ELISPOT標(biāo)準(zhǔn)化

1、DAKEWE BIOTECH COMPANY Ltd.酶聯(lián)免疫斑點(diǎn)及其標(biāo)準(zhǔn)化酶聯(lián)免疫斑點(diǎn)及其標(biāo)準(zhǔn)化E Enzyme nzyme L Linked inked I ImmunommunoSPOTSPOT達(dá)科為生物技術(shù)有限公司達(dá)科為生物技術(shù)有限公司朱義鑫朱義鑫2005.9.16Elispot實(shí)驗(yàn)結(jié)果（透明板）實(shí)驗(yàn)結(jié)果（透明板）U-Cytech 公司公司 Elispot實(shí)驗(yàn)結(jié)果（實(shí)驗(yàn)結(jié)果（PVDF板）板）U-Cytech 公司公司達(dá)科為生物達(dá)科為生物DAKEWE BIOTECH COMPANY Ltd.v ELISPOTELISPOT技術(shù)起源與發(fā)展技術(shù)起源與發(fā)展v 細(xì)胞與細(xì)胞因子細(xì)胞與細(xì)胞因子v E

2、LISPOTELISPOT技術(shù)原理技術(shù)原理v ELISPOT ELISPOT 和和 ELISAELISA的區(qū)別的區(qū)別v ELISPOTELISPOT的優(yōu)點(diǎn)的優(yōu)點(diǎn)第一部分：前言第一部分：前言達(dá)科為生物達(dá)科為生物DAKEWE BIOTECH COMPANY Ltd.19831983年年, Czerkinsky&Sedgwick , Czerkinsky&Sedgwick ：計(jì)數(shù)分泌抗體的：計(jì)數(shù)分泌抗體的 B B 細(xì)胞；細(xì)胞；19851985年，年，MoreMore：NCNC板，改進(jìn)顯色底物，不再需要瓊脂糖凝膠板，改進(jìn)顯色底物，不再需要瓊脂糖凝膠; ;19881988年，年，Czer

3、kinsky et.al.: Czerkinsky et.al.: 首次將應(yīng)用擴(kuò)展到細(xì)胞因子檢測領(lǐng)首次將應(yīng)用擴(kuò)展到細(xì)胞因子檢測領(lǐng)域，域，T cell IFN-; ; 同年業(yè)發(fā)展出雙色標(biāo)記技術(shù)；同年業(yè)發(fā)展出雙色標(biāo)記技術(shù)；19931993年，年，Shaw et.al.: Shaw et.al.: 首次將首次將PVDFPVDF膜板引入膜板引入ELISPOTELISPOT19971997年，年，Gui et.al.Gui et.al.：發(fā)展出計(jì)算機(jī)輔助的斑點(diǎn)技術(shù)技術(shù)。：發(fā)展出計(jì)算機(jī)輔助的斑點(diǎn)技術(shù)技術(shù)。1.ELISPOT1.ELISPOT技術(shù)起源與發(fā)展技術(shù)起源與發(fā)展達(dá)科為生物達(dá)科為生物DAKEWE BI

4、OTECH COMPANY Ltd.T T細(xì)胞在免疫系統(tǒng)中起著關(guān)鍵性的作用，尤其是起免疫調(diào)節(jié)細(xì)胞在免疫系統(tǒng)中起著關(guān)鍵性的作用，尤其是起免疫調(diào)節(jié)作用的輔助細(xì)胞作用的輔助細(xì)胞ThTh。它們參與了細(xì)胞免疫。它們參與了細(xì)胞免疫(Th1)(Th1)和體液免疫和體液免疫(Th2)(Th2)抗原或者有絲分裂原刺激抗原或者有絲分裂原刺激T T細(xì)胞、單核細(xì)胞、單核/ /巨噬細(xì)胞分泌細(xì)胞因巨噬細(xì)胞分泌細(xì)胞因子子 Th1 cells IFN-,IL-2 Th2 cells IL-4, IL-5, IL-6, IL-9, IL-10, IL-13 Tc cells IFN-, TNF-, 顆粒酶顆粒酶B，穿孔素，穿孔

