獸醫(yī)實(shí)驗(yàn)室作業(yè)指導(dǎo)書(shū)匯編(共23頁(yè))

1、精選優(yōu)質(zhì)文檔-傾情為你奉上獸醫(yī)實(shí)驗(yàn)室作業(yè)指導(dǎo)書(shū)修訂日期修訂單號(hào)修訂內(nèi)容摘要頁(yè)次版次修訂審核批準(zhǔn)2011/03/30/系統(tǒng)文件新制定4A/0/批準(zhǔn)：審核：編制：監(jiān)測(cè)抽樣作業(yè)指導(dǎo)書(shū) 一、目的對(duì)監(jiān)測(cè)抽樣進(jìn)行有效的質(zhì)量控制，以確保監(jiān)測(cè)結(jié)果的客觀性、準(zhǔn)確性、有效性。 二、適用范圍本程序適用于各種動(dòng)物的血清學(xué)監(jiān)測(cè)抽樣和病原學(xué)監(jiān)測(cè)抽樣。 三、職責(zé) 1樣品抽樣人員應(yīng)按照本程序進(jìn)行抽樣、封樣、編號(hào)，同時(shí)作好抽樣登記，對(duì)樣品作適當(dāng)處理以符合血清學(xué)和病原學(xué)監(jiān)測(cè)樣品的要求。 2業(yè)務(wù)接待室負(fù)責(zé)發(fā)放、收回抽樣登記表，接收保存樣品，并如實(shí)作好接收登記。 3抽樣人員：抽樣人員由XX區(qū)動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心指派，或由XX區(qū)動(dòng)物疫

2、病預(yù)防控制中心派人監(jiān)督抽樣。抽樣人員不得少于兩水，對(duì)大規(guī)模養(yǎng)禽場(chǎng)應(yīng)適當(dāng)增加抽樣人員。 4家禽抽樣比例：種禽場(chǎng)按存欄的1抽樣，規(guī)模化養(yǎng)禽場(chǎng)按存欄的0.5- l抽樣，每個(gè)場(chǎng)抽樣應(yīng)不少于50份，散養(yǎng)禽以自然村為單位。 5.家畜抽樣比例：種畜場(chǎng)采樣比例不應(yīng)低于10%，規(guī)模場(chǎng)不應(yīng)低于5%，散養(yǎng)家畜按自然村為單位。 6.抽樣設(shè)備：2-5ml注射器或采血針頭、無(wú)菌棉簽、小青瓶、1.5ml離心管。 7.抽樣單：抽樣單格式詳見(jiàn)動(dòng)物疫病監(jiān)測(cè)抽樣登記表。抽樣時(shí)應(yīng)作好記錄，同時(shí)填寫(xiě)一式三份抽樣登記表，分別由被檢單位、抽樣單位及本中心各保留一份。 8抽樣方式：采用隨機(jī)數(shù)字選樣法進(jìn)行抽樣。使用隨機(jī)數(shù)字表，從中隨機(jī)選定一個(gè)

3、數(shù)字作為起點(diǎn)，在該點(diǎn)以后的隨機(jī)數(shù)字中選取有意義的樣品編號(hào)的數(shù)字作為抽樣編號(hào)，按此編號(hào)抽樣。 9抽樣工作流程： 9 .1抽樣人員憑抽樣任務(wù)單到業(yè)務(wù)接待室領(lǐng)取動(dòng)物疫病監(jiān)測(cè)登記表，到指定地點(diǎn)采樣。 9 .2采樣后，抽樣人員及時(shí)對(duì)樣品進(jìn)行封樣，同時(shí)做好抽樣登記。抽樣登記表一式二份，被檢單位存留一份，另一份隨樣品送中心業(yè)務(wù)接待室。貯存和運(yùn)送： 10.1為確保分析樣品的穩(wěn)定性和樣品的完整性，抽取的樣品由專人妥善保存，在規(guī)定的時(shí)間送達(dá)業(yè)務(wù)接待室。10.2樣品在冷藏條件下貯存運(yùn)送。血清未析出時(shí)，應(yīng)靜止避免晃動(dòng)。已污染或溶血的樣品不能采用。原始記錄編制作業(yè)指導(dǎo)書(shū) 一、目的 為確保本中心所適應(yīng)原始記錄規(guī)范、詳實(shí)、

