心肌疾病抗ADPATP載體抗體與粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落刺激因子的臨床研究

1、    心肌疾病抗ADP/ATP載體抗體與粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落刺激因子的臨床研究徐靈敏安金斗劉松茂石曼君高鐵錚 【摘要】目的探討病毒性心肌炎(VMC)和擴(kuò)張型心肌病(DCM)的自身免疫發(fā)病機(jī)制。方法 采用免疫印轉(zhuǎn)和放射免疫技術(shù)檢測(cè)了30例VMC、14例DCM患兒血漿中抗心肌線粒體ADP/ATP運(yùn)載蛋白(ANT)抗體和粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落刺激因子(GM-CSF)。結(jié)果VMC和DCM患兒抗ANT抗體和GM-CSF的陽(yáng)性率分別為73%和57%，而25例正常健康兒分別為0和12%(P均< 0.01)，且抗ANT抗體與GM-CSF的血漿水平呈正相關(guān)(r=0.

2、4091，P< 0.05)。結(jié)論小兒VMC和DCM的發(fā)病與心肌的自身免疫損傷有關(guān)，抗ANT抗體和GM-CSF均參與了這一過(guò)程?？笰NT抗體可作為小兒VMC和DCM的一種特異性診斷指標(biāo)。 【關(guān)鍵詞】心肌病，充血性心肌炎抗體粒細(xì)胞巨噬細(xì)胞集落刺激因子 A clinical study of autoantibody against myocardiac adenine nucleotide translocator and granulocyte-macrophage colony stimulating factor in children with myocardiac diseases

3、 Xu Lingmin, An Jindou, Liu Songmao, et al. Department of Pediatrics, The First Affiliated Hospital, Henan Medical University, Zhengzhou 450052 【Abstract 】ObjectiveTo explore the autoimmune pathogenic mechanisms responsible for viral myocarditis (VMC) and dilated cardiomyopathy (DCM). MethodsThe pla

4、sma autoantibody against myocardiac adenine nucleotide translocator (ANT) and granulocyte-macrophage colony stimulating factor (GM-CSF) in children (30 with VMC, 14 with DCM) were studied with western blot and radioimmunoassay. ResultsThe plasma levels of anti-ANT and GM-CSF in patients of VMC and D

5、CM groups were significantly higher than those in the healthy group (73% vs 0 for anti-ANT, P< 0.01; 57% vs 12% for GM-CSF, P< 0.01), and there was a significant correlation between the plasma levels of anti-ANT and GM-CSF (r=0.4091, P< 0.05). ConclusionAnti-ANT and GM-CSF both participate

6、in the pathogenesis of VMC and DCM, and they are involved in the process of autoimmune injury of myocardium. Anti-ANT can be taken as a specific marker for diagnosis of VMC and DCM in children. 【Key words 】Cardiomyopathy, congestiveMyocarditisAntibodiesGranulocyte-macrophage colony stimulating facto

7、r 自身免疫損傷機(jī)制在病毒性心肌炎(viral myocarditis, VMC)和擴(kuò)張型心肌病(dilated cardiomyopathy, DCM)兩種心肌疾病(myocardiac diseases, MCD)發(fā)病中的作用越來(lái)越受到人們的重視?？剐募【€粒體內(nèi)膜ADP/ATP運(yùn)載蛋白(adenine nucleotide translocator, ANT)抗體的檢出支持這一學(xué)說(shuō)1，2。關(guān)于抗ANT抗體的產(chǎn)生機(jī)制及其在人體內(nèi)的作用尚無(wú)定論。粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落刺激因子(granulocyte-macrophage colony-stimulating factor, GM-CSF)不僅是

