水體中反硝化細(xì)菌的分離篩選與初步鑒定

1、邵基倫環(huán)境工程專業(yè)摘要：當(dāng)今世界環(huán)境污染日益加重，尤其是水體污染已嚴(yán)重影響人們的日常生活與身體健康。水污染是多方面的因素綜合作用，而以氨氮的污染最為廣泛且嚴(yán)重。所以控制污水中的氨氮含量是污水處理中的重要內(nèi)容。污水脫氮的基本原理是污水中的含氮有機(jī)物首先經(jīng)過微生物的氨化作用轉(zhuǎn)化為氨，硝化細(xì)菌的硝化作用，將氨氧化為亞硝酸鹽，并繼續(xù)氧化為硝酸鹽。硝酸鹽經(jīng)過反硝化細(xì)菌的反硝化作用轉(zhuǎn)化為氮?dú)獾拳h(huán)節(jié)成分而釋放到大氣中，從而實(shí)現(xiàn)污水脫氮。硝化作用是這一過程中的一個中間環(huán)節(jié)，也是一個重要環(huán)節(jié)。硝化作用是指氨經(jīng)過微生物的作用氧化為亞硝酸和硝酸的過程，由硝化細(xì)菌完成。硝化細(xì)菌是一類好樣化能自養(yǎng)細(xì)菌，包括亞硝化細(xì)菌和

2、硝化細(xì)菌兩個亞群。硝化細(xì)菌能夠利用還原態(tài)無機(jī)氮化合物進(jìn)行自養(yǎng)生長，硝化細(xì)菌的生命活動在污水脫氮中起重要作用。由于硝化細(xì)菌是化能自養(yǎng)菌，其生長速率很慢，因此硝化、亞硝化細(xì)菌的生命活動成為污水脫氮的關(guān)鍵步驟之一。它們能有效降低水體中氨氮及亞硝酸氮的含量，對水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)及環(huán)境保護(hù)具有重要意義。硝化細(xì)菌是生物硝化脫氨中起主要作用的微生物，直接影響硝化效果和生物脫氨的效率。因?yàn)橄趸?xì)菌、亞硝化細(xì)菌在污水脫氮中的特殊意義，對這類微生物的研究受到廣泛關(guān)注。氨和亞硝酸分別是亞硝化菌和硝化菌的唯一能源。對于硝化細(xì)菌來說生長環(huán)境中的溫度對其影響較大，pH值和鹽度的影響相對較小。大多數(shù)硝化細(xì)菌的合適生長溫度為1038

3、 ，高于20時硝化細(xì)菌的活性較高，但超過38消化作用將會消失。當(dāng)環(huán)境氣溫低于 20時，氨的轉(zhuǎn)化會受到影響。一般認(rèn)為，適宜硝化菌和亞硝化菌生長介質(zhì)的pH值分別為6.08.5和6.08.0。水體DOmg/L, mg/L時硝化作用明顯減弱。另外,碳氮比、堿度等對硝化及脫氨均有影響。 本實(shí)驗(yàn)采用人工培養(yǎng)基方法富集培養(yǎng)硝化細(xì)菌研究了富集培養(yǎng)過程中硝化與亞硝化細(xì)菌的結(jié)構(gòu)和性質(zhì)變化。結(jié)果表明，在25-28，pH758.5，D0 2-5mgL，氨氮濃度100150mgL條件下，經(jīng)過19d和15d的富集培養(yǎng)，可以得到硝化速率為4.18mg(NH3-N)-g(MLSS)/h和10.1mg(NH

4、4-N)-g(MLSS)/h的硝化細(xì)菌培養(yǎng)物在這種富集培養(yǎng)過程中，硝化細(xì)菌培養(yǎng)物的污泥色澤和結(jié)構(gòu)、MLSS、SV30、SVI、硝化強(qiáng)度和硝化速率等均出現(xiàn)規(guī)律性變化且隨培養(yǎng)方法不同表現(xiàn)出明顯差異。關(guān)鍵詞：硝化細(xì)菌；反硝化細(xì)菌；脫氮；富集培養(yǎng)；硝化速率；活性污泥；載體Abstract:In today's world environment pollution is aggravating, especially the water pollution has seriously affect People's Daily life and health. Water pollut

