獸醫(yī)實驗室作業(yè)指導書匯編(共23頁)

1、精選優(yōu)質(zhì)文檔-傾情為你奉上獸醫(yī)實驗室作業(yè)指導書修訂日期修訂單號修訂內(nèi)容摘要頁次版次修訂審核批準2011/03/30/系統(tǒng)文件新制定4A/0/批準：審核：編制：監(jiān)測抽樣作業(yè)指導書 一、目的對監(jiān)測抽樣進行有效的質(zhì)量控制，以確保監(jiān)測結(jié)果的客觀性、準確性、有效性。 二、適用范圍本程序適用于各種動物的血清學監(jiān)測抽樣和病原學監(jiān)測抽樣。 三、職責 1樣品抽樣人員應按照本程序進行抽樣、封樣、編號，同時作好抽樣登記，對樣品作適當處理以符合血清學和病原學監(jiān)測樣品的要求。 2業(yè)務接待室負責發(fā)放、收回抽樣登記表，接收保存樣品，并如實作好接收登記。 3抽樣人員：抽樣人員由XX區(qū)動物疫病預防控制中心指派，或由XX區(qū)動物疫

2、病預防控制中心派人監(jiān)督抽樣。抽樣人員不得少于兩水，對大規(guī)模養(yǎng)禽場應適當增加抽樣人員。 4家禽抽樣比例：種禽場按存欄的1抽樣，規(guī)模化養(yǎng)禽場按存欄的0.5- l抽樣，每個場抽樣應不少于50份，散養(yǎng)禽以自然村為單位。 5.家畜抽樣比例：種畜場采樣比例不應低于10%，規(guī)模場不應低于5%，散養(yǎng)家畜按自然村為單位。 6.抽樣設備：2-5ml注射器或采血針頭、無菌棉簽、小青瓶、1.5ml離心管。 7.抽樣單：抽樣單格式詳見動物疫病監(jiān)測抽樣登記表。抽樣時應作好記錄，同時填寫一式三份抽樣登記表，分別由被檢單位、抽樣單位及本中心各保留一份。 8抽樣方式：采用隨機數(shù)字選樣法進行抽樣。使用隨機數(shù)字表，從中隨機選定一個

3、數(shù)字作為起點，在該點以后的隨機數(shù)字中選取有意義的樣品編號的數(shù)字作為抽樣編號，按此編號抽樣。 9抽樣工作流程： 9 .1抽樣人員憑抽樣任務單到業(yè)務接待室領取動物疫病監(jiān)測登記表，到指定地點采樣。 9 .2采樣后，抽樣人員及時對樣品進行封樣，同時做好抽樣登記。抽樣登記表一式二份，被檢單位存留一份，另一份隨樣品送中心業(yè)務接待室。貯存和運送： 10.1為確保分析樣品的穩(wěn)定性和樣品的完整性，抽取的樣品由專人妥善保存，在規(guī)定的時間送達業(yè)務接待室。10.2樣品在冷藏條件下貯存運送。血清未析出時，應靜止避免晃動。已污染或溶血的樣品不能采用。原始記錄編制作業(yè)指導書 一、目的 為確保本中心所適應原始記錄規(guī)范、詳實、

4、溯源性等特點，特制定本作業(yè)指導書。二、適用范圍本中心所有的原始記錄記載。二、原則1、原始記錄是實驗室管理體系文件的組成部分，是檢測活動的見證性文件，是對已完成的檢測工作各環(huán)節(jié)的真實記載，是出具檢測報告的唯一依據(jù)。實驗室要真實、完整、準確地記錄各項檢測活動，渝須編制好一套簡潔明了、方便實用且符合實際檢測工作要求的原始記錄。2、原始記錄主要由現(xiàn)場采樣/檢測記錄、委托檢驗單、樣品接收單、檢測任務單、實驗室檢測一記錄、檢驗報告底稿等組成。3、原始記錄的版面格式包括記錄的名稱、用途、受控標識、樣品編號、檢測、復核、審核的時間和人員、相關信息等內(nèi)容。粕關信息是檢測原始記錄的主體部分，不同類別的檢測原始記錄