8、一種活躍的非特異性免疫效應(yīng)因子，而且它還能增強(qiáng)抗體依賴性細(xì)胞介導(dǎo)細(xì)胞毒作用和特異性免疫應(yīng)答3。目前，對(duì)GM-CSF在感染、免疫和病理?yè)p傷中作用的研究剛剛開(kāi)始，關(guān)于GM-CSF與心肌自身免疫損傷的關(guān)系未見(jiàn)報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)檢測(cè)VMC和DCM患兒血漿中抗ANT抗體及GM-CSF水平，探討抗ANT抗體和GM-CSF與VMC和DCM發(fā)病的關(guān)系及其臨床價(jià)值，進(jìn)而探討VMC和DCM的發(fā)病機(jī)制。 對(duì)象及方法 一、對(duì)象 1.MCD組：所有病例均選自1995年12月1996年12月住我院及門診的患兒，均常規(guī)行紅細(xì)胞沉降率、抗鏈球菌溶血素"O"、心肌酶譜、血清柯薩奇病毒聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)檢測(cè)

9、，并作心電圖、X線胸片、心肌核素計(jì)算機(jī)斷層顯影(ECT)及超聲心動(dòng)圖檢查。采血前1個(gè)月內(nèi)均未用過(guò)免疫抑制劑。VMC 30例，男14例，女16例。年齡< 3歲3例，7歲18例，14歲9例，平均7.5±3.0歲。均符合1994年第六屆全國(guó)小兒心臟病會(huì)議所定的"小兒病毒性心肌炎診斷標(biāo)準(zhǔn)"的臨床確診條件4。DCM 14例，男9例，女5例。年齡< 3歲2例，7歲9例，14歲3例，平均6.3±3.8歲。均符合我國(guó)九省市心肌炎協(xié)作組1980年制定的"小兒原發(fā)性心肌病診斷依據(jù)"5，同時(shí)參考WHO/ISFC1995年的標(biāo)準(zhǔn)6。 表1各組之間

10、抗ANT抗體及GM-CSF比較 組別 例數(shù) 抗ANT抗體 GM-CSF 陽(yáng)性數(shù) 陽(yáng)性率(%) 2值 陽(yáng)性數(shù) 陽(yáng)性率(%) 2值 NC組 25 0 0 3 12 4.5×10-10* 13.28* MCD組 (44) (32) (73) (25) (57) VMC 30 20 67 18 60 1.745 0.39 DCM 14 12 86 7 50 *為精確P值；*P< 0.01 2.正常對(duì)照(NC)組：25例。男13例，女12例。年齡< 3歲2例，7歲15例，14歲8例，平均6.6±2.6歲。均為幼兒園及小學(xué)兒童，經(jīng)體檢和實(shí)驗(yàn)室檢查證實(shí)為健康者。 二、方法 每

11、例采血4 ml，分離血漿于-40存放。 1.免疫印轉(zhuǎn)(western blot)法檢測(cè)血漿抗ANT抗體：參照廖玉華等2報(bào)道的方法，首先用十二烷基磺酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)分離心肌線粒體多肽，再將凝膠上的多肽條帶轉(zhuǎn)印到硝酸纖維素膜上，然后利用免疫酶技術(shù)識(shí)別抗ANT抗體陽(yáng)性患者。主要試劑：低分子標(biāo)準(zhǔn)蛋白(上海生化研究所出品)；硝酸纖維素膜(北京化工學(xué)校出品)；羊抗人IgG-HRP(軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院出品)；心肌線粒體抗原成份(同濟(jì)醫(yī)科大學(xué)心血管研究所惠贈(zèng))。 2.放射免疫法(RIA)檢測(cè)血漿GM-CSF:RIA試劑盒系北京華英放免所的新產(chǎn)品，靈敏度2 pg/ml，采用平衡法，基本原理

12、是免疫競(jìng)爭(zhēng)。按試劑盒要求加樣結(jié)束后，混勻后室溫放置15分鐘，3 500 r/min 4離心20分鐘，去上清，在自動(dòng)計(jì)數(shù)器上測(cè)定每管每分鐘脈沖(cpm)數(shù)，按自動(dòng)計(jì)數(shù)器RIA程序直接得出樣品中的GM-CSF濃度。 3.統(tǒng)計(jì)學(xué)處理：實(shí)驗(yàn)結(jié)果用陽(yáng)性率和均數(shù)表示。統(tǒng)計(jì)學(xué)方法包括兩樣本率比較的卡方(2)檢驗(yàn)、計(jì)數(shù)資料的相關(guān)分析，均采用PEMS醫(yī)學(xué)統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行。以P< 0.05為差異有顯著意義。 結(jié)果 一、各組之間抗ANT抗體及GM-CSF陽(yáng)性率比較(表1) 免疫酶識(shí)別顯示：44例VMC和DCM患兒中有32例血漿與豬心肌線粒體的30 000肽發(fā)生免疫反應(yīng)，對(duì)照組均陰性(精確檢驗(yàn)，P=4.5×