5、ion is various factors, and ammonia nitrogen pollution in the most extensive and severe. So control of ammonia nitrogen content is sewage wastewater treatment in the important content. The basic principle of sewage denitrification is the nitrogen organic wastewater by microbes function first ammonia

6、tion into ammonia, nitrifying bacteria of nitrification, will ammonia oxidation as nitrite, and continue to oxidation as nitrate. Nitrate after denitrifying bacteria against nitrification into nitrogen links such as composition and released to the atmosphere, so as to realize the sewage denitrificat

7、ion. Is this a nitrification process of a intermediate link, and also an important link. Nitrification refers to the role of ammonia after microbial oxidation and the process of nitric acid based, by nitrifying bacteria complete. Nitrifying bacteria is a kind of photosynthetic bacteria can fleas, in

8、cluding the nitrifying bacteria and nitrifying bacteria two subsets. Nitrifying bacteria can use YuanTai inorganic nitrogen compounds are also growing autotrophic, nitrifying bacteria in the life activities of sewage denitrification plays an important role. Because of nitrifying bacteria is which ca

9、n sustain bacterium, the growth rate is slow, therefore nitrification, nitrosation bacteria life activities of sewage denitrification become one of the key steps. They can effectively reduce the water in ammonia nitrogen based and nitrogen content, aquaculture and environmental protection to have th

10、e important meaning. dressfying bacteria is biological nitration take off to play a major role ammonia of microbes, directly influence the effect and biological nitrification off the efficiency of ammonia. Because nitrifying bacteria, denitrifying bacteria in the sewage and denitrification of specia

11、l significance, for this kind of microbe study is widely concerned about. Ammonia and respectively based nitrosation bacteria and is the only energy denitrifying bacteria. The essential bacteria growth environment for it to its large effect on the temperature, pH value and salinity influence is rela

12、tively minor. The most essential bacteria growth temperature right for 10 to 38 , 20 higher than when the activity of nitrifying bacteria are higher, but more than 38 digestive function will disappear. When theenvironment temperature less than 20 , ammonia transformation can be affected. Generally,

13、appropriate denitrifying bacteria and the denitrifying bacteria growth medium pH value were 6.0 8.5 and 6.0 8.0. The water DO will affect the good oxygen, anaerobic microbe proportion, most researchers think the concentration shall control in DO 1.0 2.0 mg/L, less than 0.5 mg/L nitrification when si

14、gnificantly weakened. In addition, carbon and nitrogen, basicity on than nitrification and take off all affect the ammonia. This experiment used artificial medium enrichment of nitrifying bacteria cultivation method. The process of cultivation of nitration and enrichment of nitrifying bacteria and t

15、he structure and properties of change. The results show that, in 25 to 28 , pH7.5 8.5, D0 2-5 mg/L, ammonia nitrogen's 100-150 mg/L conditions, after 19 d and 15 d enrichment training, can get nitration rate for 4.18 mg (NH3-N)-g (MLSS) / h and 10.1 mg (NH4-N)-g (MLSS) / h of nitrifying bacteria

16、 culture substance. In this enrichment process of cultivation, nitrifying bacteria culture substance of sludge colour and lustre and structure, MLSS, SV30, SVI, nitrification strength and nitration rate all appear to regular change with different methods and training showed obvious difference. Key w

17、ords ：Nitrifying bacteria; Denitrifying bacteria；Denitrification; Enrichment training; Nitration rate; Activated sludge; carrier 引 言據(jù)2010年環(huán)境狀況公報顯示，我國環(huán)境總體形勢依然十分嚴(yán)峻湖泊（水庫）富營養(yǎng)化問題依然突出，在監(jiān)測營養(yǎng)狀態(tài)的26個湖泊（水庫）中，富營養(yǎng)化狀態(tài)的占42.3水體的富營養(yǎng)化問題主要由水體中的總氮超標(biāo)所引起由于氮元素污染的危害，脫氮已經(jīng)成為水處理和防止氮素危害的重要一步目前普遍認(rèn)為，生物脫氮是水處理中防止氮素危害最經(jīng)濟(jì)有效的方法之一傳統(tǒng)生物

