大孔樹脂純化藤茶黃酮及主要成分結(jié)構(gòu)鑒定

1、基礎(chǔ)研究食品科學(xué)2009, Vol. 30, No. 0951大孔樹脂純化藤茶黃酮及主要成分結(jié)構(gòu)鑒定陳玉瓊，李安琪，孟燕（農(nóng)業(yè)部亞熱帶農(nóng)業(yè)資源與環(huán)境重點(diǎn)開放實(shí)驗(yàn)室，華中農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝林學(xué)學(xué)院，湖北武漢）摘要：選用種大孔樹脂對(duì)藤茶黃酮進(jìn)行了靜態(tài)吸附與解吸附實(shí)驗(yàn)。結(jié)果表明，號(hào)樹脂適宜于藤茶黃酮的分離純化，對(duì)黃酮的吸附量可達(dá)，解析率達(dá)到。通過動(dòng)態(tài)吸附實(shí)驗(yàn)對(duì)號(hào)樹脂有關(guān)參數(shù)進(jìn)行了優(yōu)化。結(jié)果表明，×層析柱，黃酮加樣濃度，加樣體積為，流速，用的乙醇進(jìn)行洗脫，可達(dá)到較好的洗脫與純化效果，黃酮的洗脫率可達(dá)左右，洗脫出的黃酮純度達(dá)左右。進(jìn)一步利用重結(jié)晶方法得到較純的產(chǎn)品，經(jīng)紫外可見光譜、紅外光譜、分析表明

2、，黃酮中的主要成分為二氫楊梅素。關(guān)鍵詞：藤茶；黃酮；大孔吸附樹脂；純化；結(jié)構(gòu)，（，）：，×，：；中圖分類號(hào)：文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：文章編號(hào)：（）大孔吸附樹脂是世紀(jì)年代發(fā)展起來的一類吸附分離材料，由于其自身具有多孔結(jié)構(gòu)，可根據(jù)空隙大小對(duì)化學(xué)成分進(jìn)行機(jī)械篩分，同時(shí)又帶有極性基團(tuán)，可通過范德華力和形成氫鍵對(duì)極性相近的化學(xué)成分進(jìn)行選擇性吸附。黃酮類化合物多含羥基、糖苷鍵等極性基團(tuán)，易與大孔樹脂通過范德華力和氫鍵而被吸附，經(jīng)適當(dāng)溶劑（洗脫）解吸附而獲得有效的分離。因此，廣泛應(yīng)用于黃酮類化合物的分離純化。藤茶（），為我國特有茶用、藥用植物，富含二氫楊梅素等黃酮類物質(zhì)，具有收稿日期：多種保健功能。有關(guān)藤茶黃

3、酮的的純化大多采用水提重結(jié)晶法。張友勝曾采用大孔樹脂吸附雜質(zhì)法來間接純化藤茶中的二氫楊梅素。因此，藤茶黃酮的大孔樹脂純化法還有待深入研究。本實(shí)驗(yàn)選用種大孔樹脂在靜態(tài)吸附實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上篩選一種適合藤茶黃酮純化的大孔樹脂。材料與方法材料與試劑藤茶粗黃酮：取一定量藤茶，按：（）加入石基金項(xiàng)目：農(nóng)業(yè)部農(nóng)業(yè)結(jié)構(gòu)調(diào)整重大技術(shù)研究專項(xiàng)項(xiàng)目（）作者簡介：陳玉瓊（），女，副教授，博士，主要從事茶用植物功能化學(xué)功能及化學(xué)及綜合利用研究。52 2009, Vol. 30, No. 09食品科學(xué)二氫楊梅素的純化及結(jié)構(gòu)鑒定基礎(chǔ)研究油醚回流兩次，每次，去石油醚，晾干后加入的含水乙醇，下回流提取，趁熱抽濾，濾液于下真空濃縮，