4、溯源性等特點(diǎn)，特制定本作業(yè)指導(dǎo)書(shū)。二、適用范圍本中心所有的原始記錄記載。二、原則1、原始記錄是實(shí)驗(yàn)室管理體系文件的組成部分，是檢測(cè)活動(dòng)的見(jiàn)證性文件，是對(duì)已完成的檢測(cè)工作各環(huán)節(jié)的真實(shí)記載，是出具檢測(cè)報(bào)告的唯一依據(jù)。實(shí)驗(yàn)室要真實(shí)、完整、準(zhǔn)確地記錄各項(xiàng)檢測(cè)活動(dòng)，渝須編制好一套簡(jiǎn)潔明了、方便實(shí)用且符合實(shí)際檢測(cè)工作要求的原始記錄。2、原始記錄主要由現(xiàn)場(chǎng)采樣/檢測(cè)記錄、委托檢驗(yàn)單、樣品接收單、檢測(cè)任務(wù)單、實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)一記錄、檢驗(yàn)報(bào)告底稿等組成。3、原始記錄的版面格式包括記錄的名稱、用途、受控標(biāo)識(shí)、樣品編號(hào)、檢測(cè)、復(fù)核、審核的時(shí)間和人員、相關(guān)信息等內(nèi)容。粕關(guān)信息是檢測(cè)原始記錄的主體部分，不同類別的檢測(cè)原始記錄

5、其內(nèi)容也有較大的差別。一般包括樣品的基本信息、檢測(cè)環(huán)境和儀器設(shè)備情況、檢測(cè)相關(guān)情況和數(shù)據(jù)三大部分。3.1樣品的基本信息包含受檢單位名稱、樣品名稱、數(shù)量、性狀、采樣地點(diǎn)、保存的條件、送檢及采樣的時(shí)間、檢測(cè)項(xiàng)目等內(nèi)容。3.2檢測(cè)環(huán)境和儀器設(shè)備情況包括檢測(cè)時(shí)的溫度、濕度；使用的主要儀器設(shè)備的名稱、型號(hào)、編號(hào)、檢測(cè)前后的狀態(tài)；試劑名稱、批號(hào)或內(nèi)部編號(hào)等。3.3檢測(cè)相關(guān)情況和數(shù)據(jù)包括檢測(cè)的時(shí)間、方法及依據(jù)，樣品處理等，檢測(cè)過(guò)程中觀察到的現(xiàn)象和異常情況的處理，從設(shè)備上直接讀得的數(shù)值或打印記錄等。4、檢測(cè)原始記錄應(yīng)盡可能地方便檢測(cè)人員填寫(xiě)。實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)記錄時(shí)，除經(jīng)常一起檢測(cè)的項(xiàng)目可編制多項(xiàng)目的檢測(cè)記錄外，對(duì)不

6、經(jīng)常一起檢測(cè)的項(xiàng)目應(yīng)盡量編制單項(xiàng)目的檢測(cè)記錄。診斷試劑驗(yàn)收和質(zhì)量驗(yàn)證作業(yè)指導(dǎo)書(shū)一、目的為確保本中心購(gòu)進(jìn)的診斷試劑的質(zhì)量，應(yīng)及時(shí)進(jìn)行驗(yàn)收和質(zhì)量驗(yàn)證，特制定本作業(yè)指導(dǎo)書(shū)。二、適用范圍：本中心計(jì)劃購(gòu)進(jìn)的所有診斷試劑。三、職責(zé)1.儀器設(shè)備室人員負(fù)責(zé)診斷試劑的驗(yàn)收、記錄。2檢測(cè)室人員負(fù)責(zé)對(duì)診斷試劑的質(zhì)量驗(yàn)證。3資料檔案管理人員負(fù)責(zé)相關(guān)記錄的存檔，建立年度對(duì)供應(yīng)商的評(píng)價(jià)表和合格服務(wù)方名錄。四、工作程序1診斷試劑的驗(yàn)收：診斷試劑送至中心后，由診斷試劑管理人員進(jìn)行驗(yàn)收。診斷試劑管理人員對(duì)試劑盒的包裝、數(shù)量、有效期等內(nèi)容進(jìn)行逐一核對(duì)，并填寫(xiě)“供應(yīng)品驗(yàn)收記錄”。診斷試劑應(yīng)保持包裝完好、無(wú)破損、試劑在有效期內(nèi)、數(shù)量