5、其內(nèi)容也有較大的差別。一般包括樣品的基本信息、檢測環(huán)境和儀器設備情況、檢測相關情況和數(shù)據(jù)三大部分。3.1樣品的基本信息包含受檢單位名稱、樣品名稱、數(shù)量、性狀、采樣地點、保存的條件、送檢及采樣的時間、檢測項目等內(nèi)容。3.2檢測環(huán)境和儀器設備情況包括檢測時的溫度、濕度；使用的主要儀器設備的名稱、型號、編號、檢測前后的狀態(tài)；試劑名稱、批號或內(nèi)部編號等。3.3檢測相關情況和數(shù)據(jù)包括檢測的時間、方法及依據(jù)，樣品處理等，檢測過程中觀察到的現(xiàn)象和異常情況的處理，從設備上直接讀得的數(shù)值或打印記錄等。4、檢測原始記錄應盡可能地方便檢測人員填寫。實驗室檢測記錄時，除經(jīng)常一起檢測的項目可編制多項目的檢測記錄外，對不

6、經(jīng)常一起檢測的項目應盡量編制單項目的檢測記錄。診斷試劑驗收和質(zhì)量驗證作業(yè)指導書一、目的為確保本中心購進的診斷試劑的質(zhì)量，應及時進行驗收和質(zhì)量驗證，特制定本作業(yè)指導書。二、適用范圍：本中心計劃購進的所有診斷試劑。三、職責1.儀器設備室人員負責診斷試劑的驗收、記錄。2檢測室人員負責對診斷試劑的質(zhì)量驗證。3資料檔案管理人員負責相關記錄的存檔，建立年度對供應商的評價表和合格服務方名錄。四、工作程序1診斷試劑的驗收：診斷試劑送至中心后，由診斷試劑管理人員進行驗收。診斷試劑管理人員對試劑盒的包裝、數(shù)量、有效期等內(nèi)容進行逐一核對，并填寫“供應品驗收記錄”。診斷試劑應保持包裝完好、無破損、試劑在有效期內(nèi)、數(shù)量

7、符合訂貨數(shù)量。驗收合格的診斷試劑按說明書要求進行入庫保存。如發(fā)現(xiàn)有破損、超過有效期、數(shù)量與訂貨數(shù)量不符等情況，一律按不合格診斷試劑處置（見3不合格診斷試劑的處置）。2診斷試劑的質(zhì)量驗證：診斷試劑入庫后，診斷試劑管理人員及時通知相關檢測人員進行診斷試劑的質(zhì)量驗證。對于采購數(shù)量大、價格相對便宜的診斷試劑，如間接血凝試劑、血凝和血凝抑制試劑等，每到一批試劑后，同一批次隨機抽取一盒（套）進行驗證試驗。對于采購數(shù)量少、價格昂貴的診斷試劑，如PCR、ELISA試劑盒等，不單獨做質(zhì)量驗證，將第一次檢測樣品的試驗結(jié)果作為質(zhì)量驗證的依據(jù)。驗證試驗嚴格遵照相關程序，由兩名檢測人員進行，試驗設立陰性、陽性對照，并做

8、好原始記錄。如試驗對照成立，判為試劑質(zhì)量合格；試驗對照不成立，判為試劑質(zhì)量不合格。試驗結(jié)果及時反饋至診斷試劑管理人員，驗證記錄交資料檔案室存檔。3不合格診斷試劑的處置：在診斷試劑的驗收和（或）驗證過程中發(fā)現(xiàn)不合格診斷試劑時，應及時報中心技術(shù)負責人，由技術(shù)負責人安排人員與供貨商聯(lián)系，協(xié)調(diào)處理，同時填寫“不合格供應品處置記錄”。4記錄：應做好診斷試劑的驗收、驗證等各項工作記錄，交資料檔案管理人員存檔，資料檔案管理人員根據(jù)記錄建立“供應商評價表”和“合格供應商名錄”。五、記錄表格“供應品驗收記錄”“不合格供應品處置記錄”“供應商評價表”“合格供應商名錄”移液器自校檢查作業(yè)指導書一、目的利用空氣吸力移