4、冷凍干燥得粗黃酮粉。號(hào)、大孔樹脂滄州寶恩化工廠；、大孔樹脂天津海光化工有限公司；、大孔樹脂南開大學(xué)化工廠。二氫楊梅素由實(shí)驗(yàn)室自制，經(jīng)鑒定純度為；甲醇（色譜純）公司；其他試劑為國產(chǎn)分析純。儀器與設(shè)備橫流泵、分步收集儀上海儀器廠；旋轉(zhuǎn)濃縮儀上海亞榮生化儀器廠；冷凍干燥機(jī)美國公司；傅立葉紅外分光光度計(jì)美國公司；紫外掃描儀美國；（）。方法黃酮含量測定比色法。樹脂的預(yù)處理與再生用乙醇浸泡后用氫氧化鈉溶液浸泡，蒸餾水洗至中性，再用鹽酸溶液浸泡，用蒸餾水洗至中性。靜態(tài)實(shí)驗(yàn)預(yù)處理后的樹脂過濾后吸干表面水，稱取于三角瓶中，加入濃度為的粗黃酮液，避光密封，振蕩，靜置后過濾，收集濾液。濾出的樹脂加一定量的蒸餾水洗滌

5、，合并濾液，測濾液中黃酮含量。濾出的樹脂加的乙醇浸泡后過濾，測濾液的黃酮含量，作為樹脂解吸的黃酮量。原液中黃酮的量（）第一次濾出液黃酮的量（）吸附量（）樹脂的重量（）解吸液中黃酮的總量（）解吸率（）×原液中黃酮的總量（）第一次濾出液黃酮的量（）經(jīng)大孔樹脂初步純化的黃酮用水重結(jié)晶，重結(jié)晶的樣品冷凍干燥，用于紫外、紅外、分析。紅外測定：壓片法。條件：色譜柱：柱（×，）；流動(dòng)相：乙腈：冰乙酸（：，），檢測波長：；進(jìn)樣量，柱溫，流速。條件：離子化條件：毛細(xì)管溫度，噴霧器壓力與流速：，；掃描范圍。轟擊氣體為氦氣，轟擊能力調(diào)節(jié)在。負(fù)離子模式。結(jié)果與分析大孔樹脂對(duì)藤茶黃酮的純化大孔樹脂的

6、選擇用種大孔樹脂預(yù)處理后，進(jìn)行藤茶黃酮的靜態(tài)吸附實(shí)驗(yàn)，測得各種樹脂對(duì)黃酮的吸附與解吸結(jié)果見表。結(jié)果表明，樹脂吸附黃酮效果最好，其吸附黃酮量除與、號(hào)樹脂無顯著差異外，顯著或極顯著高于其他樹脂的黃酮吸附量。其次是和號(hào)樹脂，每克吸附黃酮量都在以上。每種樹脂對(duì)黃酮的解析結(jié)果分析表明，除、兩種樹脂的黃酮解析率較低外，其余種樹脂對(duì)黃酮的解析效果都較好。結(jié)合樹脂對(duì)藤茶黃酮的吸附與解吸附效果，選擇號(hào)樹脂進(jìn)行動(dòng)態(tài)吸附實(shí)驗(yàn)。表不同樹脂對(duì)藤茶黃酮的吸附與解吸結(jié)果Table 1 Adsorption capabilities and desorption rates of 11 kinds ofmacroporous

7、 resins to Ampelopsis grossedentata flavones樹脂號(hào)樹脂對(duì)黃酮吸附量（）黃酮解吸率（）動(dòng)態(tài)實(shí)驗(yàn)取靜態(tài)吸附實(shí)驗(yàn)選出的樹脂，預(yù)處理后濕法裝入×層析柱中，蒸餾水平衡，加入定量的黃酮提取液，先用蒸餾水洗，再用相應(yīng)乙醇溶液洗脫，分部收集，合并含黃酮的部分，冷凍干燥，稱重，得洗脫量和洗脫率并測黃酮含量。洗脫量（）樹脂對(duì)黃酮的洗脫率（）×吸附量（）注：同列不同大寫字母表示在水平差異極顯著；不同小寫字母表示在水平差異顯著。洗脫方式的確定經(jīng)預(yù)處理后的號(hào)樹脂濕法裝柱，層析柱×，待床體平衡后，加入濃度為的粗黃酮液靜置平衡，用蒸餾水以的流速洗脫至