7、符合訂貨數(shù)量。驗(yàn)收合格的診斷試劑按說(shuō)明書(shū)要求進(jìn)行入庫(kù)保存。如發(fā)現(xiàn)有破損、超過(guò)有效期、數(shù)量與訂貨數(shù)量不符等情況，一律按不合格診斷試劑處置（見(jiàn)3不合格診斷試劑的處置）。2診斷試劑的質(zhì)量驗(yàn)證：診斷試劑入庫(kù)后，診斷試劑管理人員及時(shí)通知相關(guān)檢測(cè)人員進(jìn)行診斷試劑的質(zhì)量驗(yàn)證。對(duì)于采購(gòu)數(shù)量大、價(jià)格相對(duì)便宜的診斷試劑，如間接血凝試劑、血凝和血凝抑制試劑等，每到一批試劑后，同一批次隨機(jī)抽取一盒（套）進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn)。對(duì)于采購(gòu)數(shù)量少、價(jià)格昂貴的診斷試劑，如PCR、ELISA試劑盒等，不單獨(dú)做質(zhì)量驗(yàn)證，將第一次檢測(cè)樣品的試驗(yàn)結(jié)果作為質(zhì)量驗(yàn)證的依據(jù)。驗(yàn)證試驗(yàn)嚴(yán)格遵照相關(guān)程序，由兩名檢測(cè)人員進(jìn)行，試驗(yàn)設(shè)立陰性、陽(yáng)性對(duì)照，并做

8、好原始記錄。如試驗(yàn)對(duì)照成立，判為試劑質(zhì)量合格；試驗(yàn)對(duì)照不成立，判為試劑質(zhì)量不合格。試驗(yàn)結(jié)果及時(shí)反饋至診斷試劑管理人員，驗(yàn)證記錄交資料檔案室存檔。3不合格診斷試劑的處置：在診斷試劑的驗(yàn)收和（或）驗(yàn)證過(guò)程中發(fā)現(xiàn)不合格診斷試劑時(shí)，應(yīng)及時(shí)報(bào)中心技術(shù)負(fù)責(zé)人，由技術(shù)負(fù)責(zé)人安排人員與供貨商聯(lián)系，協(xié)調(diào)處理，同時(shí)填寫(xiě)“不合格供應(yīng)品處置記錄”。4記錄：應(yīng)做好診斷試劑的驗(yàn)收、驗(yàn)證等各項(xiàng)工作記錄，交資料檔案管理人員存檔，資料檔案管理人員根據(jù)記錄建立“供應(yīng)商評(píng)價(jià)表”和“合格供應(yīng)商名錄”。五、記錄表格“供應(yīng)品驗(yàn)收記錄”“不合格供應(yīng)品處置記錄”“供應(yīng)商評(píng)價(jià)表”“合格供應(yīng)商名錄”移液器自校檢查作業(yè)指導(dǎo)書(shū)一、目的利用空氣吸力移

9、取均值、中質(zhì)密度和中等粘度的液體。二、適用范圍不可用于操作與聚丙烯反應(yīng)或有較高的蒸汽壓的液體。三、環(huán)境條件溫度：20 ±5，濕度：50% ±10%。所需儀器和試劑天平，蒸餾水四、操作步驟1、松緊度檢驗(yàn)：吸取液體后豎直移液器，停留10秒鐘。如有漏氣則會(huì)形成液珠滴下。2、移液：在吸取液體時(shí)，將槍頭插入液體兩至三毫升下，移液器用在第一檔，緩慢吸取液體后停留1秒左右時(shí)間，以免空氣吸入，注意不要將液體吸入移液器中。在排除液體時(shí)，先將移液鍵作用在第一檔，延容器壁緩慢排除液體，然后將移液鍵作用于第二檔，將殘留體積完全排除。然后頂部的槍頭彈出，排掉槍頭。3、稱量及計(jì)算：調(diào)整可調(diào)加樣器，在加

