小鼠腹水型肝癌淋巴道轉(zhuǎn)移實(shí)驗(yàn)

1、小鼠腹水型肝癌淋巴道轉(zhuǎn)移實(shí)驗(yàn)【署名】 指導(dǎo)教師：于曉棠【摘要】目的：通過(guò)可移植性小鼠腹水型肝癌淋巴道轉(zhuǎn)移實(shí)驗(yàn)，從感性上認(rèn)識(shí)腫瘤侵襲與淋巴道轉(zhuǎn)移的生物學(xué)特性，了解腫瘤動(dòng)物實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ徒⒌倪^(guò)程及意義。方法：使用近交系615小鼠皮下接種腹水型肝癌高淋巴道轉(zhuǎn)移菌株（HCa-F）進(jìn)行腫瘤淋巴道轉(zhuǎn)移實(shí)驗(yàn)，取其淋巴結(jié)觀察是否有淋巴道轉(zhuǎn)移以及檢測(cè)瘤株淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移能力。取肺肝腎組織切片以觀察是否有血道轉(zhuǎn)移。結(jié)果：小鼠腹水型肝癌發(fā)生淋巴道轉(zhuǎn)移，轉(zhuǎn)移率為40%，并可造成相關(guān)器官發(fā)生病變。結(jié)論：此方法操作簡(jiǎn)單，結(jié)果直觀，小鼠腹水型肝癌淋巴道轉(zhuǎn)移率較高?！娟P(guān)鍵詞】小鼠 腹水型肝癌 淋巴道轉(zhuǎn)移【前言】為更好地了解腫瘤的發(fā)病機(jī)

2、制、腫瘤與宿主的關(guān)系、腫瘤侵襲與轉(zhuǎn)移的過(guò)程和治療措施的有效性,需要建立合適的動(dòng)物模型。小鼠與人類在遺傳學(xué)、病理學(xué)、生物學(xué)許多特性方面相似,是腫瘤研究的理想動(dòng)物模型。而且目前的技術(shù)能夠在鼠的基因水平上設(shè)計(jì)與人類疾病相關(guān)的基因突變而獲得相關(guān)疾病模型1。小鼠模型是目前可以整合基礎(chǔ)和臨床腫瘤研究的武器2,已應(yīng)用于腫瘤研究的各個(gè)領(lǐng)域。隨著對(duì)腫瘤認(rèn)識(shí)的不斷深入，以及實(shí)驗(yàn)動(dòng)物學(xué)的發(fā)展和一些新技術(shù)的運(yùn)用，小鼠腫瘤模型的研究取得了重要進(jìn)展,并已得到廣泛應(yīng)用。腫瘤轉(zhuǎn)移是導(dǎo)致惡性腫瘤患者死亡的主要原因之一，淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移是癌早期最常見(jiàn)的轉(zhuǎn)移方式，且淋巴轉(zhuǎn)移還可以成為進(jìn)一步血道轉(zhuǎn)移的橋頭3。小鼠腹水型肝癌淋巴道轉(zhuǎn)移試驗(yàn)是

3、研究肝癌的淋巴道轉(zhuǎn)移的生物學(xué)特性的試驗(yàn)。因?yàn)樾陆餍胁W(xué)資料表明，我國(guó)的原發(fā)性肝癌病人數(shù)占全世界肝癌病人的一半以上。由于乙型肝炎、肝炎后肝硬化病人眾多，致使我國(guó)的肝癌發(fā)病率和死亡率居高不下，其死亡率占所有惡性腫瘤的第二位。在上個(gè)世紀(jì)我國(guó)進(jìn)行大規(guī)模的現(xiàn)場(chǎng)篩查，通過(guò)早期發(fā)現(xiàn)早期治療，在臨床治療方面取得了巨大進(jìn)步，使肝癌有不治之癥變成了部分可治之癥。近來(lái)綜合治療技術(shù)的發(fā)展，大肝癌縮小后二部切除，又使部分病人獲得了可治愈機(jī)會(huì)。隨著臨床治療經(jīng)驗(yàn)的積累，逐漸意識(shí)到及時(shí)是小肝癌根治性切除，轉(zhuǎn)移復(fù)發(fā)仍然是一個(gè)十分嚴(yán)峻的問(wèn)題。術(shù)后5年復(fù)發(fā)率可高達(dá)50%。解決這些問(wèn)題，單靠臨床經(jīng)驗(yàn)、病例分析是遠(yuǎn)遠(yuǎn)不夠的。要涉及到

