這也將對(duì)研發(fā)更為有效安全的基因工程疫苗奠定基礎(chǔ)。6結(jié)論隨著分子生物學(xué)迅速發(fā)展，目前對(duì)CPV的研究已經(jīng)逐漸更為全面而深入。在以P32蛋白為研究熱點(diǎn)以外，展開(kāi)對(duì)CPV其他特異性強(qiáng)、表達(dá)量高的基因的深入研究2526.29.3。,將為更進(jìn)一步解析病毒的功能提供依據(jù)。CPV毒力相關(guān)基因和決定宿主范圍的基因的鑒定以及其特性的研究，將會(huì)為全面理解宿主與病原之間的相互作用，為獲得新的更有效更特異檢測(cè)診斷方法以及重組疫苗的研制提供新的途徑。而對(duì)羊痘病毒更多復(fù)制非必需片段的篩選及更為有效的CPV載體的構(gòu)建，也必將為反芻獸的傳染

25、病和其他動(dòng)物疾病的控制產(chǎn)生深遠(yuǎn)的影響。參考文獻(xiàn)：匚DialloA.ViljoenGJ.MercerAA.ctal.GenusPoxvirusescapripoxvirusM.Birkhauser.Basci,2007:167-181.2JDflmonfK.KnipeDM,HowleyPM.etnl.FiedsvirologyMJ.LippincottWilliams&Wilkins,Philadelphia,2007,2947-2975.3 BabiukS.BowdenTR,BoyleDB.ctal.Capripoxvirus：anemergingworldwidethreattosh

26、eep*goatandcattleJJ.TransboundWmergDis,2008,55：263-272.4 KitchingRP,CarnVM,Sheeppoxandgoatpox.OfficeInternationaldesEpizooties.Manualofdiagnostictestsandvaccinesforterrestrialanimnls(mammals,birdsandbees)M.()IE：Paris,2008：1282-1286.5 KitchingRP.CarnVM.Lumpyskindisease.OfficeInternationaldesEpizootic

27、s.Manualofdiagnostictestsandvaccinesforterrestrialanimals(mammals,birdsandbccs)M.OIE：Paris.2008:768-778.6jTimothyRB.ShawnI,B.GeoffRPetal.Capripoxvirustissuetropismandshedding：AquantitativestudyinexperimentallyinfectedsheepandgoatsJ.Virology.2008(371)：380-393.7JShawnB.GeoffPJohnC.ctal.Evaluationofano

28、vinetestiscellline(OA3.Ts)forpropagationofcapripoxvirusisolatesanddevelopmentofanimmunostainingtechniqueforviralplaquevisualization'J.VetDiagnInvest,2007.19:486-491.8 lialinskyCA.DelhonG.AfonsoCL.etal.SheeppoxvirusKelch-like«cneSPPV-019affectsvirusvirulenccfJ1.JVirol.2007.(81)20:11392-11401

29、.9 ChristianLG.CharlesEL.EmnaF,etal.CapripoxvirusG-proteincoupledchemokinereceptor,ahost-rangegenesuitableforvirus-animalorigindiscrimination!.J.JGenVirol*2009»90(8):1967-1977.10 HeineHG,StevensMP,FoordAJ,etal.AcapripoxvirusdetectionPCRandantibodyE1JSAbasedonthemajorantigenP32,thehomologoftheva

30、cciniavirusH3LgcncJ.ImmunolMethods,1999.227(1-2):187-196.11 ChandP,KitchingRP,BlackDN,etal.Westernblotanal-ysixofvirus-specificantibodyresponsestocapripoxvirusandcontagiouspustulardermatitisinfectionsinsheepJ.EpidemiolInfect,1994,113:377-385.12 熊毅，朱偉.,劉棋，等.山羊痘病毒P32基因跨膜區(qū)缺失載體的構(gòu)建與表達(dá)J.農(nóng)業(yè)生物技術(shù)學(xué)報(bào).2008.16(3