10、樣器最大、最小和中間吸取量上分別連續(xù)吸取五次水，分別稱量。通過(guò)五次稱量計(jì)算出平均體積。4、判定標(biāo)準(zhǔn)：計(jì)算出的平均體積同加樣器讀數(shù)比較，誤差在3%以內(nèi)為合格。如果超出這一范圍，應(yīng)清洗，維修并重新校正。重新校正仍不合格的，退回廠家修理或作廢棄處理。5、有效期：有效期為一年。如出現(xiàn)故障，需排除故障后再次校訂，校訂合格方可使用?？谔阋弑O(jiān)測(cè)診斷作業(yè)指導(dǎo)書(shū) 一、口蹄疫病毒VP1結(jié)構(gòu)蛋白抗體檢測(cè)酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn) 1.適用范圍 用于檢測(cè)豬、牛、羊血清中的口蹄疫病毒VPI結(jié)構(gòu)蛋白抗體，與豬、牛、羊口蹄疫病毒非結(jié)構(gòu)蛋白抗體酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)診斷試劑盒聯(lián)合使用，可區(qū)分口蹄疫病毒感染動(dòng)物及疫苗免疫動(dòng)物。檢測(cè)豬血清應(yīng)用豬

11、口蹄疫病毒VP1結(jié)構(gòu)蛋白抗體酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)診斷試劑盒；檢測(cè)牛、羊血清應(yīng)用牛、羊口蹄疫病毒VP1結(jié)構(gòu)蛋白抗體酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)診斷試劑盒。 2.檢測(cè)試劑 口蹄疫病毒VP1抗原包被板、樣品稀釋液、酶結(jié)合物、陰性對(duì)照、VP1陽(yáng)性對(duì)照、酶結(jié)合物稀釋液、TMB底物A液、TMB底物B液、終止液（l.OMHZSO。）、濃縮洗滌液、稀釋板、一次性封板膜、微孔定位標(biāo)簽。 3.檢測(cè)步驟3.1使用前將試劑盒恢復(fù)到室溫，避免陽(yáng)光直射或放置在30 以上的環(huán)境中。3.2取出試劑盒中的樣品稀釋液。A1、B1兩孔作為陰性對(duì)照，Cl、D1兩孔作為陽(yáng)性對(duì)照孔，其余孔作檢測(cè)孔，每孔一個(gè)樣品。3.3在稀釋板的各孔中加200樣品稀釋液

12、。在相應(yīng)各孔中分別加入10此對(duì)照血清或被檢血清樣品。用加樣器重復(fù)吹吸數(shù)次。稀釋每個(gè)樣品時(shí)必須使用不同的吸頭。3.4取出抗原包被板。3.5分別從稀釋板上取稀釋后的對(duì)照血清和被檢血清各100此，加至抗原包被板的相應(yīng)孔中，加益或封膜后，置37士2 下孵育60士5分鐘。3.6洗滌工作液配制：按需要量，用去產(chǎn)離子水或雙蒸水將洗滌液作25倍稀釋。3.7用洗滌工作液洗滌抗原包被板，每孔300噸，洗滌6次，拍干。3.8酶結(jié)合物工作液配制：用酶結(jié)合物稀釋液將酶結(jié)合物作100倍稀釋，現(xiàn)配現(xiàn)用。3.9每孔加入100此酶結(jié)合物工作液，加蓋或封膜后，置37±2 下孵育30±2分鐘。3.10重復(fù)3.7

13、。3.11TMB底物工作液配制：將TMB底物B液和TMB底物A液等量混合，現(xiàn)配現(xiàn)用。3.12每孔加入100此底物工作液，加蓋或封膜后，置37±2 下孵育15±1分鐘。3.13每孔加入100此終止液，并輕輕振蕩混勻。3.14在15分鐘內(nèi)，用酶聯(lián)讀數(shù)儀測(cè)定在450nln波長(zhǎng)下的OD值。結(jié)果判定4.1豬口蹄疫病毒vPI結(jié)構(gòu)蛋白抗體檢測(cè)結(jié)果判定：4.1.1陰性對(duì)照孔平均0D值應(yīng)續(xù)0.15，每個(gè)陽(yáng)性對(duì)照孔0D值應(yīng)妻0.5，且簇2.0。否則，試驗(yàn)無(wú)效。臨界值0.23x陽(yáng)性對(duì)照孔平均OD值。4.1.2被檢樣品孔OD值<臨界值時(shí)、判為陰性，即為抗口蹄疫病毒VPI結(jié)構(gòu)蛋白抗體陰性。4.