4、肝癌的實(shí)質(zhì)性問(wèn)題腫瘤本身的生物學(xué)特性，尤其是其轉(zhuǎn)移的生物學(xué)特性。對(duì)肝癌轉(zhuǎn)移的生物學(xué)行為進(jìn)行實(shí)驗(yàn)研究，必須有一個(gè)良好的轉(zhuǎn)移模型系統(tǒng)。HCa-F是從小鼠腹水型肝癌細(xì)胞株H22中篩選出的特異性向淋巴道轉(zhuǎn)移的細(xì)胞，HCa-F為高轉(zhuǎn)移細(xì)胞株，接種于615小鼠腋中線皮下淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移率高于80%45。本實(shí)驗(yàn)為感性上認(rèn)識(shí)腫瘤侵襲與淋巴道轉(zhuǎn)移的生物學(xué)特性，了解腫瘤動(dòng)物實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ徒⒌倪^(guò)程及意義提供了很好的幫助。【正文】方法：一。實(shí)驗(yàn)材料： 1。細(xì)胞系：高轉(zhuǎn)移力小鼠腹水型肝癌細(xì)胞，由大連醫(yī)科大學(xué)病理教研室建株并保存。2實(shí)驗(yàn)動(dòng)物：近交系615小鼠，雌雄兼用，68周齡，體重1822g，由大連醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。 3

5、。 主要儀器及器皿：搪瓷盆、溫度計(jì)、離心管、1ml注射器、手術(shù)刀、眼科手術(shù)剪、眼科手術(shù)鑷、乳膠手套、生理鹽水、1%來(lái)蘇兒溶液、75%酒精棉、10% 甲醛固定液等。二。研究方法 1。細(xì)胞系獲?。簭囊旱拗腥〕龈咿D(zhuǎn)移力小鼠腹水型肝癌細(xì)胞塑料凍存管，立即放入40度的溫水中，一分鐘內(nèi)使凍存液全部融化，拉力機(jī)送入無(wú)菌室中。取出細(xì)胞懸液放入離心管中，有生理鹽水洗滌2次，離心，棄上清，在加1ml生理鹽水吹打均勻。向小鼠腹腔內(nèi)接種0。2mlHCa-F細(xì)胞懸液，于第6天無(wú)菌條件取腹水。 2。615小鼠腳墊接種腫瘤細(xì)胞：取615小鼠癌性腹水0。1ml，接種于615小鼠腳墊上。定期觀察腫瘤生長(zhǎng)及淋巴結(jié)腫大情況。四周

6、后處死全部小鼠，取瘤體及相關(guān)淋巴結(jié)，同時(shí)觀察肺、肝、腎等器官。將上述組織固定于10%甲醛固定液中，石蠟包埋制片，HE染色，顯微鏡檢查。3。組織取材：將皮下瘤體、淋巴結(jié)、肺、肝、腎選取病變部位，切成厚23mm的小于2cm1cm大小的組織塊，10%中性甲醛固定。小塊組織一般固定數(shù)小時(shí)，較大標(biāo)本需固定2448小時(shí)。經(jīng)沖洗（用遞升濃度的酒精等）、透明（用二甲苯等）、浸蠟（用石蠟），然后用石蠟將組織包埋成蠟塊，再經(jīng)切片機(jī)切片和染色制成切片。一般常規(guī)作蘇木精-伊紅染色。4。切片脫色：石蠟切片法、HE染色法。（1） 脫水程序及時(shí)間：組織固定，沖洗，然后：1）脫水。以下列順序進(jìn)行：60%酒精30分鐘80%酒精

