人胸腺基質(zhì)淋巴細胞生成素(TSLP)酶聯(lián)免疫分析

1、人胸腺基質(zhì)淋巴細胞生成素(TSLP)酶聯(lián)免疫分析試劑盒使用說明書本試劑盒僅供研究使用產(chǎn)品編號：E1320h預期應用ELISA法定量測定人血清、血漿、細胞培養(yǎng)物上清或其它相關(guān)液體中胸腺基質(zhì)淋巴細胞生成素(TSLP)含量。實驗原理本試劑盒應用雙抗體夾心酶標免疫分析法測定標本中TSLP水平。用純化的抗體包被微孔板，制成固相抗體，往包被單抗的微孔中依次加入TSLP、生物素化的抗人TSLP抗體、HRP標記的親和素，經(jīng)過徹底洗滌后用底物TMB顯色。TMB在過氧化物酶的催化下轉(zhuǎn)化成藍色，并在酸的作用下轉(zhuǎn)化成最終的黃色。顏色的深淺和樣品中的TSLP呈正相關(guān)。用酶標儀在450nm波長下測定吸光度（OD值），計算

2、樣品濃度。 試劑盒組成及試劑配制 1. 酶聯(lián)板：一塊（96孔） 2. 標準品（凍干品）：2瓶，每瓶臨用前以樣品稀釋液稀釋至1ml，蓋好后靜置10分鐘以上，然后反復顛倒/搓動以助溶解，其濃度為20 ng/mL，做系列倍比稀釋后，分別稀釋成10 ng/mL，5 ng/mL，2.5 ng/mL，1.25 ng/mL，0.625 ng/mL，0.312 ng/mL，0.156 ng/mL，其原液直接作為最高標準濃度，樣品稀釋液直接作為標準濃度0 ng/mL，臨用前15分鐘內(nèi)配制。如配制20 ng/mL標準品：取0.5ml 10 ng/mL的上述標準品加入含有0.5ml樣品稀釋液的Eppendorf管中

3、，混勻即可，其余濃度以此類推。3. 樣品稀釋液：1×20ml/瓶。4. 檢測稀釋液A：1×10ml/瓶。5. 檢測稀釋液B：1×10ml/瓶。6. 檢測溶液A：1×120ul/瓶（1：100）臨用前以檢測稀釋液A 1：100稀釋，稀釋前根據(jù)預先計算好的每次實驗所需的總量配制（每孔100ul），實際配制時應多配制0.1-0.2ml。如1ul檢測溶液A加99ul檢測稀釋液A的比例配制，輕輕混勻，在使用前一小時內(nèi)配制。7. 檢測溶液B：1×120ul/瓶（1：100）臨用前以檢測稀釋液B1：100稀釋。稀釋方法同檢測溶液A。8. 底物溶液：1

4、5;10ml/瓶。 9. 濃洗滌液：1×30ml/瓶，使用時每瓶用蒸餾水稀釋25倍。 10. 終止液：1×10ml/瓶（2N H2SO4）。 標本的采集及保存 1細胞培養(yǎng)物上清：請離心后收集上清，并將標本保存于-20，且應避免反復凍融。2血清：標本請于室溫放置2小時或4過夜后于1000 x g離心20分鐘，取上清即可檢測，或?qū)吮痉庞?20保存，但應避免反復凍融。3血漿：可用EDTA或肝素作為抗凝劑，標本采集后30分鐘內(nèi)于2 - 8° C 1000 x g離心15分鐘，或?qū)吮痉庞?20保存，但應避免反復凍融。注：標本溶血會影響最后檢測結(jié)果，因此溶血標本不宜進行此