14、1.3被檢樣品孔OD值>臨界值，判為陽(yáng)性。4.1.4對(duì)判定結(jié)果為陽(yáng)性的樣品，應(yīng)用2個(gè)孔進(jìn)行重復(fù)檢測(cè)。重復(fù)檢測(cè)后，若至少有一個(gè)孔為陽(yáng)性，則判為口蹄疫病毒VPI結(jié)構(gòu)蛋白抗體陽(yáng)性，若兩孔均為陰性，則判為口蹄疫病毒VPI結(jié)構(gòu)蛋白抗體陰性。4.1.5當(dāng)豬口蹄疫病毒vPI結(jié)構(gòu)蛋白抗體酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)診斷試劑盒與豬口蹄疫病毒非結(jié)構(gòu)蛋白抗體酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)診斷試劑盒聯(lián)合使用時(shí)，按下列標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行最終判定4.2牛、羊口蹄疫病毒VPI結(jié)構(gòu)蛋白抗體檢測(cè)結(jié)果判定：4.2.1陰性對(duì)照孔平均OD值應(yīng)0.2，每個(gè)陽(yáng)性對(duì)照孔OD值應(yīng)0.5，且2.0。否則，試驗(yàn)無(wú)效。臨界值=0.23x陽(yáng)性對(duì)照孔平均OD值。4.2.2被檢樣品

15、孔OD值臨界值時(shí)，判為陰性，即為抗口蹄疫病毒VP1結(jié)構(gòu)蛋白抗體陰性。4.2.3被檢樣品孔OD值臨界值，判為陽(yáng)性。4.2.4對(duì)判定結(jié)果為陽(yáng)性的樣品，應(yīng)用2個(gè)孔進(jìn)行重復(fù)檢測(cè)。重復(fù)檢測(cè)后，若至少有一個(gè)孔為陽(yáng)性，則判為口蹄疫病毒VPI結(jié)構(gòu)蛋白抗體陽(yáng)性，若兩孔均為陰性，則判為口蹄疫病毒VP1結(jié)構(gòu)蛋白抗體陰性。4.2.5當(dāng)牛、羊口蹄疫病毒VP1結(jié)構(gòu)蛋白抗體酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)診斷試劑盒與牛、羊口蹄疫病毒非結(jié)構(gòu)蛋白抗體酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)診斷試劑盒聯(lián)合使用時(shí)，按下列標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行最終判定。高致病性禽流感檢測(cè)診斷作業(yè)指導(dǎo)書(shū) 一、高致病性禽流感血凝抑制（HI）試驗(yàn) 1.適用范圍該試驗(yàn)是目前WHO進(jìn)行全球流感監(jiān)測(cè)所普遍采用的試

16、驗(yàn)方法。可用于流感病毒分離株HA亞型的鑒定，也可用來(lái)檢測(cè)禽血清中是否有與抗原亞型一致的感染或免疫抗體。HI試驗(yàn)可用來(lái)鑒定所有的流感病毒分離株，可用來(lái)檢測(cè)禽血清中的感染或免疫抗體。 2.檢測(cè)試劑配置 2.1 阿氏（Alsevers）液配制稱量葡萄糖2.05g、檸檬酸鈉0.8g、檸檬酸0.055g、氯化鈉0.42g，加蒸餾水至100mL，散熱溶解后調(diào)pH值至6.1，69kPa 15min高壓滅菌，4保存?zhèn)溆谩?2.2 10%和1%雞紅細(xì)胞液的制備 2.2.1 采血：用注射器吸取阿氏液約1mL，取至少2只SPF雞（如果沒(méi)有SPF雞，可用常規(guī)試驗(yàn)證明體內(nèi)無(wú)禽流感和新城疫抗體的雞），采血約24mL，與阿

17、氏液混合，放入裝10mL阿氏液的離心管中混勻。2.2.2 洗滌雞紅細(xì)胞：將離心管中的血液經(jīng)15001800 r/min 離心8分鐘，棄上清液，沉淀物加入阿氏液，輕輕混合，再經(jīng)15001800 r/min離心8分鐘，用吸管移去上清液及沉淀紅細(xì)胞上層的白細(xì)胞薄膜，再重復(fù)2次以上過(guò)程后，加入阿氏液20 mL，輕輕混合成紅細(xì)胞懸液，4保存?zhèn)溆茫怀^(guò)5天。2.2.3 10%雞紅細(xì)胞懸液：取阿氏液保存不超過(guò)5天的紅細(xì)胞，在錐形刻度離心管中離心15001800 r/min 8分鐘，棄去上清液，準(zhǔn)確觀察刻度離心管中紅細(xì)胞體積(mL)，加入9倍體積(mL)的生理鹽水，用吸管反復(fù)吹吸使生理鹽水與紅細(xì)胞混合均勻。