18、脫氮途徑一般包括硝化和反硝化兩個步驟，即在好氧條件下通過自養(yǎng)硝化菌的作用，將水中氨氮（NH4+-N）轉(zhuǎn)化為硝酸氮（NO3-N）或亞硝酸氮（NO2-N），然后在缺氧或厭氧條件下，利用反硝化菌將硝酸氮和亞硝酸氮還原為氮?dú)?，達(dá)到脫氮的目的由于兩個菌的作用條件不同，這兩個過程不能同時發(fā)生，只能序列進(jìn)行近些年來，不斷有好氧反硝化細(xì)菌的分離報道，好氧反硝化現(xiàn)象的出現(xiàn)突破了傳統(tǒng)理論的束縛，使人們對生物脫氮技術(shù)的發(fā)展有了全新的認(rèn)識已有文獻(xiàn)報道一些好氧反硝化細(xì)菌同時具有異養(yǎng)硝化功能，這一發(fā)現(xiàn)為同時硝化反硝化工藝（simultaneous ntrification denitrification，SND）發(fā)展奠定

19、了理論基礎(chǔ)因此異養(yǎng)硝化好氧反硝化菌正成為研究的熱點(diǎn)文獻(xiàn)報道的許多菌屬如：Pseudomonas stutzeri,Thiosphaerpantotropha,Alcaligenes faecalis,Pseudomonas putida等都具有良好的異養(yǎng)硝化好氧反硝化作用,故從我校師琴湖取水，通過富集分離到一株具有好氧反硝化能力的細(xì)菌,該菌株命名為ADB通過形態(tài)觀察和序列分析，對菌株ADB進(jìn)行初步鑒定。初步探討了不同碳源種類、碳氮比、PH值、溫度對菌株ADB脫氨氮作用的影響.為后面的實(shí)現(xiàn)同時硝化反硝化工藝做前期的理論研究同時氮素是我國水體污染和富營養(yǎng)化的主要因素,生物脫氮技術(shù)因其經(jīng)濟(jì)、有效、易

20、操作、無二次污染等特點(diǎn),是近年來的研究熱點(diǎn)之一。傳統(tǒng)的生物脫氮技術(shù)必須經(jīng)過好氧硝化和厭氧反硝化兩個相對獨(dú)立的反應(yīng)過程,好氧反硝化與傳統(tǒng)的厭氧反硝化脫氮相比,具有獨(dú)特的優(yōu)勢:一方面,在有氧條件下進(jìn)行反硝化,硝化和反硝化作用可同時在一個反應(yīng)器中進(jìn)行,設(shè)備與操作成本大幅下降;另一方面,硝化作用的產(chǎn)物可以直接作為反硝化作用的底物,避免抑制硝化作用,使得硝化和反硝化進(jìn)程加劇。現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)一些好氧反硝化細(xì)菌,如Alcaligenes faecalis, Pseudomonasputida和P. stutzeri等,但現(xiàn)有報導(dǎo)的好氧反硝化細(xì)菌反硝化活性都較弱,無法滿足實(shí)際污水的生物脫氮需要,因而高效好氧反硝化細(xì)

21、菌的篩選是一項(xiàng)重要基礎(chǔ)性工作,本研究擬從氮素嚴(yán)重積累的水產(chǎn)養(yǎng)殖水體、污泥及農(nóng)村河道中篩選高效好氧反硝化細(xì)菌,并初步探索篩選獲得的菌株在不同培養(yǎng)條件下的反硝化特性,以期為污水生物脫氮技術(shù)的應(yīng)用提供科學(xué)依據(jù)。1.1 材料和方法 好氧反硝化細(xì)菌ADB菌種為本實(shí)驗(yàn)室從我校師琴湖水中分離獲得反硝化細(xì)菌富集分離培養(yǎng)基成分(g/L)：為Na2HPO4·7H2O為7.9；KH2PO4為1.5；NH4Cl為0.3；Mg2SO4。7H2O為0.1；丁二酸鈉為4.7；KNO3為2；NaNO2為0.5；微量元素溶液為2mL。微量元素溶液成分(g/L)：EDTA為50.0；ZnSO4為2.2；CaC

