第三章：病毒的增殖

1、1 細(xì)胞細(xì)胞病毒的增殖場(chǎng)所病毒的增殖場(chǎng)所一、胞膜一、胞膜 吸附、侵入、釋放、生物合成吸附、侵入、釋放、生物合成二、胞漿二、胞漿 生物合成、裝配、生物合成、裝配、 形成包涵體形成包涵體三、胞核三、胞核 生物合成、生物合成、 囊膜的獲得、囊膜的獲得、 形成包涵體形成包涵體 動(dòng)物病毒的增殖過(guò)程大致分為動(dòng)物病毒的增殖過(guò)程大致分為 5 5個(gè)主要階段個(gè)主要階段: : 吸附吸附 侵入侵入 脫殼脫殼 病毒成分的合成病毒成分的合成 裝配與釋放裝配與釋放病毒與細(xì)胞表面特異性受體發(fā)生碰病毒與細(xì)胞表面特異性受體發(fā)生碰撞，病毒附著于細(xì)胞受體而引起的撞，病毒附著于細(xì)胞受體而引起的病毒感染的第一階段。病毒感染的第一階段。病

2、毒吸附分兩步進(jìn)行：病毒吸附分兩步進(jìn)行： 可逆吸附：可逆吸附：病毒與細(xì)胞以靜電引力相結(jié)合，病毒與細(xì)胞以靜電引力相結(jié)合，是一種非特異性的吸附。是一種非特異性的吸附。 與細(xì)胞和病毒的濃度成正比；也與溶液中的與細(xì)胞和病毒的濃度成正比；也與溶液中的Ca2+、Mg2+、和和Na+等離子有關(guān)（促進(jìn)或抑制等離子有關(guān)（促進(jìn)或抑制作用）作用）；單純的稀釋或沖洗以及應(yīng)用抗病毒單純的稀釋或沖洗以及應(yīng)用抗病毒血清或高濃度的鹽類(lèi)和一定的血清或高濃度的鹽類(lèi)和一定的pH環(huán)境都可使環(huán)境都可使病毒重新解脫。病毒重新解脫。解脫的病毒具備感染性。解脫的病毒具備感染性。 不可逆吸附：不可逆吸附：病毒蛋白病毒蛋白（吸附蛋白）（吸附蛋白）

3、與細(xì)胞膜表與細(xì)胞膜表面特定蛋白面特定蛋白（細(xì)胞受體）（細(xì)胞受體）的特異性結(jié)合。的特異性結(jié)合。 并非所有的病毒都有這并非所有的病毒都有這2個(gè)階段。個(gè)階段。 o 通過(guò)外力作用使病毒解吸，病毒不再具備感染性。通過(guò)外力作用使病毒解吸，病毒不再具備感染性。o 細(xì)胞表面的特定受體決定了細(xì)胞對(duì)病毒的易感性細(xì)胞表面的特定受體決定了細(xì)胞對(duì)病毒的易感性o 不同病毒完成吸附所需時(shí)間不一樣，但大多數(shù)病不同病毒完成吸附所需時(shí)間不一樣，但大多數(shù)病毒可以在毒可以在1h之內(nèi)完成吸附過(guò)程之內(nèi)完成吸附過(guò)程l 病毒不可逆地吸附于細(xì)胞受體后，病病毒不可逆地吸附于細(xì)胞受體后，病毒以毒以核酸或核衣殼或病毒顆粒核酸或核衣殼或病毒顆粒等形式

4、進(jìn)入等形式進(jìn)入細(xì)胞的過(guò)程。細(xì)胞的過(guò)程。 1無(wú)囊膜噬菌體無(wú)囊膜噬菌體 利用尾部的溶菌酶部分破壞細(xì)菌細(xì)胞利用尾部的溶菌酶部分破壞細(xì)菌細(xì)胞壁，尾管刺入細(xì)胞，將病毒核酸注入細(xì)胞，壁，尾管刺入細(xì)胞，將病毒核酸注入細(xì)胞，衣殼留在細(xì)胞外衣殼留在細(xì)胞外2有囊膜的噬菌體有囊膜的噬菌體 機(jī)理仍不清楚機(jī)理仍不清楚其侵入細(xì)胞的方式主要有三種：其侵入細(xì)胞的方式主要有三種：1由攜帶有病毒的介體（主要是具有吸口器的昆由攜帶有病毒的介體（主要是具有吸口器的昆蟲(chóng)）在植物上取食，或以其它方式將病毒帶入細(xì)胞；蟲(chóng)）在植物上取食，或以其它方式將病毒帶入細(xì)胞；2通過(guò)自然或人為的原因造成的植物細(xì)胞壁上的通過(guò)自然或人為的原因造成的植物細(xì)胞壁