18、2.2.4 1%雞紅細(xì)胞液：取混合均勻的10%雞紅細(xì)胞懸液1mL，加入9mL生理鹽水，混合均勻即可。3.檢測(cè)步驟 3.1 在微量反應(yīng)板的1孔12孔均加入0.025mL PBS，換滴頭。3.2吸取0.025mL病毒懸液（如感染性雞胚尿囊液）加入第l孔，混勻。3.3從第1孔吸取0.025mL病毒液加入第2孔，混勻后吸取0.025mL加入第3孔，如此進(jìn)行對(duì)倍稀釋至第11孔，從第11孔吸取0.025mL棄之，換滴頭。3.4每孔再加入0.025mL PBS。3.5每孔均加入0.025mL 體積分?jǐn)?shù)為1%雞紅細(xì)胞懸液（將雞紅細(xì)胞懸液充分搖勻后加入）見(jiàn)附錄B。3.6振蕩混勻，在室溫（2025）下靜置40mi

19、n后觀察結(jié)果（如果環(huán)境溫度太高，可置4環(huán)境下反應(yīng)1小時(shí)）。對(duì)照孔紅細(xì)胞將呈明顯的鈕扣狀沉到孔底。 3.7將板傾斜，觀察血凝板，判讀結(jié)果（見(jiàn)下表）。表1：血凝試驗(yàn)結(jié)果判讀標(biāo)準(zhǔn)類別孔 底 所 見(jiàn)結(jié)果12345紅細(xì)胞全部凝集，均勻鋪于孔底，即100%紅細(xì)胞凝集紅細(xì)胞凝集基本同上，但孔底有大圈紅細(xì)胞于孔底形成中等大的圈，四周有小凝塊紅細(xì)胞于孔底形成小圓點(diǎn)，四周有少許凝集塊紅細(xì)胞于孔底呈小圓點(diǎn)，邊緣光滑整齊，即紅細(xì)胞完全不凝集+- 能使紅細(xì)胞完全凝集（100%凝集，+）的抗原最高稀釋度為該抗原的血凝效價(jià)，此效價(jià)為1個(gè)血凝單位（HAU）。注意對(duì)照孔應(yīng)呈現(xiàn)完全不凝集（-），否則此次檢驗(yàn)無(wú)效。3.8 根據(jù)4.

20、1的試驗(yàn)結(jié)果配制4HAU的病毒抗原。以完全血凝的病毒最高稀釋倍數(shù)作為終點(diǎn)，終點(diǎn)稀釋倍數(shù)除以4即為含4HAU的抗原的稀釋倍數(shù)。例如，如果血凝的終點(diǎn)滴度為1:256，則4HAU抗原的稀釋倍數(shù)應(yīng)是1:64（256除以4）。3.9 在微量反應(yīng)板的1孔11孔加入0.025mL PBS，第12孔加入0.05mL PBS。3.10 吸取0.025mL血清加入第1孔內(nèi)，充分混勻后吸0.025mL于第2孔，依次對(duì)倍稀釋至第10孔，從第10孔吸取0.025mL棄去。3.11 1孔11孔均加入含4HAU混勻的病毒抗原液0.025mL，室溫（約20）靜置至少30min。3.12 每孔加入0.025mL體積分?jǐn)?shù)為1%的

21、雞紅細(xì)胞懸液混勻，輕輕混勻，靜置約40min（室溫約20，若環(huán)境溫度太高可置4條件下進(jìn)行），對(duì)照紅細(xì)胞將呈現(xiàn)鈕扣狀沉于孔底。4.結(jié)果判定以完全抑制4個(gè)HAU抗原的血清最高稀釋倍數(shù)作為HI滴度。只有陰性對(duì)照孔血清滴度不大于21og2，陽(yáng)性對(duì)照孔血清誤差不超過(guò)1個(gè)滴度，試驗(yàn)結(jié)果才有效。HI價(jià)小于或等于21og2判定HI試驗(yàn)陰性；HI價(jià)等于31og2為可疑，需重復(fù)試驗(yàn)；HI價(jià)大于或等于41og2為陽(yáng)性。豬瘟監(jiān)測(cè)診斷作業(yè)指導(dǎo)書(shū) 一、豬瘟抗原雙抗體夾心ELISA檢測(cè)方法 1.適用范圍 本方法通過(guò)形成的多克隆抗體-樣品-單克隆抗體夾心，并采用辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記物檢測(cè)，對(duì)外周血白細(xì)胞、全血、細(xì)胞培養(yǎng)物以及組