7、12小時(shí)95%酒精24小時(shí)或過(guò)夜95%酒精24小時(shí)100%酒精24小時(shí)100%酒精24小時(shí)或過(guò)夜; 2）透明：二甲苯I3045分鐘；二甲苯3045分鐘; 3）浸蠟。蠟碗、（各3045分鐘）；包埋; 4）修蠟塊。修蠟塊，貼號(hào); 5）切片; 6）烘烤。烘烤切片6070攝氏度，1小時(shí); 7）染色。（2） HE切片染色程序與方法: 1) 切片脫蠟水洗：將烘干的切片浸入二甲苯、各10分鐘。 無(wú)水酒精5分鐘（消除二甲苯）95%酒精2分鐘80%酒精2分鐘70%酒精2分鐘50%酒精2分鐘自來(lái)水沖洗5分鐘（洗去切片上的酒精，切片透明）蒸餾水清洗（防止污染蘇木精染液）。 脫蠟是水華過(guò)程，目的是通過(guò)酒精的緩沖作用，

8、易于水洗與染色。因?yàn)槿緞┦钦l(shuí)，從無(wú)水酒精直接放入染液中，容易引起激烈的擴(kuò)散作用，造成切片漂浮脫落或損傷組織。而經(jīng)各級(jí)濃度酒精緩沖后即可避免發(fā)生這種現(xiàn)象。 2) HE染色：蘇木精-伊紅染色是先用蘇木精將組織切片適當(dāng)?shù)墓?，?jīng)水洗后再用鹽酸酒精分化，弱堿性水溶液顯藍(lán)。使胞核呈明顯的藍(lán)色，胞質(zhì)及背景無(wú)色。再經(jīng)水洗后用伊紅染胞質(zhì)，染成深淺不同程度的粉紅色至紅色。 蘇木染色（染核）15分鐘自來(lái)水沖洗3分鐘0。5%鹽酸酒精溶液分化數(shù)秒鐘自來(lái)水洗2分鐘弱堿性水溶液顯藍(lán)30-60秒自來(lái)水沖洗5分鐘伊紅1分鐘蒸餾水洗1-2次。 3) 脫水、透明、封固：脫水、透明的目的是使存留在切片上的水分及漂浮的染色液全部除凈

9、，經(jīng)透明劑的作用后，將脫水劑清除出來(lái)，使切片產(chǎn)生適宜的折光率。最后用蓋玻片及封固劑封固，便于觀察和長(zhǎng)期保存。 80%酒精10秒95%酒精10秒無(wú)水酒精3分鐘污水酒精3分鐘二甲苯5分鐘二甲苯5分鐘中性樹(shù)膠封固。結(jié)果：時(shí)間精神狀態(tài)是否觸及腫塊有腫塊只數(shù)10月22日良好否010月24日良好否010月27日良好否010月29日良好否010月31日良好否011月3日良好否011月5日良好否011月7日良好否011月10日良好是511月12日良好是611月14日良好是611月18日良好是6顯微鏡下觀察淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的分布：1。皮下瘤體：大體：皮下瘤體較大，呈灰白色，質(zhì)硬，與皮下組織粘附緊密，界限不清LM：瘤細(xì)

10、胞分布不規(guī)律（組織結(jié)構(gòu)異型性），瘤細(xì)胞體積較大，形態(tài)不一，核較大，胞質(zhì)藍(lán)染，呈嗜堿性（細(xì)胞異型性）2。同側(cè)腋下淋巴結(jié)：大體：比正常淋巴結(jié)大，呈卵圓形，質(zhì)硬，切面灰白色LM：在淋巴結(jié)邊緣竇處可看到某些細(xì)胞分布不規(guī)律，細(xì)胞體積較大，形態(tài)不一，核較大，胞質(zhì)藍(lán)染，與在皮下瘤體的切片中看到的瘤細(xì)胞形態(tài)相似，表明此淋巴結(jié)中的腫瘤組織是原發(fā)在皮下的腫瘤經(jīng)淋巴道轉(zhuǎn)移的結(jié)果3。肝 肺 腎大體：未見(jiàn)異常LM：未見(jiàn)到組織結(jié)構(gòu)和細(xì)胞異型性，表明此腫瘤未經(jīng)血道轉(zhuǎn)移討論：615近系小鼠是我國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院血液學(xué)研究所1961年5月用本所飼養(yǎng)的昆明種白化雌性小鼠和由前蘇聯(lián)引進(jìn)的C57BL血研黑色雄性近交系小鼠雜交而得到第一代后