22、l2為5.5；MnCl2·4H2O為5.06；FeSO4·7H2O為5.0；CuSO4·5H2O為1.57；CoCl2·6H2O為1.61；PH為7.0-7.5 反硝化測定培養(yǎng)基：不添加KNO3 和NH4Cl，初始亞硝酸氮質(zhì)量濃度為100mg/L，其它與反硝化細(xì)菌富集分離培養(yǎng)基基本一致。脫氨氮測定培養(yǎng)基不添加KNO3和NaNO2，(NH4)2SO4代替NH4Cl，(NH4)2SO4和丁二酸鈉含量隨實(shí)驗(yàn)內(nèi)容而變其它與反硝化細(xì)菌富集分離培養(yǎng)基基本一致。1.2 實(shí)驗(yàn)試劑無氨蒸餾水（淮安化工二廠）、氫氧化鈉(AR)(上海試劑四廠）、碘化鉀(AR)(南京化學(xué)試劑一

23、廠)、碘化汞(AR)(浙江臨平化工試劑廠)、酒石酸鉀鈉(AR)(南京化學(xué)試劑一廠)、氯化銨(AR)(浙江臨平化工試劑廠)、鹽酸(GR)、瓊脂(江蘇疾病預(yù)防控制中心微生物試劑廠)1.3 實(shí)驗(yàn)儀器恒溫培養(yǎng)箱(上海虹光化工廠)、滅菌爐(上海泗聯(lián)化工廠)、試管、250ml錐形瓶(南京化學(xué)試劑一廠)、培養(yǎng)皿、分析天平(上?？等A儀器廠)、電爐(上?？等A儀器廠)、酒精燈(上海虹光化工廠)、接種環(huán)、分光光度計(上海虹光化工廠)、電子顯微鏡(上?？等A儀器廠)2.1 反硝化細(xì)菌的分離與鑒定 將采集到的海水樣本分別放在兩個培養(yǎng)皿中，分別加入反硝化菌液體培養(yǎng)基和硝化菌液體培養(yǎng)基，放在24地培養(yǎng)箱中培養(yǎng)5天，

24、然后取培養(yǎng)液在固體培養(yǎng)基上進(jìn)行分區(qū)劃線，得到單菌落，再挑取單菌落進(jìn)行分區(qū)劃線分離。 2.2形態(tài)結(jié)構(gòu)鑒定 （1）將分離得到的單菌落分別接種到肉湯培養(yǎng)基的平板上看其是否生長（硝化細(xì)菌是嚴(yán)格的自養(yǎng)菌，在肉湯培養(yǎng)基上不能生長）。 （2）鏡檢觀察：單染色法 （3）在培養(yǎng)液中加入格利斯試劑，反硝化菌培養(yǎng)液變紅即可判斷為陽性，硝化菌的培養(yǎng)液需比色計算出其亞硝酸根濃度是否降低，才能判斷是否為硝化菌。 2.3細(xì)菌的純培養(yǎng)（搖瓶、發(fā)酵罐） （1）搖瓶培養(yǎng)：將初步鑒定是硝化細(xì)菌的菌落接種到搖瓶中20-28培養(yǎng)，200轉(zhuǎn)/分鐘，每隔五天取樣一次測硝化作用強(qiáng)度

25、和菌濃度。 （2）發(fā)酵培養(yǎng)：將培養(yǎng)5天的種子加入發(fā)酵罐中，于20-28培養(yǎng)，其中pH控制在6.0以上。每隔12小時取樣測亞硝酸根濃度和菌濃度。 反硝化細(xì)菌的鏡檢2.31試劑：生理鹽水、結(jié)晶紫、盧哥氏碘液、碘化鉀、碘片、95%的乙醇、二甲苯、番紅 2.32儀器：光學(xué)顯微鏡(南京化學(xué)試劑一廠)、載玻片、蓋玻片(上海虹光化工廠)3涂片：取干凈的載玻片于實(shí)驗(yàn)臺上，在載玻片的中央滴一滴無菌蒸餾水，將接種環(huán)在火焰上燒紅，待冷卻后從斜面挑取少量培養(yǎng)物與玻片上的水滴混勻后，在載玻片上涂布成一均勻的薄層，涂布面不宜過大。待涂布成一均勻的薄層后，將蓋玻片從一端緩慢的蓋在載玻片上，已完全覆蓋菌群