5、素 單核單核/ /巨噬細(xì)胞巨噬細(xì)胞 TNF-a, IL-1b, IL-6, IL-10, IL-12 細(xì)胞因子的分泌以及對效應(yīng)細(xì)胞的調(diào)節(jié)構(gòu)成了一個(gè)精確的免細(xì)胞因子的分泌以及對效應(yīng)細(xì)胞的調(diào)節(jié)構(gòu)成了一個(gè)精確的免疫系統(tǒng)調(diào)節(jié)網(wǎng)絡(luò)。疫系統(tǒng)調(diào)節(jié)網(wǎng)絡(luò)。2.2.細(xì)胞與細(xì)胞因子細(xì)胞與細(xì)胞因子達(dá)科為生物達(dá)科為生物DAKEWE BIOTECH COMPANY Ltd.用抗體捕獲培養(yǎng)中的細(xì)胞分泌的細(xì)胞因子，并以斑點(diǎn)顯色的方式將其表現(xiàn)出來。3.ELISPOT3.ELISPOT技術(shù)原理技術(shù)原理達(dá)科為生物達(dá)科為生物DAKEWE BIOTECH COMPANY Ltd.4.ELISPOT 4.ELISPOT 和和 ELISA

6、ELISA的區(qū)別的區(qū)別ELISPOT ELISPOT 法源自法源自 ELISA ELISA ，又突破傳統(tǒng)，又突破傳統(tǒng) ELISA ELISA 法，法，是定量是定量 ELISA ELISA 技術(shù)的延伸和新的發(fā)展。兩者都可檢測技術(shù)的延伸和新的發(fā)展。兩者都可檢測細(xì)胞產(chǎn)生的細(xì)胞因子或其他可溶性蛋白，它們最大的細(xì)胞產(chǎn)生的細(xì)胞因子或其他可溶性蛋白，它們最大的不同不同: :n ELISAELISA測定的是測定的是蛋白濃度蛋白濃度，ELISPOTELISPOT測定的是測定的是細(xì)胞頻率細(xì)胞頻率；（整體水平與單細(xì)胞水平）（整體水平與單細(xì)胞水平）n ELISAELISA是是免疫檢測免疫檢測ImmunoImmuno-

7、Assay-Assay，而而ELISPOTELISPOT是是生物生物檢測檢測Bio-AssayBio-Assay（活細(xì)胞，功能檢測）活細(xì)胞，功能檢測）n ELISAELISA檢測的特異性表現(xiàn)在檢測的特異性表現(xiàn)在抗體抗體上，上，ELISPOTELISPOT檢測的特檢測的特異性及表現(xiàn)在雙重的異性及表現(xiàn)在雙重的刺激源刺激源和和抗體抗體上。上。達(dá)科為生物達(dá)科為生物DAKEWE BIOTECH COMPANY Ltd.5.ELISPOT5.ELISPOT的優(yōu)點(diǎn)的優(yōu)點(diǎn) 目前，檢測細(xì)胞因子或者細(xì)胞免疫反應(yīng)的方法有以下目前，檢測細(xì)胞因子或者細(xì)胞免疫反應(yīng)的方法有以下幾種：幾種：ELISAELISA、ELISPO

8、TELISPOT、FACSFACS、TetramerTetramer、3 3H H胸苷胸苷參入法、參入法、5151CrCr釋放法。釋放法。 n高靈敏高靈敏：度少至：度少至1001001,0001,000個(gè)分子個(gè)分子/ /CellCell即能夠被檢測。比即能夠被檢測。比ELISAELISA的的靈敏度高靈敏度高200200倍。倍。n單細(xì)胞水平單細(xì)胞水平：即使只有一個(gè)陽性細(xì)胞也能夠檢測出來，比：即使只有一個(gè)陽性細(xì)胞也能夠檢測出來，比FACSFACS靈敏。靈敏。n高通量高通量：每個(gè)研究人員每天可作數(shù)百樣本的檢測。：每個(gè)研究人員每天可作數(shù)百樣本的檢測。High Throughput High Throu