5、上的傷口進(jìn)入細(xì)胞：傷口進(jìn)入細(xì)胞：大多數(shù)實(shí)驗(yàn)室采用的感染方式。大多數(shù)實(shí)驗(yàn)室采用的感染方式。3通過(guò)植物細(xì)胞與外界環(huán)境溝通的胞外連絲和溝通過(guò)植物細(xì)胞與外界環(huán)境溝通的胞外連絲和溝通兩個(gè)相鄰細(xì)胞的原生質(zhì)體的胞間連絲進(jìn)入細(xì)胞通兩個(gè)相鄰細(xì)胞的原生質(zhì)體的胞間連絲進(jìn)入細(xì)胞1、細(xì)胞吞飲病毒：、細(xì)胞吞飲病毒：e.g 多瘤病毒多瘤病毒2、病毒直接轉(zhuǎn)入胞漿（跨膜移位）：、病毒直接轉(zhuǎn)入胞漿（跨膜移位）： e.g. 小小RNA病毒病毒3、病毒囊膜同細(xì)胞膜融合：由病毒的具有、病毒囊膜同細(xì)胞膜融合：由病毒的具有細(xì)胞融合活性的包膜糖蛋白介導(dǎo)細(xì)胞融合活性的包膜糖蛋白介導(dǎo) e.g. 副粘病毒的副粘病毒的F糖蛋白，單純皰疹病糖蛋白，單

6、純皰疹病毒的毒的gB糖蛋白，流感病毒。糖蛋白，流感病毒。 脫殼是病毒侵入細(xì)胞后，病毒的包膜或脫殼是病毒侵入細(xì)胞后，病毒的包膜或殼體去除而病毒核酸釋放出來(lái)的過(guò)程，包括殼體去除而病毒核酸釋放出來(lái)的過(guò)程，包括脫囊膜和脫衣殼兩個(gè)過(guò)程。脫囊膜和脫衣殼兩個(gè)過(guò)程。噬菌體的脫殼與侵入一起發(fā)生；噬菌體的脫殼與侵入一起發(fā)生；植物病毒脫殼方式了解較少；植物病毒脫殼方式了解較少；動(dòng)物病毒由于不同的結(jié)構(gòu)類(lèi)型和不同的侵入動(dòng)物病毒由于不同的結(jié)構(gòu)類(lèi)型和不同的侵入方式，脫殼過(guò)程較為復(fù)雜：方式，脫殼過(guò)程較為復(fù)雜：1、呼腸孤病毒呼腸孤病毒，并不發(fā)生完全的脫殼，以，并不發(fā)生完全的脫殼，以?xún)?nèi)吞方式進(jìn)入細(xì)胞后，吞噬泡與溶酶體結(jié)內(nèi)吞方式進(jìn)

7、入細(xì)胞后，吞噬泡與溶酶體結(jié)合形成次級(jí)溶酶體，病毒外殼中近合形成次級(jí)溶酶體，病毒外殼中近50%的的殼體被溶酶體中的蛋白酶水解，余下的殼殼體被溶酶體中的蛋白酶水解，余下的殼體與病毒核心形成亞病毒顆粒，病毒的基體與病毒核心形成亞病毒顆粒，病毒的基因組的轉(zhuǎn)錄均在亞病毒顆粒內(nèi)進(jìn)行。因組的轉(zhuǎn)錄均在亞病毒顆粒內(nèi)進(jìn)行。2、有些在細(xì)胞核內(nèi)增殖的有些在細(xì)胞核內(nèi)增殖的DNA病毒病毒，如，如乳乳多空病毒、腺病毒和皰疹病毒，多空病毒、腺病毒和皰疹病毒，其核衣殼其核衣殼在未被完全脫殼的情況下就進(jìn)入細(xì)胞核在未被完全脫殼的情況下就進(jìn)入細(xì)胞核3、口蹄疫病毒口蹄疫病毒可能就在細(xì)胞膜上脫掉衣殼，可能就在細(xì)胞膜上脫掉衣殼，病毒核酸直