13、;10-10)。本法檢測(cè)VMC和DCM患兒抗ANT抗體的敏感性為73%，特異性為100%，假陽(yáng)性為0，假陰性為27%，陽(yáng)性診斷價(jià)值為100%，陰性診斷價(jià)值為68%，診斷指數(shù)為73%±7%。 由于技術(shù)的原因，抗ANT抗體的檢測(cè)，目前只能定性。為了便于相關(guān)分析，放射免疫法測(cè)出的GM-CSF水平也用陽(yáng)性率來(lái)表示。正常對(duì)照組GM-CSF濃度為7.43±3.51 pg/ml，以大于正常對(duì)照組90%單側(cè)上限即(7.43±1.282)×3.51 pg/ml為陽(yáng)性結(jié)果，得出VMC和DCM患兒GM-CSF陽(yáng)性率為57%，正常對(duì)照組為12%(P< 0.01)。 二、抗

14、ANT抗體與GM-CSF的相關(guān)性分析(表2) 表2抗ANT抗體與GM-CSF的相關(guān)分析 GM-CSF 抗ANT(例數(shù)) 抗ANT 陽(yáng)性率(%) + - 合計(jì) + 22 3 25 88 - 10 9 19 53 合計(jì) 32 12 44 73 2=5.14 P0.05；r=0.4091 P0.05 在VMC和DCM患兒中，25例GM-CSF陽(yáng)性患兒抗ANT抗體的陽(yáng)性率為88%(22/25)，19例GM-CSF陰性患兒ANT抗體陽(yáng)性率為53%(10/19)，相關(guān)分析得知抗ANT抗體與GM-CSF的陽(yáng)性率有正相關(guān)性(r=0.4091，P< 0.05)。 討論 一、抗ANT抗體與VMC和DCM的關(guān)

15、系 抗ANT抗體具有器官特異性和疾病特異性，多存在于VMC和DCM患者體內(nèi)，幾乎不存在于冠心病、風(fēng)濕性心臟病、肥厚性及酒精性心肌病和正常人體內(nèi)1，2。有人認(rèn)為VMC和DCM都與病毒感染和免疫損傷有關(guān)，可能是同一病理過(guò)程的不同階段7。體外實(shí)驗(yàn)證實(shí)抗ANT抗體不僅可以影響ANT的功能，導(dǎo)致心肌細(xì)胞能量供求平衡失調(diào)，而且能夠與細(xì)胞膜鈣通道蛋白結(jié)合，引起鈣超負(fù)荷，這兩種途徑都可損傷心肌細(xì)胞。因此可以認(rèn)為，抗ANT抗體的檢出是VMC和DCM發(fā)病的自身免疫損傷機(jī)制的特異性標(biāo)志和重要依據(jù)。本研究發(fā)現(xiàn)，VMC和DCM患兒抗ANT抗體陽(yáng)性率顯著高于正常健康兒，提示小兒VMC和DCM的發(fā)病可能與心肌自身免疫損傷有

16、關(guān)，抗ANT抗體參與了這一過(guò)程，可作為小兒VMC和DCM的特異性診斷指標(biāo)。 傳統(tǒng)觀念認(rèn)為抗心肌抗體的產(chǎn)生繼發(fā)于心肌損傷后隱蔽抗原的釋放，但研究證實(shí)抗ANT抗體多存在于VMC和DCM患者體內(nèi)，幾乎不存在于心肌梗塞及酒精性心肌病等其他原因所致心肌損傷者的體內(nèi)，提示抗ANT抗體不僅僅是心肌損傷的產(chǎn)物1，2。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)VMC和DCM患兒抗ANT抗體的陽(yáng)性率與GM-CSF水平呈正相關(guān)，提示抗ANT抗體的產(chǎn)生與GM-CSF相關(guān)的免疫功能紊亂有關(guān)。 二、GM-CSF與心肌自身免疫損傷的關(guān)系 GM-CSF是由活化的T細(xì)胞、B細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞等多種細(xì)胞分泌和表達(dá)的一種酸性糖蛋白，其作用的靶細(xì)胞除造血細(xì)胞