9、ghput ScreeningScreening達(dá)科為生物達(dá)科為生物DAKEWE BIOTECH COMPANY Ltd.在在10106 6抗原呈遞細(xì)胞（抗原呈遞細(xì)胞（APCAPC）中混入已知數(shù)量的）中混入已知數(shù)量的IFN-IFN-陽性陽性T T淋巴細(xì)胞，然后用三種方法分別進(jìn)行檢測。淋巴細(xì)胞，然后用三種方法分別進(jìn)行檢測。X X坐標(biāo)：各檢測方法的檢測結(jié)果坐標(biāo)：各檢測方法的檢測結(jié)果 Y Y坐標(biāo)：每百萬坐標(biāo)：每百萬APCAPC中實(shí)際中實(shí)際IFN-IFN-+ +T T細(xì)胞數(shù)量細(xì)胞數(shù)量ELISPOT/FACS/ELISAELISPOT/FACS/ELISA檢測精確度比較ELISPOT ELISPOT 流

10、式熒光染色流式熒光染色 ELISAELISA達(dá)科為生物達(dá)科為生物DAKEWE BIOTECH COMPANY Ltd.第二部分：技術(shù)特點(diǎn)第二部分：技術(shù)特點(diǎn)n技術(shù)操作流程技術(shù)操作流程nELISPOTELISPOT技術(shù)要點(diǎn)技術(shù)要點(diǎn)n塑料板與膜板塑料板與膜板n膜結(jié)構(gòu)與抗體包被膜結(jié)構(gòu)與抗體包被n細(xì)胞處理細(xì)胞處理n有血清與無血清有血清與無血清n刺激物選擇刺激物選擇n建立陽性對照建立陽性對照n調(diào)整適當(dāng)?shù)募?xì)胞濃度調(diào)整適當(dāng)?shù)募?xì)胞濃度n預(yù)培養(yǎng)法與直接法預(yù)培養(yǎng)法與直接法n各種染色系統(tǒng)各種染色系統(tǒng)達(dá)科為生物達(dá)科為生物DAKEWE BIOTECH COMPANY Ltd.v包被抗體包被抗體 4 4 過夜，洗滌；過夜，

11、洗滌；v封閉封閉37 1h37 1h；v加入淋巴細(xì)胞和刺激原加入淋巴細(xì)胞和刺激原37 37 孵育孵育8-40h8-40h；v冰水裂解并移出細(xì)胞，洗滌；冰水裂解并移出細(xì)胞，洗滌；v加入生物素標(biāo)記的檢測抗體加入生物素標(biāo)記的檢測抗體37 1h37 1h，洗滌；，洗滌；v加入酶聯(lián)親和素加入酶聯(lián)親和素37 1h37 1h，洗滌；洗滌；v加入顯色底物，顯色加入顯色底物，顯色1040min1040min；v獲得斑點(diǎn)，計(jì)數(shù)。獲得斑點(diǎn)，計(jì)數(shù)。1，23456781. ELISPOT1. ELISPOT一般操作流程一般操作流程達(dá)科為生物達(dá)科為生物DAKEWE BIOTECH COMPANY Ltd.2. ELISP

12、OT2. ELISPOT技術(shù)要點(diǎn)技術(shù)要點(diǎn)u細(xì)胞培養(yǎng)和培養(yǎng)前階段無菌操作，避免污染細(xì)胞培養(yǎng)和培養(yǎng)前階段無菌操作，避免污染u細(xì)胞在細(xì)胞在ELISPOT板上孵育時(shí)要避免震動(dòng)，包括開關(guān)板上孵育時(shí)要避免震動(dòng)，包括開關(guān)CO2孵箱孵箱u洗滌要充分，尤其是裂解細(xì)胞之后的洗滌洗滌要充分，尤其是裂解細(xì)胞之后的洗滌u洗滌時(shí)，槍頭不能接觸到膜，從孔中移出液體采用傾洗滌時(shí)，槍頭不能接觸到膜，從孔中移出液體采用傾倒的方式倒的方式u洗滌最后一次要用高質(zhì)量的吸水紙拍干洗滌最后一次要用高質(zhì)量的吸水紙拍干達(dá)科為生物達(dá)科為生物DAKEWE BIOTECH COMPANY Ltd.塑料板：塑料板：U-cytechU-cytech公司