8、接進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)。病毒核酸直接進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)。 4、痘病毒：較為特殊、痘病毒：較為特殊 外層囊膜外層囊膜在胞膜或吞飲泡膜上被融合在胞膜或吞飲泡膜上被融合,病毒核心進(jìn)入胞漿內(nèi)，核心借助自身衣殼病毒核心進(jìn)入胞漿內(nèi)，核心借助自身衣殼上的依賴(lài)上的依賴(lài)DNA的的RNA聚合酶合成聚合酶合成mRNA，進(jìn)一步譯制出一些早期蛋白質(zhì)，這些蛋白進(jìn)一步譯制出一些早期蛋白質(zhì)，這些蛋白質(zhì)中有質(zhì)中有脫殼酶，脫殼酶，該酶反過(guò)來(lái)幫助病毒核心該酶反過(guò)來(lái)幫助病毒核心進(jìn)一步脫殼。進(jìn)一步脫殼。隱蔽期（晦暗期）：隱蔽期（晦暗期）：從侵入細(xì)胞的病毒粒從侵入細(xì)胞的病毒粒子消失開(kāi)始，到新的病毒粒子出現(xiàn)為止子消失開(kāi)始，到新的病毒粒子出現(xiàn)為止的一段時(shí)間。

9、的一段時(shí)間。痘病毒痘病毒10h，脊髓灰質(zhì)炎病毒脊髓灰質(zhì)炎病毒24h 病毒核酸的復(fù)制和蛋白質(zhì)的合成可以分成幾病毒核酸的復(fù)制和蛋白質(zhì)的合成可以分成幾個(gè)連續(xù)階段：個(gè)連續(xù)階段：1. mRNA的早期轉(zhuǎn)錄的早期轉(zhuǎn)錄2. mRNA的早期翻譯的早期翻譯早期蛋白質(zhì)早期蛋白質(zhì)包括：包括：1） 酶：在病毒的核酸復(fù)制、晚期轉(zhuǎn)錄和晚期翻譯酶：在病毒的核酸復(fù)制、晚期轉(zhuǎn)錄和晚期翻譯中發(fā)揮作用中發(fā)揮作用2）其它蛋白質(zhì)（功能蛋白質(zhì)）：參與改變或抑制）其它蛋白質(zhì)（功能蛋白質(zhì)）：參與改變或抑制宿主細(xì)胞大分子合成（影響細(xì)胞正常生物合成）宿主細(xì)胞大分子合成（影響細(xì)胞正常生物合成）。3病毒核酸的復(fù)制病毒核酸的復(fù)制 病毒核酸及其轉(zhuǎn)錄和復(fù)制

10、分為病毒核酸及其轉(zhuǎn)錄和復(fù)制分為6個(gè)個(gè)基本類(lèi)型基本類(lèi)型第一類(lèi)病毒的核酸復(fù)制第一類(lèi)病毒的核酸復(fù)制1）雙鏈）雙鏈DNA病毒：呈半保病毒：呈半保留 型 復(fù) 制留 型 復(fù) 制（PRV）第二類(lèi)病毒的核酸復(fù)制第二類(lèi)病毒的核酸復(fù)制+2）單鏈）單鏈DNA病毒（病毒（PPV）第三類(lèi)病毒的核酸復(fù)制第三類(lèi)病毒的核酸復(fù)制3）雙鏈）雙鏈RNA病毒病毒（IBDV）保留型復(fù)制：保留型復(fù)制：指母指母代雙鏈在復(fù)制子鏈代雙鏈在復(fù)制子鏈過(guò)程中，一方面產(chǎn)過(guò)程中，一方面產(chǎn)生子鏈，一方面母生子鏈，一方面母鏈又重新結(jié)合，結(jié)鏈又重新結(jié)合，結(jié)果在產(chǎn)生的兩個(gè)子果在產(chǎn)生的兩個(gè)子代中，一個(gè)仍是母代中，一個(gè)仍是母代原來(lái)的雙鏈。代原來(lái)的雙鏈。第四類(lèi)病毒的