9、取均值、中質(zhì)密度和中等粘度的液體。二、適用范圍不可用于操作與聚丙烯反應或有較高的蒸汽壓的液體。三、環(huán)境條件溫度：20 ±5，濕度：50% ±10%。所需儀器和試劑天平，蒸餾水四、操作步驟1、松緊度檢驗：吸取液體后豎直移液器，停留10秒鐘。如有漏氣則會形成液珠滴下。2、移液：在吸取液體時，將槍頭插入液體兩至三毫升下，移液器用在第一檔，緩慢吸取液體后停留1秒左右時間，以免空氣吸入，注意不要將液體吸入移液器中。在排除液體時，先將移液鍵作用在第一檔，延容器壁緩慢排除液體，然后將移液鍵作用于第二檔，將殘留體積完全排除。然后頂部的槍頭彈出，排掉槍頭。3、稱量及計算：調(diào)整可調(diào)加樣器，在加

10、樣器最大、最小和中間吸取量上分別連續(xù)吸取五次水，分別稱量。通過五次稱量計算出平均體積。4、判定標準：計算出的平均體積同加樣器讀數(shù)比較，誤差在3%以內(nèi)為合格。如果超出這一范圍，應清洗，維修并重新校正。重新校正仍不合格的，退回廠家修理或作廢棄處理。5、有效期：有效期為一年。如出現(xiàn)故障，需排除故障后再次校訂，校訂合格方可使用?？谔阋弑O(jiān)測診斷作業(yè)指導書 一、口蹄疫病毒VP1結(jié)構(gòu)蛋白抗體檢測酶聯(lián)免疫吸附試驗 1.適用范圍 用于檢測豬、牛、羊血清中的口蹄疫病毒VPI結(jié)構(gòu)蛋白抗體，與豬、牛、羊口蹄疫病毒非結(jié)構(gòu)蛋白抗體酶聯(lián)免疫吸附試驗診斷試劑盒聯(lián)合使用，可區(qū)分口蹄疫病毒感染動物及疫苗免疫動物。檢測豬血清應用豬

11、口蹄疫病毒VP1結(jié)構(gòu)蛋白抗體酶聯(lián)免疫吸附試驗診斷試劑盒；檢測牛、羊血清應用牛、羊口蹄疫病毒VP1結(jié)構(gòu)蛋白抗體酶聯(lián)免疫吸附試驗診斷試劑盒。 2.檢測試劑 口蹄疫病毒VP1抗原包被板、樣品稀釋液、酶結(jié)合物、陰性對照、VP1陽性對照、酶結(jié)合物稀釋液、TMB底物A液、TMB底物B液、終止液（l.OMHZSO。）、濃縮洗滌液、稀釋板、一次性封板膜、微孔定位標簽。 3.檢測步驟3.1使用前將試劑盒恢復到室溫，避免陽光直射或放置在30 以上的環(huán)境中。3.2取出試劑盒中的樣品稀釋液。A1、B1兩孔作為陰性對照，Cl、D1兩孔作為陽性對照孔，其余孔作檢測孔，每孔一個樣品。3.3在稀釋板的各孔中加200樣品稀釋液

12、。在相應各孔中分別加入10此對照血清或被檢血清樣品。用加樣器重復吹吸數(shù)次。稀釋每個樣品時必須使用不同的吸頭。3.4取出抗原包被板。3.5分別從稀釋板上取稀釋后的對照血清和被檢血清各100此，加至抗原包被板的相應孔中，加益或封膜后，置37士2 下孵育60士5分鐘。3.6洗滌工作液配制：按需要量，用去產(chǎn)離子水或雙蒸水將洗滌液作25倍稀釋。3.7用洗滌工作液洗滌抗原包被板，每孔300噸，洗滌6次，拍干。3.8酶結(jié)合物工作液配制：用酶結(jié)合物稀釋液將酶結(jié)合物作100倍稀釋，現(xiàn)配現(xiàn)用。3.9每孔加入100此酶結(jié)合物工作液，加蓋或封膜后，置37±2 下孵育30±2分鐘。3.10重復3.7