17、外，還有內(nèi)皮細(xì)胞、單核-巨噬細(xì)胞，嗜中性粒細(xì)胞。這些細(xì)胞在機(jī)體免疫應(yīng)答中均起重要作用，由此決定了GM-CSF廣泛的免疫活性3。實(shí)驗(yàn)證明GM-CSF能夠通過(guò)促進(jìn)這些細(xì)胞分泌腫瘤壞死因子、多種白細(xì)胞介素及干擾素等細(xì)胞因子，擾亂細(xì)胞因子網(wǎng)絡(luò)系統(tǒng)，引起機(jī)體免疫調(diào)節(jié)功能紊亂3。這些細(xì)胞因子異常增高，可誘導(dǎo)機(jī)體細(xì)胞異常表達(dá)主要組織相容性復(fù)合體(human leukocyte antigen complex,HLA)類抗原分子，可能在VMC和DCM的發(fā)病中起重要作用8。 本研究顯示GM-CSF在VMC和DCM患兒體內(nèi)異常升高，提示GM-CSF參與了VMC和DCM的發(fā)病。同時(shí)還發(fā)現(xiàn)VMC和DCM患兒體內(nèi)GM-

18、CSF的異常升高與抗ANT抗體的陽(yáng)性率呈正相關(guān)，提示GM-CSF與心肌的自身免疫損傷過(guò)程有關(guān)。從GM-CSF的非特異性反應(yīng)到特異性的心肌自身免疫損傷，心肌細(xì)胞異常表達(dá)HLA-類分子可能起關(guān)鍵作用。HLA-類抗原的表達(dá)具有高度的組織特異性，正常心臟的心肌細(xì)胞表面沒(méi)有HLA-類抗原分子9。研究還發(fā)現(xiàn)VMC和DCM患者心肌細(xì)胞膜發(fā)生HLA-類抗原分子異常表達(dá)9。HLA-類抗原的異常表達(dá)與自身抗體的產(chǎn)生有關(guān)。只有與HLA-類分子結(jié)合的抗原才能激活免疫應(yīng)答，產(chǎn)生特異性抗體。病毒感染和遺傳易感性在引起機(jī)體細(xì)胞因子網(wǎng)絡(luò)功能紊亂，誘導(dǎo)心肌異常表達(dá)HLA-類分子中起重要作用9。有關(guān)GM-CSF與VMC和DCM發(fā)

19、病的確切機(jī)制還需進(jìn)一步研究。 志謝感謝同濟(jì)醫(yī)科大學(xué)心血管研究所廖玉華教授的幫助和指導(dǎo)。 作者單位：450052 鄭州，河南醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院兒內(nèi)科(徐靈敏現(xiàn)在450052 第三附屬醫(yī)院兒內(nèi)科) 參考文獻(xiàn) 1Schulze K, Becker BF, Schultheiss HP. Antibodies to the ADP/ATP carrier, an autoantigen in myocarditis and dilated cardiomyopathy, penetrate into myocardial cells and disturb energy metabolism in

20、vivo. Circ Res, 1989, 64:179-192. 2廖玉華，涂源淑，李淑莉，等.擴(kuò)張型心肌病抗心肌線粒體ADP/ATP載體自身抗體的研究.中華心血管病雜志，1994，22：43-45. 3Gasson JC. Molecular physiology of granulocyte-macrophage colony-stimulating factor. Blood, 1991, 77:1131-1145. 4李家宜，整理.小兒病毒性心肌炎診斷標(biāo)準(zhǔn).中級(jí)醫(yī)刊，1994，29：60-61. 5九省市心肌炎協(xié)作組.小兒原發(fā)性心肌病診斷依據(jù).中華兒科雜志，1981，19：62-63. 6Richardson P, Mckenna W, Bristow M, et al. Report of the 1995 World Health Organization/International Society and Federation of Cadiolog