13、特有的透明版公司特有的透明版操作簡單，方便，省時(shí)，價(jià)廉，適于初學(xué)者以及科學(xué)研究。操作簡單，方便，省時(shí)，價(jià)廉，適于初學(xué)者以及科學(xué)研究。膜板：膜板：PVDFPVDF膜板、膜板、NCNC膜板膜板操作復(fù)雜，但是斑點(diǎn)漂亮，適合有經(jīng)驗(yàn)的實(shí)驗(yàn)者。操作復(fù)雜，但是斑點(diǎn)漂亮，適合有經(jīng)驗(yàn)的實(shí)驗(yàn)者。3.3.塑料板與膜板塑料板與膜板達(dá)科為生物達(dá)科為生物DAKEWE BIOTECH COMPANY Ltd.塑料板：塑料板：U-cytech公司特有的透明版公司特有的透明版優(yōu)點(diǎn)：優(yōu)點(diǎn)：v透明全塑料板，易于操作，可以隨時(shí)觀察細(xì)胞；透明全塑料板，易于操作，可以隨時(shí)觀察細(xì)胞；v可以快速包被，節(jié)省實(shí)驗(yàn)時(shí)間；可以快速包被，節(jié)省實(shí)驗(yàn)時(shí)間

14、；v可回收細(xì)胞和上清；可回收細(xì)胞和上清；v價(jià)格只有價(jià)格只有PVDFPVDF膜板的一半。膜板的一半。缺點(diǎn)：缺點(diǎn)：v吸附能力比膜差，斑點(diǎn)松散，易受粒細(xì)胞的分解；吸附能力比膜差，斑點(diǎn)松散，易受粒細(xì)胞的分解；v裸視下斑點(diǎn)為灰白色，不如有顏色斑點(diǎn)明顯；裸視下斑點(diǎn)為灰白色，不如有顏色斑點(diǎn)明顯；v只有一種染色系統(tǒng)，不能用于多色分析。只有一種染色系統(tǒng)，不能用于多色分析。修飾的修飾的HRP/銀銀染系統(tǒng)染系統(tǒng)達(dá)科為生物達(dá)科為生物DAKEWE BIOTECH COMPANY Ltd.膜板：膜板：PVDFPVDF膜，膜， NCNC膜膜優(yōu)點(diǎn)：優(yōu)點(diǎn)：FPVDFPVDF膜的吸附能力更強(qiáng)，斑點(diǎn)致密、圓潤；膜的吸附能力更強(qiáng)，斑

15、點(diǎn)致密、圓潤；F斑點(diǎn)顏色鮮艷，易于判讀；斑點(diǎn)顏色鮮艷，易于判讀；F能用于多色能用于多色ELISPOTELISPOT實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)。缺點(diǎn)：缺點(diǎn)：F需酒精預(yù)濕等步驟，操作稍復(fù)雜；需酒精預(yù)濕等步驟，操作稍復(fù)雜；F因?yàn)槟さ臐B漏問題，在洗滌步驟稍復(fù)雜；因?yàn)槟さ臐B漏問題，在洗滌步驟稍復(fù)雜；F幾乎不可能回收細(xì)胞和上清；幾乎不可能回收細(xì)胞和上清；F膜的脆弱性，實(shí)驗(yàn)中的操作與保存更困難。膜的脆弱性，實(shí)驗(yàn)中的操作與保存更困難。HRP/DABAP/BCIP&NBTHRP/AEC達(dá)科為生物達(dá)科為生物DAKEWE BIOTECH COMPANY Ltd.IFN- IL-5IL-10IFN- PMA/ ionomyc

16、in2x105 hu-PBMCindirectLPS/ IFN- 2.5x104 hu-PBMCdirectICE Peptide Pool2x105 hu-PBMCindirectPVDFPVDF板、透明板的典型斑點(diǎn)圖像板、透明板的典型斑點(diǎn)圖像達(dá)科為生物達(dá)科為生物DAKEWE BIOTECH COMPANY Ltd.4. 4. 膜結(jié)構(gòu)和抗體包被膜結(jié)構(gòu)和抗體包被n通常的包被條件是4過夜，也可以室溫2小時(shí)n37 包被不能超過1小時(shí)，否則包被效率急劇降低n膜吸附能力遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過包被抗體的量，所以需要封閉n包被后必須接著封閉，否則包被抗體會(huì)逐漸失活n封閉之后用純水或PBS洗滌，可以在4長期存儲(chǔ)關(guān)于膜的一