5、項檢測。操作步驟實驗開始前，請?zhí)崆芭渲煤盟性噭噭┗驑悠废♂寱r，均需混勻，混勻時盡量避免起泡。每次檢測都應該做標準曲線。如樣品濃度過高時，用樣品稀釋液進行稀釋，以使樣品符合試劑盒的檢測范圍。1. 加樣：分別設空白孔、標準孔、待測樣品孔?？瞻卓准訕悠废♂屢?00ul，余孔分別加標準品或待測樣品100ul，注意不要有氣泡，加樣將樣品加于酶標板孔底部，盡量不觸及孔壁，輕輕晃動混勻，酶標板加上蓋或覆膜，37反應120分鐘。為保證實驗結(jié)果有效性，每次實驗請使用新的標準品溶液。2. 棄去液體，甩干，不用洗滌。每孔加檢測溶液A工作液 100ul（取1ul檢測溶液A加99ul檢測稀釋液A的比例配制，輕輕混

6、勻，在使用前一小時內(nèi)配制），37,60分鐘。3. 溫育60分鐘后，棄去孔內(nèi)液體，甩干，洗板3次，每次浸泡1-2分鐘，350ul/每孔，甩干。 4. 每孔加檢測溶液B工作液（同檢測A工作液） 100ul，37，60分鐘。5. 溫育60分鐘后，棄去孔內(nèi)液體，甩干，洗板5次，每次浸泡1-2分鐘，350ul/每孔，甩干。6. 依序每孔加底物溶液90ul，37避光顯色（30分鐘內(nèi)，此時肉眼可見標準品的前3-4孔有明顯的梯度蘭色，后3-4孔梯度不明顯，即可終止）。7. 依序每孔加終止溶液50ul，終止反應（此時藍色立轉(zhuǎn)黃色）。終止液的加入順序應盡量與底物液的加入順序相同。為了保證實驗結(jié)果的準確性，底物反應

7、時間到后應盡快加入終止液。8. 用酶聯(lián)儀在450nm波長依序測量各孔的光密度（OD值）。 在加終止液后15分鐘以內(nèi)進行檢測。注：1 每次實驗留一孔作為空白調(diào)零孔，該孔不加任何試劑，只是最后加底物溶液及2NH2SO4。測量時先用此孔調(diào)OD值至零。 2為防止樣品蒸發(fā)，試驗時將反應板放于鋪有濕布的密閉盒內(nèi)，酶標板加上蓋或覆膜。3. 未使用完的酶標板或者試劑，請于2-8保存。標準品、檢測溶液A工作液、檢測溶液B工作液請依據(jù)所需的量配置使用。請勿重復使用已稀釋過的標準品、檢測溶液A工作液或檢測溶液B工作液。4. 建議檢測樣品時均設雙孔測定，以保證檢測結(jié)果的準確性。洗板方法手工洗板方法：吸去（不可觸及板壁

8、）或甩掉酶標板內(nèi)的液體；在實驗臺上鋪墊幾層吸水紙，酶標板朝下用力拍幾次；將推薦的洗滌緩沖液至少0.4ml注入孔內(nèi)，浸泡1-2分鐘，根據(jù)需要，重復此過程數(shù)次。自動洗板：如果有自動洗板機，應在熟練使用后再用到正式實驗過程中。特異性 本試劑盒可同時檢測天然的人TSLP，且與其它相關(guān)無交叉反應。計算 以標準物的濃度為橫坐標（對數(shù)坐標），OD值為縱坐標（普通坐標），在半對數(shù)坐標紙上繪出標準曲線，根據(jù)樣品的OD值由標準曲線查出相應的濃度；再乘以稀釋倍數(shù)；或用標準物的濃度與OD值計算出標準曲線的直線回歸方程式，將樣品的OD值代入方程式，計算出樣品濃度，再乘以稀釋倍數(shù)，即為樣品的實際濃度。 注意事項1 洗滌過程非常重要，不充分的洗滌易造成假陽性。2 一次加樣時間最好控制在5分鐘內(nèi)，如標本數(shù)量多，推薦使用排槍加樣。3 請每次測定的同時做標準曲線，最好做復孔。4 如標本中待測物質(zhì)含量過高，請先稀釋后再測定，計算時請最后乘以稀釋倍數(shù)。5在配制標準品、檢測溶液工作液時，請以相應的稀釋液配制，不能混淆。6底物請避光保存。檢測范圍：0.156 ng/mL -10 ng/mL說明 1