13、。3.11TMB底物工作液配制：將TMB底物B液和TMB底物A液等量混合，現(xiàn)配現(xiàn)用。3.12每孔加入100此底物工作液，加蓋或封膜后，置37±2 下孵育15±1分鐘。3.13每孔加入100此終止液，并輕輕振蕩混勻。3.14在15分鐘內(nèi)，用酶聯(lián)讀數(shù)儀測定在450nln波長下的OD值。結(jié)果判定4.1豬口蹄疫病毒vPI結(jié)構(gòu)蛋白抗體檢測結(jié)果判定：4.1.1陰性對照孔平均0D值應續(xù)0.15，每個陽性對照孔0D值應妻0.5，且簇2.0。否則，試驗無效。臨界值0.23x陽性對照孔平均OD值。4.1.2被檢樣品孔OD值<臨界值時、判為陰性，即為抗口蹄疫病毒VPI結(jié)構(gòu)蛋白抗體陰性。4.

14、1.3被檢樣品孔OD值>臨界值，判為陽性。4.1.4對判定結(jié)果為陽性的樣品，應用2個孔進行重復檢測。重復檢測后，若至少有一個孔為陽性，則判為口蹄疫病毒VPI結(jié)構(gòu)蛋白抗體陽性，若兩孔均為陰性，則判為口蹄疫病毒VPI結(jié)構(gòu)蛋白抗體陰性。4.1.5當豬口蹄疫病毒vPI結(jié)構(gòu)蛋白抗體酶聯(lián)免疫吸附試驗診斷試劑盒與豬口蹄疫病毒非結(jié)構(gòu)蛋白抗體酶聯(lián)免疫吸附試驗診斷試劑盒聯(lián)合使用時，按下列標準進行最終判定4.2牛、羊口蹄疫病毒VPI結(jié)構(gòu)蛋白抗體檢測結(jié)果判定：4.2.1陰性對照孔平均OD值應0.2，每個陽性對照孔OD值應0.5，且2.0。否則，試驗無效。臨界值=0.23x陽性對照孔平均OD值。4.2.2被檢樣品

15、孔OD值臨界值時，判為陰性，即為抗口蹄疫病毒VP1結(jié)構(gòu)蛋白抗體陰性。4.2.3被檢樣品孔OD值臨界值，判為陽性。4.2.4對判定結(jié)果為陽性的樣品，應用2個孔進行重復檢測。重復檢測后，若至少有一個孔為陽性，則判為口蹄疫病毒VPI結(jié)構(gòu)蛋白抗體陽性，若兩孔均為陰性，則判為口蹄疫病毒VP1結(jié)構(gòu)蛋白抗體陰性。4.2.5當牛、羊口蹄疫病毒VP1結(jié)構(gòu)蛋白抗體酶聯(lián)免疫吸附試驗診斷試劑盒與牛、羊口蹄疫病毒非結(jié)構(gòu)蛋白抗體酶聯(lián)免疫吸附試驗診斷試劑盒聯(lián)合使用時，按下列標準進行最終判定。高致病性禽流感檢測診斷作業(yè)指導書 一、高致病性禽流感血凝抑制（HI）試驗 1.適用范圍該試驗是目前WHO進行全球流感監(jiān)測所普遍采用的試

16、驗方法?？捎糜诹鞲胁《痉蛛x株HA亞型的鑒定，也可用來檢測禽血清中是否有與抗原亞型一致的感染或免疫抗體。HI試驗可用來鑒定所有的流感病毒分離株，可用來檢測禽血清中的感染或免疫抗體。 2.檢測試劑配置 2.1 阿氏（Alsevers）液配制稱量葡萄糖2.05g、檸檬酸鈉0.8g、檸檬酸0.055g、氯化鈉0.42g，加蒸餾水至100mL，散熱溶解后調(diào)pH值至6.1，69kPa 15min高壓滅菌，4保存?zhèn)溆谩?2.2 10%和1%雞紅細胞液的制備 2.2.1 采血：用注射器吸取阿氏液約1mL，取至少2只SPF雞（如果沒有SPF雞，可用常規(guī)試驗證明體內(nèi)無禽流感和新城疫抗體的雞），采血約24mL，與阿