11、，用雜交第一代嚴(yán)格按照同胞兄妹交配的原則連續(xù)繁殖20代以上得到的一系棕色小鼠。由于615小鼠淋巴系統(tǒng)比較發(fā)達(dá)且有許多近交系，部分近交系有特定的自發(fā)性腫瘤，可利用其自發(fā)腫瘤與人體腫瘤的相似之處作為動(dòng)物模型進(jìn)行腫瘤發(fā)生、發(fā)展和治療的研究。和國(guó)外的近交系小鼠相比，較易飼養(yǎng)繁殖，性情溫順，也適于實(shí)驗(yàn)?zāi)[瘤學(xué)，腫瘤病毒學(xué)的研究78。近交系動(dòng)物主要有如下的特點(diǎn)： 基因純合性，即基因型一致，遺傳特性相同。從理論上說(shuō)，不會(huì)因?yàn)殡[性基因的暴露而影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果的一致性。遺傳物質(zhì)同源性。同一品系內(nèi)的個(gè)體間的皮膚或腫瘤移植不會(huì)被當(dāng)作異己來(lái)排斥，各個(gè)體間的基因位點(diǎn)，及位點(diǎn)的分型是完全一致的。表現(xiàn)型的一致性，近交系動(dòng)物任何可

12、遺傳的體征都應(yīng)是一致的，如生理、生化以及組織學(xué)、形態(tài)學(xué)上的特征（毛色、體重等），甚至行為的類型都趨于一致。這一特點(diǎn)保證了動(dòng)物實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)在統(tǒng)計(jì)學(xué)上的意義。由于近郊動(dòng)物有以上優(yōu)點(diǎn)，排除了一些對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的不必要干擾。它具有良好的、適合實(shí)驗(yàn)要求的遺傳特性，被用于眾多的實(shí)驗(yàn)領(lǐng)域如胚胎學(xué)、生理學(xué)、遺傳學(xué)研究等9。人體內(nèi)對(duì)抗癌細(xì)胞的功能主要由免疫系統(tǒng)承擔(dān)。免疫系統(tǒng)被腫瘤細(xì)胞阻塞，淋巴液就會(huì)向相反的方向流動(dòng)，導(dǎo)致不符合常規(guī)的轉(zhuǎn)移現(xiàn)象。惡性腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移的可能機(jī)制有：1、淋巴道轉(zhuǎn)移 2、血道轉(zhuǎn)移 3、種植性轉(zhuǎn)移。本實(shí)驗(yàn)中重點(diǎn)研究淋巴道轉(zhuǎn)移。惡性腫瘤侵入淋巴管后，首先到達(dá)局部淋巴結(jié)，局部淋巴結(jié)發(fā)生轉(zhuǎn)移后，可繼續(xù)轉(zhuǎn)移至

