質(zhì)粒DNA的轉(zhuǎn)化

1、 實(shí)驗(yàn)三實(shí)驗(yàn)三 質(zhì)粒質(zhì)粒DNADNA的轉(zhuǎn)化的轉(zhuǎn)化 實(shí)驗(yàn)?zāi)康膶?shí)驗(yàn)?zāi)康?掌握CaClCaCl2 2法法將載體(質(zhì)粒)轉(zhuǎn)化入受體 (大腸桿菌)的實(shí)驗(yàn)技術(shù)實(shí)驗(yàn)材料實(shí)驗(yàn)材料 受體:大腸桿菌DH5 載體: pUC19 pUC-19 VectorpUC-19 Vector 實(shí)實(shí) 驗(yàn)驗(yàn) 原原 理理 抗生素平板選擇標(biāo)記抗生素平板選擇標(biāo)記 pUC19pUC19質(zhì)粒帶有氨芐青霉素抗性基因，而宿主菌質(zhì)粒帶有氨芐青霉素抗性基因，而宿主菌DH5DH5 對(duì)氨芐青霉素沒(méi)有抗性。在用對(duì)氨芐青霉素沒(méi)有抗性。在用 pUC19pUC19質(zhì)粒轉(zhuǎn)化質(zhì)粒轉(zhuǎn)化DH5DH5 后，后，涂布到含有氨芐青霉素的培養(yǎng)基上培養(yǎng)，沒(méi)有被轉(zhuǎn)化的菌涂布到含有

2、氨芐青霉素的培養(yǎng)基上培養(yǎng)，沒(méi)有被轉(zhuǎn)化的菌不能生長(zhǎng)，而被轉(zhuǎn)化了的菌可以正常生長(zhǎng)，形成菌落。不能生長(zhǎng)，而被轉(zhuǎn)化了的菌可以正常生長(zhǎng)，形成菌落。 - -半乳糖苷酶系統(tǒng)篩選（藍(lán)、白斑篩選）半乳糖苷酶系統(tǒng)篩選（藍(lán)、白斑篩選） pUC19pUC19質(zhì)粒帶有一個(gè)大腸桿菌質(zhì)粒帶有一個(gè)大腸桿菌DNADNA的短區(qū)段的短區(qū)段, , 其中含有其中含有-半乳糖苷酶基因（半乳糖苷酶基因（Lac ZLac Z）的調(diào)控序列和頭）的調(diào)控序列和頭146146個(gè)氨基個(gè)氨基酸的編碼信息。酸的編碼信息。 DH5 DH5 宿主菌染色體上帶有宿主菌染色體上帶有LacZLacZ的的C C端端部分編碼信息，它們編碼的肽段各自都不具有酶活性部分編

3、碼信息，它們編碼的肽段各自都不具有酶活性, , 但但它們?cè)谕患?xì)胞內(nèi)可以通過(guò)非共價(jià)鍵結(jié)合起來(lái)它們?cè)谕患?xì)胞內(nèi)可以通過(guò)非共價(jià)鍵結(jié)合起來(lái), , 形成具有形成具有-半乳糖苷酶活性的蛋白質(zhì)。質(zhì)粒載體與半乳糖苷酶活性的蛋白質(zhì)。質(zhì)粒載體與LacZLacZ基因上缺基因上缺失近操縱基因區(qū)段的失近操縱基因區(qū)段的-半乳糖苷酶陰性的大腸桿菌突變體半乳糖苷酶陰性的大腸桿菌突變體之間的這種互補(bǔ)作用稱為之間的這種互補(bǔ)作用稱為 互補(bǔ)。互補(bǔ)。LacLac操縱子調(diào)控模型操縱子調(diào)控模型 -互補(bǔ)正常的正常的-半半乳糖苷酶乳糖苷酶-肽肽 C C端部分端部分有活性的有活性的-半半乳糖苷酶乳糖苷酶不能互補(bǔ)-肽中加了肽中加了一段外源基一段

4、外源基因產(chǎn)物因產(chǎn)物 C C端部分端部分實(shí)驗(yàn)流程實(shí)驗(yàn)流程制備感受態(tài)細(xì)胞制備感受態(tài)細(xì)胞培養(yǎng)大腸桿菌培養(yǎng)大腸桿菌 選擇培養(yǎng)基平板的制備選擇培養(yǎng)基平板的制備質(zhì)粒質(zhì)粒DNADNA的轉(zhuǎn)化的轉(zhuǎn)化 配選擇培養(yǎng)基平板配選擇培養(yǎng)基平板 1. LB1. LB液體培養(yǎng)基液體培養(yǎng)基: 1g: 1g蛋白胨蛋白胨, 0.5g, 0.5g酵母粉酵母粉, 1g NaCl, , 1g NaCl, 加重蒸水加重蒸水100ml100ml，用，用NaOHNaOH調(diào)調(diào)pHpH至至7.07.0，高壓滅菌。（每組配，高壓滅菌。（每組配40ml40ml）2. LB2. LB固體培養(yǎng)基固體培養(yǎng)基: : 在在40ml40ml未高壓滅菌的未高壓滅菌