17、些參數(shù)（單孔面積）關(guān)于膜的一些參數(shù)（單孔面積）厚度：厚度：120-150um最大蛋白吸附量：最大蛋白吸附量： 80-100 ugELISPOT所需量：所需量：1 ug包被抗體集中于膜表面包被抗體集中于膜表面1um(透明板容納量為：透明板容納量為：30-40 ug)達(dá)科為生物達(dá)科為生物DAKEWE BIOTECH COMPANY Ltd. 從外周血提取淋巴細(xì)胞時(shí)從外周血提取淋巴細(xì)胞時(shí), , 應(yīng)避免凝血引起的細(xì)胞活應(yīng)避免凝血引起的細(xì)胞活性降低；血液越新鮮越好，全血不應(yīng)該存放超過性降低；血液越新鮮越好，全血不應(yīng)該存放超過6 6小小時(shí)。時(shí)。 只能采用淋巴細(xì)胞提取液分離。提取淋巴細(xì)胞時(shí)應(yīng)盡只能采用淋巴細(xì)

18、胞提取液分離。提取淋巴細(xì)胞時(shí)應(yīng)盡量去除紅細(xì)胞、粒細(xì)胞和雜質(zhì)的干擾量去除紅細(xì)胞、粒細(xì)胞和雜質(zhì)的干擾 從小鼠的脾臟取淋巴細(xì)胞時(shí)，尤其要注意，加入從小鼠的脾臟取淋巴細(xì)胞時(shí)，尤其要注意，加入ELISPOTELISPOT培養(yǎng)孔的細(xì)胞須為單細(xì)胞懸液培養(yǎng)孔的細(xì)胞須為單細(xì)胞懸液 預(yù)培養(yǎng)的淋巴細(xì)胞若有壞死預(yù)培養(yǎng)的淋巴細(xì)胞若有壞死/ /凋亡（培養(yǎng)液變黃）會(huì)凋亡（培養(yǎng)液變黃）會(huì)影響斑點(diǎn)的形成影響斑點(diǎn)的形成 預(yù)培養(yǎng)后的細(xì)胞入預(yù)培養(yǎng)后的細(xì)胞入ELISPOTELISPOT培養(yǎng)板前應(yīng)更換培養(yǎng)液培養(yǎng)板前應(yīng)更換培養(yǎng)液ELISPOT實(shí)驗(yàn)的難點(diǎn)在于細(xì)胞處理與培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)的難點(diǎn)在于細(xì)胞處理與培養(yǎng)5. 5. 細(xì)胞處理細(xì)胞處理 達(dá)科為生物達(dá)

19、科為生物DAKEWE BIOTECH COMPANY Ltd.6. 6. 有血清與無血清有血清與無血清u血清是細(xì)胞培養(yǎng)所必需的添血清是細(xì)胞培養(yǎng)所必需的添加品加品 ，ELISPOT有細(xì)胞培養(yǎng)有細(xì)胞培養(yǎng)的過程，所以需要血清的過程，所以需要血清u但是血清批次間差異大、成但是血清批次間差異大、成分未可知，為分未可知，為ELISPOT增加增加了嚴(yán)重的不確定性因素。有些了嚴(yán)重的不確定性因素。有些批次的血清嚴(yán)重干擾試驗(yàn)結(jié)果。批次的血清嚴(yán)重干擾試驗(yàn)結(jié)果。u無血清培養(yǎng)法已經(jīng)成熟，其無血清培養(yǎng)法已經(jīng)成熟，其優(yōu)點(diǎn)：優(yōu)點(diǎn)：成分固定，徹底消除了批次間的差異，結(jié)果可以在全世界的試驗(yàn)室之間比較。不含雜蛋白，背景更弱，斑點(diǎn)更

20、清晰。不含抑制細(xì)胞因子分泌成分，斑點(diǎn)更多，更加反映真實(shí)的結(jié)果。u目前只能用于直接法，間接目前只能用于直接法，間接法孵育時(shí)間過長，細(xì)胞生長受法孵育時(shí)間過長，細(xì)胞生長受影響，結(jié)果不理想。影響，結(jié)果不理想。119 SFC267 SFC我們自己的試驗(yàn)結(jié)果：我們自己的試驗(yàn)結(jié)果：PHA/10,000 Hu-PBMC上：上：5%小牛血清（杭州）下：無血清培養(yǎng)基小牛血清（杭州）下：無血清培養(yǎng)基U-cytech)達(dá)科為生物達(dá)科為生物DAKEWE BIOTECH COMPANY Ltd.n非特異性刺激物非特異性刺激物有絲分裂原有絲分裂原 ConAConA，PMAPMA，PHAPHA，IonomycinIonomy