22、織樣本中的豬瘟病毒抗原進(jìn)行檢測(cè)的一種雙抗體夾心ELISA方法。 2.檢測(cè)試劑2.1 多克隆羊抗血清包被板條 8孔×12條（96孔）2.2 CSFV陽(yáng)性對(duì)照，含有防腐劑1.5mL2.3 CSFV陰性對(duì)照，含有防腐劑1.5mL2.4 100倍濃縮辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記物（100×）辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記抗鼠IgG，含防腐劑200uL2.5 10倍濃縮樣品稀釋液（10×）55mL2.6 底物液，TMB/H2O2溶液 12mL2.7 終止液，1M HCL（小心，強(qiáng)酸）12mL2.8 10倍濃縮洗滌液（10×）125mL2.9 CSFV單克隆抗體，含防腐劑4mL2.10

23、酶標(biāo)抗體稀釋液15mL3.檢測(cè)步驟 3.1樣品制備注意：制備好的樣品或組織可以在27保存7天，或-20冷凍保存6個(gè)月以上。但這些樣品在應(yīng)用前應(yīng)該再次以1500g離心10分鐘或10000g離心25分鐘。3.1 外周血白細(xì)胞2.1.1 取10mL肝素或EDTA抗凝血樣品，1500g離心1520分鐘。2.1.2 再用移液器小心吸出血沉棕黃層，加入500uL樣品稀釋液（1×）,在旋渦振蕩器上混勻，室溫下放置1小時(shí)，期間不時(shí)旋渦混合。然后直接進(jìn)行步驟2.1.6操作。2.1.3 假如樣品的棕黃層壓積細(xì)胞體積非常少，那么就用整個(gè)細(xì)胞團(tuán)（包括紅細(xì)胞）。將細(xì)胞加進(jìn)10mL的離心管，并加入5mL預(yù)冷（2

24、7，下同）的0.17M NH4Cl。混勻，靜置10分鐘。2.1.4 用冷（27）超純水或雙蒸水加滿離心管，輕輕上下顛倒混勻，1500g離心5分鐘。2.1.5 棄去上清，向細(xì)胞團(tuán)中加入500uL樣品稀釋液（1×）,用潔凈的吸頭懸起細(xì)胞，在旋渦振蕩器上混勻，室溫放置1小時(shí)。期間不時(shí)旋渦混合。2.1.6 1500g離心5分鐘,取上清液按操作步驟進(jìn)行檢測(cè)。注意：處理好的的樣品可以在27保存7天，或-20冷凍保存6個(gè)月以上。但這些樣品在使用前必須再次離心。3.2 全血（肝素或EDTA抗凝）3.2.1 取25uL 10倍濃縮樣品稀釋液（10×）和475uL全血加入微量離心管，在旋渦振蕩

25、器上混勻。3.2.2 室溫下孵育1小時(shí)，期間不時(shí)旋渦混合。此樣品可以直接按照“操作步驟”進(jìn)行檢測(cè)?；颍褐苯訉?5uL全血加入酶標(biāo)板孔中，再加入10uL 5倍濃縮樣品稀釋液（5×）?；蝿?dòng)酶標(biāo)板板條，使樣品混合均勻。再按照“操作步驟”進(jìn)行檢測(cè)。2.4 細(xì)胞培養(yǎng)物2.4.1 移去細(xì)胞培養(yǎng)液，收集培養(yǎng)瓶中的細(xì)胞加入離心管中。2.4.2 2500g離心5分鐘，棄上清。2.4.3 向細(xì)胞團(tuán)中加入500uL樣品稀釋液（1×）。旋渦振蕩充分混勻，室溫孵育1小時(shí)。期間不時(shí)旋渦混合。取此樣品75uL按照“操作步驟”進(jìn)行檢測(cè)。2.5 組織最好用新鮮的組織。如果有必要，組織可以在處理前于27冷藏保