11、核酸復(fù)制第四類(lèi)病毒的核酸復(fù)制4）單股正鏈）單股正鏈RNA病毒病毒（FMDV）第五類(lèi)病毒的核酸復(fù)第五類(lèi)病毒的核酸復(fù)制制5）單股負(fù)鏈）單股負(fù)鏈RNA病毒病毒（NDV） 第六類(lèi)病毒的核酸復(fù)制第六類(lèi)病毒的核酸復(fù)制6）反轉(zhuǎn)錄病毒）反轉(zhuǎn)錄病毒（HIV）4mRNA的再度轉(zhuǎn)錄（晚期轉(zhuǎn)錄）的再度轉(zhuǎn)錄（晚期轉(zhuǎn)錄） 在新合成的在新合成的RNA聚合酶的作用下，由母代病聚合酶的作用下，由母代病毒和子代病毒的毒和子代病毒的DNA進(jìn)一步轉(zhuǎn)錄出第二批進(jìn)一步轉(zhuǎn)錄出第二批mRNA。某些某些RNA 病毒則仍由病毒則仍由RNA直接轉(zhuǎn)錄直接轉(zhuǎn)錄5mRNA的再度譯制（晚期翻譯）的再度譯制（晚期翻譯） 晚期蛋白，包括病毒衣殼蛋白以及病毒編

12、碼晚期蛋白，包括病毒衣殼蛋白以及病毒編碼的其它蛋白。的其它蛋白。1裝配裝配：新合成的病毒核酸和病毒蛋白在感染新合成的病毒核酸和病毒蛋白在感染細(xì)胞內(nèi)組裝成完整的病毒顆粒的過(guò)程。細(xì)胞內(nèi)組裝成完整的病毒顆粒的過(guò)程。 無(wú)囊膜病毒殼體與核酸結(jié)合形成的核衣殼無(wú)囊膜病毒殼體與核酸結(jié)合形成的核衣殼即為成熟的病毒；囊膜病毒需要在核衣殼外加上即為成熟的病毒；囊膜病毒需要在核衣殼外加上包膜。包膜。 病毒的裝配效率很低，往往只有不到病毒的裝配效率很低，往往只有不到50%的子代病毒成份能組裝成完整的病毒粒子。的子代病毒成份能組裝成完整的病毒粒子。裝配的機(jī)制：裝配的機(jī)制：a. 自我組裝（大多數(shù)病毒）：自我組裝（大多數(shù)病毒

13、）：b.指導(dǎo)裝配：需要病毒基因組編碼的非結(jié)指導(dǎo)裝配：需要病毒基因組編碼的非結(jié)構(gòu)蛋白（形態(tài)發(fā)生因子）的腳手架作用構(gòu)蛋白（形態(tài)發(fā)生因子）的腳手架作用或蛋白質(zhì)水解的切割作用?；虻鞍踪|(zhì)水解的切割作用。2釋放釋放 新形成的子代病毒粒子由細(xì)胞內(nèi)到細(xì)新形成的子代病毒粒子由細(xì)胞內(nèi)到細(xì)胞外的過(guò)程。胞外的過(guò)程。1） 細(xì)胞自身的溶解將病毒釋放出來(lái)細(xì)胞自身的溶解將病毒釋放出來(lái)2） 不發(fā)生明顯細(xì)胞病變的病毒的釋放方式，目不發(fā)生明顯細(xì)胞病變的病毒的釋放方式，目前還不十分清楚。前還不十分清楚。 3）?。┬NA 病毒合成速度極快，病毒粒子病毒合成速度極快，病毒粒子在胞漿內(nèi)大量積聚，在細(xì)胞死亡之前，在胞漿內(nèi)大量積聚，在細(xì)胞死