26、為最佳4染色：由于微生物細(xì)胞含有大量水分，機(jī)體是無色透明的，與周圍背景沒有明顯的反差,必須進(jìn)行染色，使經(jīng)染色后的菌體與背景形成明顯的色差，從而能更清楚地觀察到其形態(tài)和結(jié)構(gòu)。微生物細(xì)胞是由蛋白質(zhì)、核酸等兩性電解質(zhì)及其他化合物組成。所以，微生物細(xì)胞表現(xiàn)出兩性電解質(zhì)的性質(zhì)。細(xì)菌帶負(fù)電荷多，容易與帶正電荷的堿性染料結(jié)合，故用堿性染料染色的較多。用堿性染料從一端用滴管慢慢滲入使樣品變色即可。染色反應(yīng)呈藍(lán)紫色的稱為革蘭氏陽性細(xì)菌，用G+表示；染色反應(yīng)呈紅色的稱為革蘭氏陰性細(xì)菌，用G-表示。5干燥與鏡檢：涂片最好在室溫下使其自然干燥，有時為了使之干得更快些，可將標(biāo)本面向上，手持載玻片一端的兩側(cè)，小心地在酒精

27、燈上高處微微加熱，使水分蒸發(fā)，但切勿緊靠火焰或加熱時間過長，以防標(biāo)本烤枯而變形。最后將準(zhǔn)備好的樣片放在顯微鏡下觀測反硝化細(xì)菌的形態(tài)并且照下細(xì)菌的形態(tài)。見如下圖：采用人工培養(yǎng)基的方式富集培養(yǎng)硝化細(xì)菌對富集培養(yǎng)過程硝化、反硝化細(xì)菌的形態(tài)以及培養(yǎng)系統(tǒng)生物相進(jìn)行觀察和比較分析，結(jié)果見圖1和圖2。在富集培養(yǎng)方法中采用生活污水作為反硝化細(xì)菌的菌種，在富集培養(yǎng)初期的活性污泥絮體內(nèi)可觀察到線蟲、鐘蟲、輪蟲、滴蟲，藻類等多種微生物，隨著培養(yǎng)的進(jìn)行，這些微生物逐漸消失但仍可見少量載體。在富集培養(yǎng)過程中菌落顏色發(fā)生明顯變化，最初為暗褐色，隨著培養(yǎng)的進(jìn)行顏色運(yùn)漸變淺，尤其是第16-19d時變化更為明顯。在添加載體的硝

28、化細(xì)菌富集培養(yǎng)方法中，反硝化細(xì)菌生長環(huán)境發(fā)生了較大變化，在富集培養(yǎng)初期培養(yǎng)物呈純向色，隨著富集培養(yǎng)的進(jìn)行顏色逐漸變至淡黃色，尤其是第1012d變化明顯。在培養(yǎng)過程中沒有觀察到原生動物、藻類和微型后生動物的存在。圖1圖24.展望 反硝化細(xì)菌在污水脫氮過程中具有重要的意義，加強(qiáng)對反硝化細(xì)菌的研究對提高污水脫氮水平，不斷改進(jìn)污水處理工藝具有重要的參考意義。近年來，我國對反硝化細(xì)菌進(jìn)行了一些分子水平的研究，還需要不斷深入。第一：加強(qiáng)對硝化語反硝化作用分子生態(tài)學(xué)的研究，即綜合應(yīng)用現(xiàn)代分子生物學(xué)技術(shù)，研究反硝化過程中的微生物生態(tài)結(jié)構(gòu)和生態(tài)機(jī)制，為提高污水的脫氮處理效率提供理論指導(dǎo)。第二：加強(qiáng)反硝化作用微生物的分子生物學(xué)研究，即在理論上闡明硝化微生物在活性污泥中的作用機(jī)制，克隆硝化過程中的相關(guān)酶的基因，通過基因的改造，改善酶對氨的親和力，提高反硝化作用速率和效率，從而達(dá)到較好的污水處理效果。5. 致謝我認(rèn)為要想完成一篇合格的本科畢業(yè)論文，光靠個人的付出還是不夠的。要有來自多方的協(xié)助，有來自老師的關(guān)懷尤其是鄒海明老師對我的悉心指導(dǎo)、同學(xué)的幫助還有大量實(shí)驗(yàn)器材的提供等等。所以我想在此感謝所有為了完成論文而不辭辛苦的老師和同學(xué)們！想大聲對你們說一聲：謝謝！你們辛苦了！6.參考文獻(xiàn)1 Kenji Furukaw