21、cinn特異性刺激物特異性刺激物重組蛋白重組蛋白病毒載體或者病毒顆粒病毒載體或者病毒顆粒重疊肽段重疊肽段表位肽表位肽注意：注意：u直接在直接在ELISPOTELISPOT培養(yǎng)可能會(huì)因沒有足夠的刺激強(qiáng)度而導(dǎo)致斑點(diǎn)數(shù)少。培養(yǎng)可能會(huì)因沒有足夠的刺激強(qiáng)度而導(dǎo)致斑點(diǎn)數(shù)少。此時(shí)可以采用預(yù)培養(yǎng)法。此時(shí)可以采用預(yù)培養(yǎng)法。u部分多價(jià)抗原刺激物導(dǎo)致細(xì)胞凋亡，可以換用單價(jià)抗原刺激物。部分多價(jià)抗原刺激物導(dǎo)致細(xì)胞凋亡，可以換用單價(jià)抗原刺激物。u核酸、激素等抗原刺激物的免疫原性較弱，應(yīng)該加強(qiáng)刺激濃度、輔助核酸、激素等抗原刺激物的免疫原性較弱，應(yīng)該加強(qiáng)刺激濃度、輔助刺激物、延長刺激時(shí)間等。刺激物、延長刺激時(shí)間等。7. 7.

22、 刺激物選擇刺激物選擇達(dá)科為生物達(dá)科為生物DAKEWE BIOTECH COMPANY Ltd.8.8.建立陽性對照建立陽性對照n非特異性刺激陽性對照：非特異性刺激陽性對照：ConA 伴刀豆蛋白伴刀豆蛋白A 0.4-1.0ug/wellPHA 植物血球凝集素植物血球凝集素 0.3-1.0ug/wellIonomycin 伊諾霉素伊諾霉素 50-100ng/wellPMA 14烷酰佛波乙酯烷酰佛波乙酯 5.0-10ng/welln特異性陽性刺激原：國際標(biāo)準(zhǔn)多肽池特異性陽性刺激原：國際標(biāo)準(zhǔn)多肽池CEF CEF C CMVMV， E EBVBV， ininf fluenza virusluenza

23、virus在在PBMCPBMC的的IFN- ELISPOT IFN- ELISPOT 分析中：分析中：自發(fā)斑點(diǎn)頻率自發(fā)斑點(diǎn)頻率：1050/百萬PBMC細(xì)胞；(十萬分之一）PHAPHA刺激頻率刺激頻率：104105/百萬PBMC細(xì)胞；（百分之一）CEFCEF刺激頻率刺激頻率：500 5000 /百萬PBMC細(xì)胞（千分之一）達(dá)科為生物達(dá)科為生物DAKEWE BIOTECH COMPANY Ltd.陽性對照實(shí)例陽性對照實(shí)例未未 刺刺 激激40SFC/百萬百萬PBMCCEF 刺刺 激激3，400SFC/百萬百萬PBMCPHA 刺刺 激激26，000SFC/百萬百萬PBMC人PBMC40萬/孔U-cyt

24、ech無血清培養(yǎng)基人PBMC1萬/孔U-cytech無血清培養(yǎng)基人PBMC5萬/孔U-cytech無血清培養(yǎng)基4265177達(dá)科為生物達(dá)科為生物DAKEWE BIOTECH COMPANY Ltd.9.9.調(diào)整適當(dāng)?shù)募?xì)胞濃度調(diào)整適當(dāng)?shù)募?xì)胞濃度 1244 692 355 192n20-4020-40萬萬/ /孔形成最大密度的單層細(xì)胞孔形成最大密度的單層細(xì)胞n根據(jù)所使用刺激原作初步調(diào)整根據(jù)所使用刺激原作初步調(diào)整ConAConA PHA PMA PHA PMA ：0.5-50.5-5萬萬/ /孔孔特異性刺激物：特異性刺激物：5-405-40萬萬/ /孔孔n根據(jù)預(yù)實(shí)驗(yàn)的斑點(diǎn)數(shù)目作精細(xì)調(diào)整根據(jù)預(yù)實(shí)驗(yàn)的斑