14、亡之前，就可脹破細(xì)胞、釋放病毒。就可脹破細(xì)胞、釋放病毒。4）有囊膜病毒的釋放過(guò)程也就是病毒衣殼）有囊膜病毒的釋放過(guò)程也就是病毒衣殼獲得囊膜的過(guò)程。獲得囊膜的過(guò)程。5）皰疹病毒很少釋出于細(xì)胞外，而是通過(guò)）皰疹病毒很少釋出于細(xì)胞外，而是通過(guò)細(xì)胞間橋或融合細(xì)胞而傳播。細(xì)胞間橋或融合細(xì)胞而傳播。1大多數(shù)大多數(shù)DNA 病毒：皰疹病毒、腺病毒、乳多病毒：皰疹病毒、腺病毒、乳多空病毒在胞核內(nèi)合成空病毒在胞核內(nèi)合成DNA，裝配過(guò)程亦在胞核裝配過(guò)程亦在胞核中進(jìn)行。中進(jìn)行。2DNA 病毒中的痘病毒和虹彩病毒在胞漿內(nèi)合病毒中的痘病毒和虹彩病毒在胞漿內(nèi)合成病毒成病毒 DNA，其裝配也在胞漿內(nèi)完成。其裝配也在胞漿內(nèi)完成

15、。3RNA 病毒均在胞漿內(nèi)增殖。病毒均在胞漿內(nèi)增殖。一定義一定義非增殖性感染：非增殖性感染：指病毒在感染細(xì)胞內(nèi)合成指病毒在感染細(xì)胞內(nèi)合成了某些甚至全部的病毒成分，但不能裝了某些甚至全部的病毒成分，但不能裝配成完整的具有感染性的子代病毒粒子配成完整的具有感染性的子代病毒粒子的現(xiàn)象，稱(chēng)為非增殖性感染（的現(xiàn)象，稱(chēng)為非增殖性感染（non-productive infection)或流產(chǎn)感染或流產(chǎn)感染(abortive infection) 缺損病毒：缺損病毒：在感染細(xì)胞內(nèi)不能形成成熟病在感染細(xì)胞內(nèi)不能形成成熟病毒粒子的病毒。缺損病毒往往由于病毒毒粒子的病毒。缺損病毒往往由于病毒基因組中一個(gè)或一個(gè)以上在

16、病毒復(fù)制過(guò)基因組中一個(gè)或一個(gè)以上在病毒復(fù)制過(guò)程中較為重要的基因喪失了功能，導(dǎo)致程中較為重要的基因喪失了功能，導(dǎo)致病毒復(fù)制不能進(jìn)行。病毒復(fù)制不能進(jìn)行。1 1依賴(lài)輔助病毒的缺損病毒依賴(lài)輔助病毒的缺損病毒 1） 干擾缺損（干擾缺損（defective interfering, DI）病毒：病毒：在在病毒感染時(shí)產(chǎn)生的一類(lèi)亞基因組缺失突變體。它們病毒感染時(shí)產(chǎn)生的一類(lèi)亞基因組缺失突變體。它們因失去了其親代病毒基因組中的復(fù)制必需片段，所因失去了其親代病毒基因組中的復(fù)制必需片段，所以不能單獨(dú)進(jìn)行復(fù)制，而必需在其同型的完全病毒以不能單獨(dú)進(jìn)行復(fù)制，而必需在其同型的完全病毒（標(biāo)準(zhǔn)病毒）的輔助下，由完全病毒提供（標(biāo)準(zhǔn)