17、氏液混合，放入裝10mL阿氏液的離心管中混勻。2.2.2 洗滌雞紅細胞：將離心管中的血液經(jīng)15001800 r/min 離心8分鐘，棄上清液，沉淀物加入阿氏液，輕輕混合，再經(jīng)15001800 r/min離心8分鐘，用吸管移去上清液及沉淀紅細胞上層的白細胞薄膜，再重復2次以上過程后，加入阿氏液20 mL，輕輕混合成紅細胞懸液，4保存?zhèn)溆?，不超過5天。2.2.3 10%雞紅細胞懸液：取阿氏液保存不超過5天的紅細胞，在錐形刻度離心管中離心15001800 r/min 8分鐘，棄去上清液，準確觀察刻度離心管中紅細胞體積(mL)，加入9倍體積(mL)的生理鹽水，用吸管反復吹吸使生理鹽水與紅細胞混合均勻。

18、2.2.4 1%雞紅細胞液：取混合均勻的10%雞紅細胞懸液1mL，加入9mL生理鹽水，混合均勻即可。3.檢測步驟 3.1 在微量反應板的1孔12孔均加入0.025mL PBS，換滴頭。3.2吸取0.025mL病毒懸液（如感染性雞胚尿囊液）加入第l孔，混勻。3.3從第1孔吸取0.025mL病毒液加入第2孔，混勻后吸取0.025mL加入第3孔，如此進行對倍稀釋至第11孔，從第11孔吸取0.025mL棄之，換滴頭。3.4每孔再加入0.025mL PBS。3.5每孔均加入0.025mL 體積分數(shù)為1%雞紅細胞懸液（將雞紅細胞懸液充分搖勻后加入）見附錄B。3.6振蕩混勻，在室溫（2025）下靜置40mi

19、n后觀察結(jié)果（如果環(huán)境溫度太高，可置4環(huán)境下反應1小時）。對照孔紅細胞將呈明顯的鈕扣狀沉到孔底。 3.7將板傾斜，觀察血凝板，判讀結(jié)果（見下表）。表1：血凝試驗結(jié)果判讀標準類別孔 底 所 見結(jié)果12345紅細胞全部凝集，均勻鋪于孔底，即100%紅細胞凝集紅細胞凝集基本同上，但孔底有大圈紅細胞于孔底形成中等大的圈，四周有小凝塊紅細胞于孔底形成小圓點，四周有少許凝集塊紅細胞于孔底呈小圓點，邊緣光滑整齊，即紅細胞完全不凝集+- 能使紅細胞完全凝集（100%凝集，+）的抗原最高稀釋度為該抗原的血凝效價，此效價為1個血凝單位（HAU）。注意對照孔應呈現(xiàn)完全不凝集（-），否則此次檢驗無效。3.8 根據(jù)4.

20、1的試驗結(jié)果配制4HAU的病毒抗原。以完全血凝的病毒最高稀釋倍數(shù)作為終點，終點稀釋倍數(shù)除以4即為含4HAU的抗原的稀釋倍數(shù)。例如，如果血凝的終點滴度為1:256，則4HAU抗原的稀釋倍數(shù)應是1:64（256除以4）。3.9 在微量反應板的1孔11孔加入0.025mL PBS，第12孔加入0.05mL PBS。3.10 吸取0.025mL血清加入第1孔內(nèi)，充分混勻后吸0.025mL于第2孔，依次對倍稀釋至第10孔，從第10孔吸取0.025mL棄去。3.11 1孔11孔均加入含4HAU混勻的病毒抗原液0.025mL，室溫（約20）靜置至少30min。3.12 每孔加入0.025mL體積分數(shù)為1%的