25、點(diǎn)數(shù)目作精細(xì)調(diào)整人人PBMC/CEF刺激刺激 U-cytech無血清培養(yǎng)基無血清培養(yǎng)基達(dá)科為生物達(dá)科為生物DAKEWE BIOTECH COMPANY Ltd.10. 10. 預(yù)培養(yǎng)法與直接法預(yù)培養(yǎng)法與直接法p 預(yù)培養(yǎng)法即：預(yù)先將細(xì)胞和刺激物加入預(yù)培養(yǎng)法即：預(yù)先將細(xì)胞和刺激物加入2424孔板中作孔板中作預(yù)孵育和刺激，然后再加入預(yù)孵育和刺激，然后再加入ELISPOTELISPOT板進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。板進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。p 大多數(shù)大多數(shù)ELISPOTELISPOT實(shí)驗(yàn)都可以用直接實(shí)驗(yàn)都可以用直接ELISPOTELISPOT法得法得到可接受的結(jié)果。到可接受的結(jié)果。p 預(yù)孵育的優(yōu)點(diǎn)：預(yù)孵育的優(yōu)點(diǎn)：經(jīng)過預(yù)孵育，斑點(diǎn)更分

26、散，清晰經(jīng)過預(yù)孵育，斑點(diǎn)更分散，清晰可以除去貼壁的巨噬細(xì)胞，從而減少小斑點(diǎn)的影響；粒細(xì)胞可以除去貼壁的巨噬細(xì)胞，從而減少小斑點(diǎn)的影響；粒細(xì)胞的影響（蟲啃）也可以大大減輕的影響（蟲啃）也可以大大減輕某些細(xì)胞因子通常很難用直接法得到結(jié)果某些細(xì)胞因子通常很難用直接法得到結(jié)果，比如顆粒酶、顆粒酶、IL-IL-1010p 預(yù)孵育的缺點(diǎn)：預(yù)孵育的缺點(diǎn)：需要長時(shí)間孵育刺激，更為嚴(yán)格的無菌操作環(huán)境需要長時(shí)間孵育刺激，更為嚴(yán)格的無菌操作環(huán)境需耗費(fèi)額外的物資和時(shí)間需耗費(fèi)額外的物資和時(shí)間達(dá)科為生物達(dá)科為生物DAKEWE BIOTECH COMPANY Ltd.直接法直接法PVDFPVDF刺激物：ICE Peptid

27、e Pool40 Hours,2 X 105 Cell/ Well預(yù)孵育法預(yù)孵育法PVDFPVDF刺激物：ICE Peptide Pool24+16 Hours,2 X 105 Cell/ WellIFN-IFN-直接法與預(yù)培養(yǎng)法比較直接法與預(yù)培養(yǎng)法比較達(dá)科為生物達(dá)科為生物DAKEWE BIOTECH COMPANY Ltd.直接法直接法PVDFPVDF刺激物：破傷風(fēng)桿菌40Hours, 2X105Cell/Well預(yù)孵育法預(yù)孵育法PVDFPVDF刺激物：破傷風(fēng)桿菌24+16 Hours, 2X105Cell/WellIL-10IL-10直接法與預(yù)培養(yǎng)法比較直接法與預(yù)培養(yǎng)法比較達(dá)科為生物達(dá)科為

28、生物DAKEWE BIOTECH COMPANY Ltd.11.11.各種染色系統(tǒng)各種染色系統(tǒng)修飾的修飾的HRP/銀染系統(tǒng)銀染系統(tǒng)HRP/AECAP/BCIP&NBTHRP/DAB透明板：只有一種修飾的透明板：只有一種修飾的HRP/HRP/銀染系統(tǒng)，白色不透明斑點(diǎn)。銀染系統(tǒng)，白色不透明斑點(diǎn)。PVDFPVDF板：兩種標(biāo)記酶板：兩種標(biāo)記酶 辣根過氧化物酶辣根過氧化物酶HRP-HRP-顯色快，但是背景高顯色快，但是背景高(30min)(30min)AECAEC底物，顏色鮮艷，但易退色底物，顏色鮮艷，但易退色DABDAB底物，棕色斑點(diǎn)，著色稍牢固，但是板點(diǎn)松散底物，棕色斑點(diǎn)，著色稍牢固，但是板