13、下一站的其他淋巴結(jié)，最后，可經(jīng)胸導(dǎo)管入血再繼發(fā)血道轉(zhuǎn)移。移植性小鼠腫瘤模型是人為因素制作的一種實(shí)驗(yàn)?zāi)[瘤類型，已被廣泛應(yīng)用與各種腫瘤的研究。小鼠腹水型肝癌（H22)瘤株可在多種品系小鼠身上移植生長(zhǎng)，并發(fā)生淋巴道轉(zhuǎn)移，具有瘤細(xì)胞易于計(jì)數(shù)，移植瘤生長(zhǎng)良好，淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移高，肺轉(zhuǎn)移率低等特點(diǎn)6。Hca-F是從小鼠腹水型肝癌細(xì)胞株H22中篩選出的特異性向淋巴道轉(zhuǎn)移的細(xì)胞，Hca-F為高轉(zhuǎn)移細(xì)胞株，淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移率高于80。轉(zhuǎn)移率稍微偏低的原因分析如下：瘤細(xì)胞接種時(shí)，可能因?yàn)椴僮鞑皇炀殻?。1ml（2106個(gè)）未能全部注入皮下，造成瘤細(xì)胞數(shù)量過(guò)少。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物數(shù)量過(guò)少，動(dòng)物意外死亡等其他原因可造成轉(zhuǎn)移率偏低。淋巴道轉(zhuǎn)

14、移常有一定的規(guī)律，通常先是在局部呈膨脹性生長(zhǎng)，并逐漸侵犯肌層、血管、神經(jīng)，然后侵犯臨近正常淋巴結(jié)，進(jìn)行轉(zhuǎn)移。淋巴道轉(zhuǎn)移到晚期常合并血道轉(zhuǎn)移。但實(shí)驗(yàn)時(shí)間如果短了，血道轉(zhuǎn)移常不發(fā)生，這與本實(shí)驗(yàn)結(jié)果未見(jiàn)肺肝腎轉(zhuǎn)移一致。H22瘤細(xì)胞接種于皮下呈結(jié)節(jié)狀增長(zhǎng)。如H22一F20瘤細(xì)胞可在615系小鼠的腳掌、腋下等多個(gè)部位移植生長(zhǎng)，并形成不同程度的轉(zhuǎn)移，且主要沿淋巴系統(tǒng)轉(zhuǎn)移，其中腳掌組轉(zhuǎn)移的范圍最廣泛，數(shù)目也較多10。現(xiàn)很多肝癌淋巴道轉(zhuǎn)移實(shí)驗(yàn)都采用腳墊接種。但濃度等均無(wú)統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)， 缺乏特異的腫瘤淋巴道轉(zhuǎn)移模型。作為惡性上皮腫瘤早期轉(zhuǎn)移的主要形式，淋巴道轉(zhuǎn)移機(jī)制的解析對(duì)臨床腫瘤轉(zhuǎn)移的診治還是有著積極的意義。 結(jié)

15、論：小鼠腹水型肝癌發(fā)生淋巴道轉(zhuǎn)移，轉(zhuǎn)移率為40%，并可造成相關(guān)器官發(fā)生病變。此次試驗(yàn)是通過(guò)建立小鼠腹水型肝癌淋巴道高轉(zhuǎn)移細(xì)胞系HCa-F細(xì)胞膜型，了解腫瘤侵襲與淋巴道轉(zhuǎn)移的生物學(xué)特性。通過(guò)模型的建立，染色質(zhì)片，鏡檢等一系列過(guò)程建立了科研的學(xué)術(shù)觀念，掌握了相關(guān)專業(yè)知識(shí)?！緟⒖嘉墨I(xiàn)】【1】Weiss B， Shannon K。 J 。 Curr Opin Genet Dev，2003， 13( 1): 84-89?！?】Klausner RD。 J 。 Oncogene， 1999， 18(38) :5249 -5252。【3】崔曉楠，侯力，等。小鼠肝癌細(xì)胞淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的基質(zhì)金屬蛋白酶譜。癌癥，2002，21（11）：1192-1196。【4】王宏梅，魏巍，等。 肝素對(duì)小鼠肝癌細(xì)胞Hca-F和Hca-P淋巴道轉(zhuǎn)移的抑制作用。腫瘤防治研究，2007，【5】劉敏，王莉芬等。L-選擇蛋白可能接到小鼠肝癌HCa-F細(xì)胞經(jīng)淋巴道轉(zhuǎn)移的研究。解剖學(xué)報(bào)，2004，35（5）【6】范艷敏，伍烽，杜永洪。小鼠H22移植性肝癌中晚期動(dòng)物模型的建立。廣西