5、的LBLB液體培養(yǎng)基中加液體培養(yǎng)基中加1.51.5瓊脂，高瓊脂，高壓滅菌后取出。當(dāng)培養(yǎng)基冷卻到約壓滅菌后取出。當(dāng)培養(yǎng)基冷卻到約5050時(shí)，加入氨芐青霉素母液，使其終時(shí)，加入氨芐青霉素母液，使其終濃度為濃度為60g/ml60g/ml，搖勻后迅速倒成兩個(gè)平板。（高壓滅菌同時(shí)也滅菌兩套，搖勻后迅速倒成兩個(gè)平板。（高壓滅菌同時(shí)也滅菌兩套洗凈的培養(yǎng)皿）。洗凈的培養(yǎng)皿）。 實(shí)驗(yàn)步驟實(shí)驗(yàn)步驟3. 3. 在超凈工作臺(tái)上，往倒好的平板培養(yǎng)基上涂布在超凈工作臺(tái)上，往倒好的平板培養(yǎng)基上涂布44l X-gal44l X-gal（80mg/ml80mg/ml）和）和IPTGIPTG（200mg/ml200mg/ml）混

6、合液（）混合液（10:110:1），），將平板置于室溫放將平板置于室溫放置置3-4h3-4h直至液直至液體被吸收。體被吸收。制備感受態(tài)細(xì)胞制備感受態(tài)細(xì)胞1.1.取大腸桿菌取大腸桿菌DH5DH5 劃線培養(yǎng)過(guò)夜的單菌落接種到劃線培養(yǎng)過(guò)夜的單菌落接種到20mlLB20mlLB液體培養(yǎng)基液體培養(yǎng)基中，置中，置3737搖床于搖床于280rpm280rpm振搖培養(yǎng)約振搖培養(yǎng)約4h4h。 2.2.將細(xì)菌轉(zhuǎn)移到一個(gè)無(wú)菌離心管中，冰上放置將細(xì)菌轉(zhuǎn)移到一個(gè)無(wú)菌離心管中，冰上放置10min10min，使培養(yǎng)物冷卻到，使培養(yǎng)物冷卻到00。 3.3.以以4000rpm4000rpm離心離心10min10min，回收細(xì)胞

7、，棄上清，將管倒置使殘留的痕量，回收細(xì)胞，棄上清，將管倒置使殘留的痕量培養(yǎng)液盡量流盡。培養(yǎng)液盡量流盡。4.4.以以1.5ml1.5ml冰冷的冰冷的0.1mol/L CaCl0.1mol/L CaCl2 2懸浮沉淀，放置于冰浴。懸浮沉淀，放置于冰浴。5.5.以以2000rpm2000rpm離心離心10min10min，回收細(xì)胞且使培養(yǎng)液流盡。，回收細(xì)胞且使培養(yǎng)液流盡。6.6.取取1ml1ml冰冷的冰冷的0.1mol/L CaCl0.1mol/L CaCl2 2懸浮細(xì)胞，將細(xì)胞分成懸浮細(xì)胞，將細(xì)胞分成200l200l一份，裝一份，裝入入EppendorfEppendorf管中，置管中，置44冰箱備

8、用。此時(shí)的細(xì)胞為感受態(tài)細(xì)胞。冰箱備用。此時(shí)的細(xì)胞為感受態(tài)細(xì)胞。 轉(zhuǎn) 化1.1.取取2 2管管200l200l的感受態(tài)細(xì)胞，的感受態(tài)細(xì)胞，1 1管中加入管中加入4l4l的的pUC19 DNA pUC19 DNA ，另另1 1管為不加質(zhì)粒管為不加質(zhì)粒DNADNA的對(duì)照，輕輕旋轉(zhuǎn)以混勻內(nèi)容物，冰的對(duì)照，輕輕旋轉(zhuǎn)以混勻內(nèi)容物，冰上放置上放置30min30min。2.2.將管放到將管放到4242水浴中水浴中1.5min1.5min，不要搖。然后在冰浴中迅速，不要搖。然后在冰浴中迅速冷卻冷卻 2min 2min。( (熱激反應(yīng)熱激反應(yīng)) )3.3.每管加入每管加入100l LB100l LB培養(yǎng)基，培養(yǎng)基，3737水浴中溫育水浴中溫育45min45min。 培培 養(yǎng)養(yǎng)1. 取取200l200l菌液加在含有氨芐青霉素及菌液加在含有氨芐青霉素及X-GalX-Gal和和IPTGIPTG的選擇的選擇平板培養(yǎng)基上，用一無(wú)菌彎頭玻棒輕輕將細(xì)菌涂在瓊脂平平板培養(yǎng)基上，用一無(wú)菌彎頭玻棒輕輕將細(xì)菌涂在瓊脂平板表面，將平板置于室溫直至液體被吸收。經(jīng)質(zhì)粒轉(zhuǎn)化的板表面，將平板置于室溫直至液體被吸收。經(jīng)質(zhì)粒轉(zhuǎn)化的細(xì)菌和未轉(zhuǎn)化的對(duì)照各涂布一個(gè)平板。細(xì)菌和未轉(zhuǎn)化的對(duì)照各涂布一個(gè)平板。 2. 2. 倒置平皿倒置平皿3737培養(yǎng)培養(yǎng)12-16h12-16h，對(duì)照培養(yǎng)皿中應(yīng)