31、),385-389.13 陳軼15.本學(xué)齡.景志忠，等.羊痘病毒P32基因直核表達(dá)栽體的構(gòu)建、表達(dá)及其免疫原性J.病毒學(xué)報(bào),2008.24(2),133-137.14 王芳.陳洪巖.劉勝旺.等.山羊劾房毒疫帶株ORF64OKF67的分F特征J.中國(guó)預(yù)防普醫(yī)學(xué)報(bào),2007.29(2):96-102.15 AmanoH,UedaY.MiyamuraT,ctal.IdentificationandcharacterizationofthethymidinekinasegeneofYabavirusJ.JGenVirol.1995.76(5):1109-1115.16 HhanuprakashV,In

32、draniBK.HosamaniM,ctal.ThecurrentstatusofsheeppoxdiseaseJ.CompImmunolMicrobialInfectDis.2006,29(1)>27-60.17 郭fit.曲娟始，相文華，等.通用山羊痘耕毒TK基因缺失轉(zhuǎn)移栽體的構(gòu)建J.吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2008,30(5):739-742.18鄭敏.山羊痘病毒基因缺失毒株及DNA疫苗的構(gòu)建、要定和實(shí)驗(yàn)免疫D.吉林長(zhǎng)春：吉林大學(xué)，2008.19 ManganaVO.VougioukaO.MarkoulatosP.ctal.SheeppoxvirusidentificationbyPCR

33、incellculturesJ.JVirolMethods.1999.77,75-79.20 MarkoulatosP,ManganaV(),KoptopoulosG,etal.Detectionofsheeppoxvirusinskinbiopsysamplesbyamultiplcxpolymerasechainreaction.J.VirolMethods.2000.84(2)t161-166.21 徐春志，周珥君.岳筠.等.山羊痘制毒反向末端重矍序列的克降與序列分析口.備牧與獸醫(yī).2007.39(07),1)-13.22J王開(kāi)功，岳筠.徐春志等.山羊痕病毒1TR基因片段的克隆與序列分析

34、J.中國(guó)頊防件慶學(xué)報(bào)，2OO8.3O(7)：519-522.23 羅阿東，唐源.文明.等.山羊痘病毒SYBRGreen熒光PCR檢測(cè)方法的建立J.山地農(nóng)業(yè)生物學(xué)報(bào).2008.27(6)：503-507.24 BalamuruganV.JayappaKD«HosamaniM,ctal.Comparativeefficacyofconventionalandtaqmanpolymerasechainreactionassaysinthedetectionofcapripoxvirusesfromclinicalsamples。.JVetDiagnInvest.2009.21(2)：225

35、-231.L25BowdenTR,CouparBE,BabiukSL.etal.Detectionofantibodiesspecificforshccppoxandgoatpoxvirusesusingrecombinantcapripoxvirusantigensinanindirectenzyme-linkedimmunosorbentassayj.JVirolMethod,2009,161(1)：19-29.26 BabiukS.WallaceDB.SmithSJ.etal.Detectionofantibodiesagainstcapri|x)xvirusesusinganinact

36、ivatedshccppoxvirusELISAJ.TransboundEmergDis.2009,56(4)：132-14】.27 CarnVM,KitchingRP,HammondJM.etal.UseofarecombinantantigeninanindirectELISAfordetectingbovineantibodytocapripoxvirusJ.VirolMethods.1994»49：285-294.28 王芳，劉勝旺,邵翌旻，等.山羊痘基因工程標(biāo)記疫苗的初步研究J.中國(guó)比較醫(yī)學(xué)雜志,2007,17(8),S15.29 王曉霰.部亞?wèn)|，駱學(xué)衣，等.綿羊拉病毒甘肅流行株慵蛋白基因ORF117的克隆及其原核表達(dá)J.中國(guó)防獸醫(yī)學(xué)報(bào)，2009,3】(5)：33734】.30 陳扶微,才學(xué)麟，鄭