17、病毒）的輔助下，由完全病毒提供DI顆粒已顆粒已喪失的、但又為復(fù)制所必需的基因功能才能復(fù)制。喪失的、但又為復(fù)制所必需的基因功能才能復(fù)制。 標(biāo)準(zhǔn)病毒（標(biāo)準(zhǔn)病毒（standard virus,SV）：）：與與DI顆顆粒相關(guān)的完全病毒。粒相關(guān)的完全病毒。2）衛(wèi)星病毒：）衛(wèi)星病毒：存在于自然界中的一種絕存在于自然界中的一種絕對(duì)的缺損病毒，基因組與輔助病毒的對(duì)的缺損病毒，基因組與輔助病毒的DNA或或RNA 沒(méi)有任何的同源性。沒(méi)有任何的同源性。 e.g. e.g. 細(xì)小病毒科中的腺聯(lián)病毒只能在有細(xì)小病毒科中的腺聯(lián)病毒只能在有腺病毒或皰疹病毒感染的細(xì)胞內(nèi)復(fù)制。腺病毒或皰疹病毒感染的細(xì)胞內(nèi)復(fù)制。2偽裝性缺損病毒

18、：偽裝性缺損病毒：指具有病毒衣殼及完整外表，但衣殼內(nèi)的病毒核酸被指具有病毒衣殼及完整外表，但衣殼內(nèi)的病毒核酸被細(xì)胞源性的核酸完全所取代的缺損病毒。主要見(jiàn)于多細(xì)胞源性的核酸完全所取代的缺損病毒。主要見(jiàn)于多瘤病毒和噬菌體。瘤病毒和噬菌體。3條件性缺損病毒：條件性缺損病毒：在一定條件下能增殖，但在其它條件下發(fā)生流產(chǎn)感染。在一定條件下能增殖，但在其它條件下發(fā)生流產(chǎn)感染。 如：溫度敏感突變株，宿主易感突變株如：溫度敏感突變株，宿主易感突變株三、三、 組織細(xì)胞培養(yǎng)組織細(xì)胞培養(yǎng)（一）細(xì)胞（一）細(xì)胞原代細(xì)胞：原代細(xì)胞：應(yīng)用胰酶等分散劑將動(dòng)物組織消化成單應(yīng)用胰酶等分散劑將動(dòng)物組織消化成單個(gè)細(xì)胞懸液，適當(dāng)洗滌以后

19、，加入營(yíng)養(yǎng)液，通常即個(gè)細(xì)胞懸液，適當(dāng)洗滌以后，加入營(yíng)養(yǎng)液，通常即可使其貼附于玻璃瓶壁上，并生長(zhǎng)增殖。可使其貼附于玻璃瓶壁上，并生長(zhǎng)增殖。繼代細(xì)胞：繼代細(xì)胞：將原代細(xì)胞從玻璃瓶壁上消化下來(lái)再作將原代細(xì)胞從玻璃瓶壁上消化下來(lái)再作培養(yǎng)。培養(yǎng)。傳代細(xì)胞：傳代細(xì)胞：由于遺傳突變或者在理化學(xué)物質(zhì)和致由于遺傳突變或者在理化學(xué)物質(zhì)和致瘤病毒的作用下，組織培養(yǎng)細(xì)胞中有時(shí)出現(xiàn)惡性瘤病毒的作用下，組織培養(yǎng)細(xì)胞中有時(shí)出現(xiàn)惡性變細(xì)胞，也就是癌變細(xì)胞，這種病變細(xì)胞具有很變細(xì)胞，也就是癌變細(xì)胞，這種病變細(xì)胞具有很高的增殖勢(shì)能，而且?guī)缀蹩梢詿o(wú)限地傳代。高的增殖勢(shì)能，而且?guī)缀蹩梢詿o(wú)限地傳代。優(yōu)點(diǎn)：優(yōu)點(diǎn)：1) 可以無(wú)限的傳代?？?/p>

20、以無(wú)限的傳代。2) 很多細(xì)胞系對(duì)病毒很敏感。很多細(xì)胞系對(duì)病毒很敏感。3) 某些傳代細(xì)胞系能在懸浮培養(yǎng)條件下培養(yǎng)，適某些傳代細(xì)胞系能在懸浮培養(yǎng)條件下培養(yǎng)，適合病毒抗原的大量生產(chǎn)。合病毒抗原的大量生產(chǎn)。4) 生長(zhǎng)旺盛，繁殖快速，對(duì)營(yíng)養(yǎng)條件不苛刻。生長(zhǎng)旺盛，繁殖快速，對(duì)營(yíng)養(yǎng)條件不苛刻。缺點(diǎn)：缺點(diǎn)：在傳代過(guò)程中遭到支原體和病毒的污染。在傳代過(guò)程中遭到支原體和病毒的污染。(二二) 細(xì)胞分散劑細(xì)胞分散劑胰酶胰酶 使精氨酸或賴(lài)氨酸的羧基和其他氨基使精氨酸或賴(lài)氨酸的羧基和其他氨基酸的氨基之間的多肽鏈發(fā)生水解，導(dǎo)致細(xì)胞酸的氨基之間的多肽鏈發(fā)生水解，導(dǎo)致細(xì)胞間質(zhì)水解而使細(xì)胞或組織塊消化為分散的單間質(zhì)水解而使細(xì)胞或