21、雞紅細胞懸液混勻，輕輕混勻，靜置約40min（室溫約20，若環(huán)境溫度太高可置4條件下進行），對照紅細胞將呈現(xiàn)鈕扣狀沉于孔底。4.結(jié)果判定以完全抑制4個HAU抗原的血清最高稀釋倍數(shù)作為HI滴度。只有陰性對照孔血清滴度不大于21og2，陽性對照孔血清誤差不超過1個滴度，試驗結(jié)果才有效。HI價小于或等于21og2判定HI試驗陰性；HI價等于31og2為可疑，需重復試驗；HI價大于或等于41og2為陽性。豬瘟監(jiān)測診斷作業(yè)指導書 一、豬瘟抗原雙抗體夾心ELISA檢測方法 1.適用范圍 本方法通過形成的多克隆抗體-樣品-單克隆抗體夾心，并采用辣根過氧化物酶標記物檢測，對外周血白細胞、全血、細胞培養(yǎng)物以及組

22、織樣本中的豬瘟病毒抗原進行檢測的一種雙抗體夾心ELISA方法。 2.檢測試劑2.1 多克隆羊抗血清包被板條 8孔×12條（96孔）2.2 CSFV陽性對照，含有防腐劑1.5mL2.3 CSFV陰性對照，含有防腐劑1.5mL2.4 100倍濃縮辣根過氧化物酶標記物（100×）辣根過氧化物酶標記抗鼠IgG，含防腐劑200uL2.5 10倍濃縮樣品稀釋液（10×）55mL2.6 底物液，TMB/H2O2溶液 12mL2.7 終止液，1M HCL（小心，強酸）12mL2.8 10倍濃縮洗滌液（10×）125mL2.9 CSFV單克隆抗體，含防腐劑4mL2.10

23、酶標抗體稀釋液15mL3.檢測步驟 3.1樣品制備注意：制備好的樣品或組織可以在27保存7天，或-20冷凍保存6個月以上。但這些樣品在應用前應該再次以1500g離心10分鐘或10000g離心25分鐘。3.1 外周血白細胞2.1.1 取10mL肝素或EDTA抗凝血樣品，1500g離心1520分鐘。2.1.2 再用移液器小心吸出血沉棕黃層，加入500uL樣品稀釋液（1×）,在旋渦振蕩器上混勻，室溫下放置1小時，期間不時旋渦混合。然后直接進行步驟2.1.6操作。2.1.3 假如樣品的棕黃層壓積細胞體積非常少，那么就用整個細胞團（包括紅細胞）。將細胞加進10mL的離心管，并加入5mL預冷（2

24、7，下同）的0.17M NH4Cl?；靹?，靜置10分鐘。2.1.4 用冷（27）超純水或雙蒸水加滿離心管，輕輕上下顛倒混勻，1500g離心5分鐘。2.1.5 棄去上清，向細胞團中加入500uL樣品稀釋液（1×）,用潔凈的吸頭懸起細胞，在旋渦振蕩器上混勻，室溫放置1小時。期間不時旋渦混合。2.1.6 1500g離心5分鐘,取上清液按操作步驟進行檢測。注意：處理好的的樣品可以在27保存7天，或-20冷凍保存6個月以上。但這些樣品在使用前必須再次離心。3.2 全血（肝素或EDTA抗凝）3.2.1 取25uL 10倍濃縮樣品稀釋液（10×）和475uL全血加入微量離心管，在旋渦振蕩

25、器上混勻。3.2.2 室溫下孵育1小時，期間不時旋渦混合。此樣品可以直接按照“操作步驟”進行檢測。或：直接將75uL全血加入酶標板孔中，再加入10uL 5倍濃縮樣品稀釋液（5×）?；蝿用笜税灏鍡l，使樣品混合均勻。再按照“操作步驟”進行檢測。2.4 細胞培養(yǎng)物2.4.1 移去細胞培養(yǎng)液，收集培養(yǎng)瓶中的細胞加入離心管中。2.4.2 2500g離心5分鐘，棄上清。2.4.3 向細胞團中加入500uL樣品稀釋液（1×）。旋渦振蕩充分混勻，室溫孵育1小時。期間不時旋渦混合。取此樣品75uL按照“操作步驟”進行檢測。2.5 組織最好用新鮮的組織。如果有必要，組織可以在處理前于27冷藏保