29、點(diǎn)松散堿性磷酸酶堿性磷酸酶AP-AP-顯色慢，但是背景干凈顯色慢，但是背景干凈(2h)(2h)BCIP&NBTBCIP&NBT混合底物，藍(lán)黑色，著色牢固混合底物，藍(lán)黑色，著色牢固達(dá)科為生物達(dá)科為生物DAKEWE BIOTECH COMPANY Ltd.第三部分：第三部分：ELISPOTELISPOT標(biāo)準(zhǔn)化標(biāo)準(zhǔn)化 標(biāo)準(zhǔn)化的概念標(biāo)準(zhǔn)化的概念 標(biāo)準(zhǔn)化的實(shí)驗(yàn)室管理標(biāo)準(zhǔn)化的實(shí)驗(yàn)室管理 標(biāo)準(zhǔn)化的實(shí)驗(yàn)操作標(biāo)準(zhǔn)化的實(shí)驗(yàn)操作( (SOP)SOP) 標(biāo)準(zhǔn)化的質(zhì)控參比標(biāo)準(zhǔn)化的質(zhì)控參比達(dá)科為生物達(dá)科為生物DAKEWE BIOTECH COMPANY Ltd.標(biāo)準(zhǔn)化的概念ELISPOT標(biāo)準(zhǔn)標(biāo)準(zhǔn)化是一套完

30、整的系統(tǒng)：標(biāo)準(zhǔn)化的實(shí)驗(yàn)室管理標(biāo)準(zhǔn)化的實(shí)驗(yàn)室管理美國建立了Good Laboratory Practices GLP規(guī)范標(biāo)準(zhǔn)化的實(shí)驗(yàn)操作標(biāo)準(zhǔn)化的實(shí)驗(yàn)操作達(dá)科為提供ELISPOT標(biāo)準(zhǔn)化的操作程序SOP標(biāo)準(zhǔn)化的質(zhì)控系統(tǒng)標(biāo)準(zhǔn)化的質(zhì)控系統(tǒng)質(zhì)控細(xì)胞質(zhì)控細(xì)胞質(zhì)控陽性刺激物質(zhì)控陽性刺激物人員培訓(xùn)人員培訓(xùn)質(zhì)控質(zhì)控ELISPOT操作操作只有所有的實(shí)驗(yàn)室管理都遵循標(biāo)準(zhǔn)化這種規(guī)范，所有的實(shí)驗(yàn)操作都遵循標(biāo)準(zhǔn)化的這套標(biāo)準(zhǔn)，質(zhì)控系統(tǒng)才能正常運(yùn)作，ELISPOT標(biāo)準(zhǔn)化才能真正建立起來。達(dá)科為生物達(dá)科為生物DAKEWE BIOTECH COMPANY Ltd.標(biāo)準(zhǔn)化的操作標(biāo)準(zhǔn)化的操作(SOP)(SOP)n儀器儀器n耗材耗材n試劑試劑n人員人員n操作流程操作流程采血采血分離分離凍存凍存復(fù)蘇復(fù)蘇ELISPOTELISPOT程序程序數(shù)據(jù)分析、處理數(shù)據(jù)分析、處理達(dá)科為生物達(dá)科為生物DAKEWE BIOTECH COMPANY Ltd.儀器儀器n離心機(jī)離心機(jī)專業(yè)的細(xì)胞離心機(jī)，指示準(zhǔn)確，轉(zhuǎn)速平穩(wěn)，不晃動(dòng)，啟動(dòng)制動(dòng)平穩(wěn)，最好能控制溫度。否則會(huì)損失細(xì)胞或者傷害細(xì)胞。n電動(dòng)移液器電動(dòng)移液器有較好的手感，能靠按壓的力度的變化靈敏的調(diào)節(jié)流速。n單道槍和多道槍單道槍和多道槍度量準(zhǔn)確，潤滑良好，否則會(huì)增加污染的機(jī)會(huì)。達(dá)科為生物達(dá)科為生物DAKEWE BIOTECH COMPANY