21、組織塊消化為分散的單個(gè)細(xì)胞。個(gè)細(xì)胞。乙二胺四乙酸二鈉（乙二胺四乙酸二鈉（EDTA） 與鈣、鎂離子與鈣、鎂離子結(jié)合結(jié)合灰色鏈絲菌酶灰色鏈絲菌酶 （三）（三） 細(xì)胞的保存細(xì)胞的保存細(xì)胞培養(yǎng)物的常溫短期保存細(xì)胞培養(yǎng)物的常溫短期保存1）實(shí)驗(yàn)室中細(xì)胞短期保存）實(shí)驗(yàn)室中細(xì)胞短期保存 將已長(zhǎng)成單層的細(xì)胞換液后置室溫或?qū)⒁验L(zhǎng)成單層的細(xì)胞換液后置室溫或20-22下避下避 光保存，可達(dá)光保存，可達(dá)15天以上。天以上。 將細(xì)胞培養(yǎng)溫度由將細(xì)胞培養(yǎng)溫度由37降至降至32甚至甚至30，可隔可隔15-30天傳代一次。天傳代一次。2）長(zhǎng)途運(yùn)送細(xì)胞培養(yǎng)物的保存）長(zhǎng)途運(yùn)送細(xì)胞培養(yǎng)物的保存 取剛剛長(zhǎng)成單層的細(xì)胞培養(yǎng)物，棄去營(yíng)取剛

22、剛長(zhǎng)成單層的細(xì)胞培養(yǎng)物，棄去營(yíng)養(yǎng)液，加入維持液至滿(mǎn)瓶，勿使培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)存養(yǎng)液，加入維持液至滿(mǎn)瓶，勿使培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)存留空氣，隨后用橡皮塞緊塞瓶口，并作適當(dāng)留空氣，隨后用橡皮塞緊塞瓶口，并作適當(dāng)?shù)陌?。運(yùn)輸途中的溫度應(yīng)保持在的包扎。運(yùn)輸途中的溫度應(yīng)保持在15-25左左右，到達(dá)目的地后，置右，到達(dá)目的地后，置37培養(yǎng)培養(yǎng)1天，再行天，再行傳代。傳代。. 細(xì)胞培養(yǎng)物的長(zhǎng)期保存細(xì)胞培養(yǎng)物的長(zhǎng)期保存 將剛長(zhǎng)滿(mǎn)單層的細(xì)胞，按細(xì)胞傳代方法消化吹散將剛長(zhǎng)滿(mǎn)單層的細(xì)胞，按細(xì)胞傳代方法消化吹散后，裝入離心管中，后，裝入離心管中，3000r/min 5-10min，用適量的含用適量的含有有20%犢牛血清、犢牛血清、10%二甲亞砜（二甲亞砜（DMSO）的的DMEM懸浮，分裝于細(xì)胞凍存管中，置懸浮，分裝于細(xì)胞凍存管中，置4 2h，-20 2h，-70過(guò)夜，然后置于液氮中長(zhǎng)期保存?；蛟谝旱?dú)庀噙^(guò)夜，然后置于液氮中長(zhǎng)期保存?；蛟谝旱?dú)庀嘀羞^(guò)夜，然后置于液氮中長(zhǎng)期保存?；蛑糜谝旱?dú)庀嘀羞^(guò)夜，然后置于液氮中長(zhǎng)期保存。或置于液氮?dú)庀嘀?，按中，?min 1cm的速度逐漸往下