26、存1個月。每只動物檢測12種組織，最好選取扁桃體、脾、腸、腸系膜淋巴結(jié)或肺。2.5.1 取12g組織用剪刀剪成小碎塊（25mm大?。?。2.5.2 將組織碎塊加入10mL離心管，加入5mL樣品稀釋液（1×）,旋渦振蕩混勻，室溫下孵育121小時，期間不時旋渦混合。2.5.3 1500g離心5分鐘，取75uL上清液按照“操作步驟”進行檢測。3 操作步驟注意：所有試劑在使用前應該恢復至室溫1822；使用前試劑應在室溫條件下至少放置1小時。3.1 每孔加入25uLCSFV特異性單克隆抗體。此步驟可以用多道加樣器操作。3.2 在相應孔中分別加入75uL陽性對照、陰性對照，各加2孔。注意更換吸頭。

27、3.3 在其余孔中分別加入75uL制備好的樣品，注意更換吸頭。輕輕拍打酶標板，使樣品混合均勻。3.4 置濕盒中或用膠條密封后室溫（1822）孵育過夜。也可以孵育4個小時，但是這樣會降低檢測靈敏度。3.5 甩掉孔中液體，用洗滌液（1×）洗滌5次，每次洗滌都要將孔中的所有液體倒空，用力拍打酶標板，以使所有液體拍出。或者，每孔加入洗滌液250300uL用自動洗板機洗滌5次。注意:洗滌酶標板要仔細。3.6 每孔加入100uL稀釋好的辣根過氧化物酶標記物，在濕盒或密封后置室溫孵育1小時。3.7 重復操作步驟3.5；每孔加入100uL底物液，在暗處室溫孵育10分鐘。第1孔加入底物液開始計時。3.

28、8 每孔加入100uL終止液終止反應。加入終止液的順序與上述加入底物液的順序一致。3.9 在酶標儀上測量樣品與對照孔在450nm處的吸光值，或測量在450nm和620nm雙波長的吸光值（空氣調(diào)零）。3.10 計算每個樣品和陽性對照孔的矯正OD值的平均值（參見“計算方法”）。4.計算方法 首先計算樣品和對照孔的OD平均值，在判定結(jié)果之前，所有樣品和陽性對照孔的OD平均值必須進行矯正，矯正的OD值等于樣本或陽性對照值減去陰性對照值。矯正OD值樣本OD值陰性對照OD值 5.試驗有效性判定 陽性對照OD平均值應該大于0.500，陰性對照OD平均值應小于陽性對照平均值的20，試驗結(jié)果方能有效。否則，應仔

29、細檢查實驗操作并進行重測。如果陰性對照的OD值始終很高，將陰性對照在微量離心機中10000g離心35分鐘，重新檢測。 6.結(jié)果判定 被檢樣品的矯正OD值大于或等于0.300，則為陽性； 被檢樣品的矯正OD值小于0.200，則為陰性； 被檢樣品的矯正OD值大于0.200，小于0.300，則為可疑。二、豬瘟間接ELISA抗體檢測 1.適用范圍 用于檢測豬血清中豬瘟抗體。 2.檢測試劑 2.1 包被抗原的微孔板 2.2 陰、陽性對照血消 2.3抗豬IgG-HRP結(jié)合物 2.4 20倍濃縮洗滌液 2.5 底物A液、B液 2.6 終止液 2.7 樣品稀釋液 3.檢測步驟 3.1將試劑盒平衡至室溫。 3.2將洗滌液用蒸餾水作20倍稀釋 3.3取預包被的微孔板（根據(jù)樣品多少，可拆開分次使用），用樣品稀釋液將待檢樣品40倍稀釋后加入板孔中，每孔加100uL。陰、陽性對照各設2孔，每孔100uL。另設一空白對照孔，空