24雙向組織蛋白液全過程

1、24cm雙向組織蛋白液全過程蛋白提?。? 將組織用液氮預(yù)冷的砸碎器砸碎，將砸碎的粉末用液氮研磨。加Cocktail蛋白酶抑制劑20ul/ml。（蛋白酶抑制劑=一片蛋白酶抑制劑片+1ml水溶解）2 粉末按照1：10（W/V）加入lysis buffer。先取一部分 lysis 溶解樣品粉末，轉(zhuǎn)入Dounce 勻漿器中。用剩余buffer清洗容器，再轉(zhuǎn)入Dounce 勻漿器中。 裂解液尿素 8M 0.48g，CHAPS 4% 0.04g，DTT 1% 0.1mgTo 1ml3 勻漿，上下10次。 4 樣品放在裝有冰水混合物的燒杯里超聲，21振幅（實際操作振幅最低只能調(diào)到22%）超聲順序：累計超聲6

2、0秒，超1秒，停1秒(pulse on 0.2 off 2)。 用前用后要用HCl、NaOH清洗，再用純水超聲5 室溫提取30分鐘6 離心，40000g*1hrs 4 °C 離心，小心取出上清，避免取到上層脂肪層。7 測量出蛋白濃度后，按照用途不同，分裝與保存在-80度冰箱。定量：Bradford蛋白定量一BSA稀釋每管BSA稀釋后總體積=50ul (14稀釋到3.5mg/mlBSA，用1倍BSA +3倍裂解液)編號1234563.5mg/mlBSA(ul)048121620Lysis(ul)201612840ddH2O(ul)303030303030標(biāo)準(zhǔn)蛋白濃度00.280.560

3、.841.121.40樣品稀釋（樣品稀釋前總量>9ul）每管樣品稀釋后總體積=50ul編號2.5倍稀釋5倍稀釋10倍稀釋15倍稀釋20倍稀釋估計原樣品濃度范圍mg/ml小于3.5小于7小于14小于21小于28加樣量(ul)2010510/32.5Lysis(ul)0101550/317.5ddH2O(ul) 稀釋2.5倍3030303030鹽酸稀釋：1ml水+10ul濃鹽酸標(biāo)準(zhǔn)蛋白濃度C=(4*3.5)/50=0.281， 20ul稀釋好的鹽酸+5ul稀釋好的樣品或BSA(標(biāo)準(zhǔn)蛋白)=25 µl2，混勻3，每管加入875ul稀釋染液，（共16管時，染液：水=3ml：12ml），

4、 混勻（注意管的容積），放置5min4，595nm檢測第一向等點聚焦24cm：水化上樣緩沖液+（4.5mg）1DTT+（2.254.5ul/40%濃度）0.51兩性電解質(zhì)+（150ug/樣品蛋白濃度）蛋白樣品=450ul（離心）水化上樣緩沖液配制（10ml 分10小管）尿素 8M 4.805gCHAPS 4% 0.4g現(xiàn)加DTT和兩性電解質(zhì)（Bio-lyte）2、從冰箱取出IPG預(yù)制膠條，室溫放置10分鐘3、在聚焦盤中連續(xù)、線性加樣。槽兩端各空1cm。4、去除IPG預(yù)制膠條的保護層。放入聚焦盤，注意正反（膠面與樣品完全接觸）和正負極（正極對正極）。室溫放置3060分鐘。5、在膠條背面均勻、連續(xù)

5、覆蓋礦物油。6、設(shè)置等點聚焦程序。注意正負極（正極對正極）。24cm設(shè)置：聚焦程序：1. 主動水化：50V 13h2.除鹽 200V 快速 30min 除鹽500V 快速 30min 3. 升壓1000V 快速 30min4. 升壓4000V 快速 30min5升壓10，000 線性 3h6. 聚焦 10，000 快速 60，000vh 7. 保持 500V 快速 任意時間7、聚焦結(jié)束直接進行第二向SDS電泳前的平衡，或連帶聚焦盤一塊轉(zhuǎn)到-20冰箱。第二向SDS電泳1、 配置SDS凝膠（不帶梳子）。用MilliQ水或電泳液沖洗，用濾紙吸干。SDS分離膠配置（12% ）15ml的配方 ：水 4.

6、930%丙烯酰胺溶液 6 （150g丙烯酰胺+4g甲叉雙丙烯酰胺>500ml 棕色4度冰箱保存）1.5mol/L Tirs（pH8.8） 3.8 （90.75g+水>400ml 再加1mol/L HCL調(diào)到pH8.8，加水定容500ml 4度保存） 1.5mol/L=90.75g/(0.5L*121.14g/mol)10%SDS 0.15 (10gSDS+水>100ml 常溫保存)10%過硫酸氨（AP） 0.15 (0.1gAP+現(xiàn)用現(xiàn)加水1ml)TEMED 0.006平衡緩沖母液：（500ml 每次取10ml用）尿素 6M 180g甘油 20% 100mlSDS 2% 10

7、gTris-HCL(pH8.8) 0.375M 16.5mlMillliQ 定容到500ml將IPG膠條取出，用MilliQ水沖洗掉大部分的油，再把膠條有塑料板的一面放在濾紙上吸干。然后放入平衡緩沖液：24cm母液10ml+0.1gDTT，1015分鐘取出膠條，用MilliQ水沖洗掉大部分的油，再把膠條有塑料板的一面放在濾紙上吸干。然后放入平衡緩沖液：24cm 母液10ml+0.4g碘乙酰胺，1015分鐘4、剪兩個空白的小濾紙條。一個空白濾紙條放在凝膠板邊緣緊貼SDS凝膠，另一個空白濾紙條點上Marker樣本。5、取出IPG膠條，用MilliQ水沖洗，用濾紙吸干，將膠條上塑料板一面緊貼放置在SDS凝膠的長玻璃板上，短玻璃板向上。6、熔好的低熔點瓊脂糖封膠液準(zhǔn)備好，快速的倒在SDS膠的封口處，迅速地將IPG膠條插入未凝固上的瓊脂糖封膠液中，避免氣泡。瓊脂糖封膠液配制：低熔點瓊脂糖 0.5gTirs 0.303g甘氨酸 1.44gSDS 1ml(10%SDS) 溴酚藍 100ul（1%溴酚藍）MilliQ 定容到1000ml7、待凝固，取出空白濾紙條，換成有Marker樣本的濾紙條。再用瓊脂糖封膠液把空隙