26、存1個(gè)月。每只動(dòng)物檢測(cè)12種組織，最好選取扁桃體、脾、腸、腸系膜淋巴結(jié)或肺。2.5.1 取12g組織用剪刀剪成小碎塊（25mm大?。?。2.5.2 將組織碎塊加入10mL離心管，加入5mL樣品稀釋液（1×）,旋渦振蕩混勻，室溫下孵育121小時(shí)，期間不時(shí)旋渦混合。2.5.3 1500g離心5分鐘，取75uL上清液按照“操作步驟”進(jìn)行檢測(cè)。3 操作步驟注意：所有試劑在使用前應(yīng)該恢復(fù)至室溫1822；使用前試劑應(yīng)在室溫條件下至少放置1小時(shí)。3.1 每孔加入25uLCSFV特異性單克隆抗體。此步驟可以用多道加樣器操作。3.2 在相應(yīng)孔中分別加入75uL陽(yáng)性對(duì)照、陰性對(duì)照，各加2孔。注意更換吸頭。

27、3.3 在其余孔中分別加入75uL制備好的樣品，注意更換吸頭。輕輕拍打酶標(biāo)板，使樣品混合均勻。3.4 置濕盒中或用膠條密封后室溫（1822）孵育過(guò)夜。也可以孵育4個(gè)小時(shí)，但是這樣會(huì)降低檢測(cè)靈敏度。3.5 甩掉孔中液體，用洗滌液（1×）洗滌5次，每次洗滌都要將孔中的所有液體倒空，用力拍打酶標(biāo)板，以使所有液體拍出?；蛘撸靠准尤胂礈煲?50300uL用自動(dòng)洗板機(jī)洗滌5次。注意:洗滌酶標(biāo)板要仔細(xì)。3.6 每孔加入100uL稀釋好的辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記物，在濕盒或密封后置室溫孵育1小時(shí)。3.7 重復(fù)操作步驟3.5；每孔加入100uL底物液，在暗處室溫孵育10分鐘。第1孔加入底物液開(kāi)始計(jì)時(shí)。3.

28、8 每孔加入100uL終止液終止反應(yīng)。加入終止液的順序與上述加入底物液的順序一致。3.9 在酶標(biāo)儀上測(cè)量樣品與對(duì)照孔在450nm處的吸光值，或測(cè)量在450nm和620nm雙波長(zhǎng)的吸光值（空氣調(diào)零）。3.10 計(jì)算每個(gè)樣品和陽(yáng)性對(duì)照孔的矯正OD值的平均值（參見(jiàn)“計(jì)算方法”）。4.計(jì)算方法 首先計(jì)算樣品和對(duì)照孔的OD平均值，在判定結(jié)果之前，所有樣品和陽(yáng)性對(duì)照孔的OD平均值必須進(jìn)行矯正，矯正的OD值等于樣本或陽(yáng)性對(duì)照值減去陰性對(duì)照值。矯正OD值樣本OD值陰性對(duì)照OD值 5.試驗(yàn)有效性判定 陽(yáng)性對(duì)照OD平均值應(yīng)該大于0.500，陰性對(duì)照OD平均值應(yīng)小于陽(yáng)性對(duì)照平均值的20，試驗(yàn)結(jié)果方能有效。否則，應(yīng)仔

29、細(xì)檢查實(shí)驗(yàn)操作并進(jìn)行重測(cè)。如果陰性對(duì)照的OD值始終很高，將陰性對(duì)照在微量離心機(jī)中10000g離心35分鐘，重新檢測(cè)。 6.結(jié)果判定 被檢樣品的矯正OD值大于或等于0.300，則為陽(yáng)性； 被檢樣品的矯正OD值小于0.200，則為陰性； 被檢樣品的矯正OD值大于0.200，小于0.300，則為可疑。二、豬瘟間接ELISA抗體檢測(cè) 1.適用范圍 用于檢測(cè)豬血清中豬瘟抗體。 2.檢測(cè)試劑 2.1 包被抗原的微孔板 2.2 陰、陽(yáng)性對(duì)照血消 2.3抗豬IgG-HRP結(jié)合物 2.4 20倍濃縮洗滌液 2.5 底物A液、B液 2.6 終止液 2.7 樣品稀釋液 3.檢測(cè)步驟 3.1將試劑盒平衡至室溫。 3.2將洗滌液用蒸餾水作20倍稀釋 3.3取預(yù)包被的微孔板（根據(jù)樣品多少，可拆開(kāi)分次使用），用樣品稀釋液將待檢樣品40倍稀釋后加入板孔中，每孔加100uL。陰、陽(yáng)性對(duì)照各設(shè)2孔，每孔100uL。另設(shè)一空白對(duì)照孔，空