8、檢測無基礎(chǔ)研究食品科學(xué)2009, Vol. 30, No. 0953黃酮流出。洗脫方式：依次用（）、不同濃度的乙醇洗脫，每種濃度洗至檢不出黃酮為止。洗脫方式：從乙醇濃度開始洗脫；洗脫方式：從乙醇濃度開始洗脫；洗脫方式：從乙醇濃度開始洗脫，最后直接用的乙醇洗脫。收集含黃酮的洗脫液，條件下真空濃縮至少量，然后冷凍干燥，稱重并測定黃酮含量。實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表。表乙醇溶液不同洗脫方式藤茶黃酮洗脫率及黃酮純度Table 2 Elution rates and purities of Ampelopsis grossedentateflavones in different ethanol elution wa

9、ys實(shí)驗(yàn)號(hào)黃酮洗脫效果（）洗脫率純度洗脫率純度洗脫率純度洗脫率純度洗脫率純度洗脫用乙醇濃度（）總洗脫率（）率較低，而的洗脫流速黃酮的洗脫率也較低，說明，洗脫流速過低過高都不利于黃酮的洗脫。、的洗脫流速，黃酮洗脫率和黃酮純度都接近，兩者都可選用，在工業(yè)上可選用的流速以提高生產(chǎn)效率。不同加樣濃度的洗脫效果表不同加樣濃度洗脫黃酮效果Table 4 Effects of different concentrations of Ampelopsisgrossedentata flavones on their elution rate and purity加樣濃度（）黃酮洗脫量（）黃酮洗脫率（）黃酮純度

10、（）配制不同濃度的粗黃酮液上柱平衡，調(diào)節(jié)流速為，先用蒸餾水洗脫至檢測無黃酮流出，再用的乙醇以同樣的流速洗脫，收集含黃酮的洗脫液。真空濃縮后冷凍干燥，秤重，測黃酮含量。從表可以看出，隨著加樣濃度的增加，黃酮的洗脫量增加，洗脫、和黃酮的純度也有增加的趨勢，當(dāng)達(dá)到時(shí)，黃酮的洗脫量最高，加樣量為，洗脫的黃酮純度較高，但該濃度的粗黃酮溶解較困難，因此，的加樣濃度較適宜。不同加樣量的洗脫效果表不同加樣量黃酮洗脫結(jié)果Table 5 Effects of different sampling amounts of Ampelopsisgrossedentata flavones on their elutio

11、n rate and purity加樣量（）黃酮洗脫率（）黃酮純度（）黃酮洗脫量（）由表可見，每種方式洗脫的黃酮都主要集中在最開始用的洗脫劑的洗脫液里，以后的洗脫劑洗脫的量都很少，所以，藤茶黃酮不宜分步洗脫。洗脫用乙醇濃度對(duì)藤茶黃酮的洗脫率及洗脫黃酮的純度影響較大。洗脫用乙醇濃度越大，黃酮的洗脫率越高，洗脫出的黃酮純度也越高。乙醇對(duì)黃酮的洗脫率達(dá)最高。乙醇對(duì)黃酮的洗脫率略低于乙醇的洗脫率，但洗脫出的黃酮純度較高，可達(dá)到以上。且乙醇洗脫的黃酮液濃縮干燥方便，回收溶劑容易，因此，用濃度的乙醇作洗脫液可行，也適合工業(yè)化生產(chǎn)。乙醇不同洗脫速度對(duì)黃酮洗脫效果的影響表乙醇不同洗脫流速洗脫藤茶黃酮的結(jié)果Ta

12、ble 3 Effects of different flow rates of 95% ethanol on elutionrate and purity of Ampelopsis grossedentata flavones流速（）黃酮洗脫率（）黃酮純度（）配制濃度的粗黃酮液上柱，調(diào)節(jié)流速為，先用蒸餾水洗脫至檢測無黃酮流出，再用的乙醇以的流速洗脫，收集含黃酮的洗脫液。真空濃縮后冷凍干燥，秤重，測黃酮含量。表表明，的加樣量，黃酮的洗脫率無較大差異，加樣量為時(shí)，洗脫率下降，主要是因加樣量過大，隨水流出的黃酮量增加。各加樣量洗脫出的黃酮純度差異不大。綜合各因素，以加樣量為為宜。藤茶黃酮的進(jìn)一步

13、純化與結(jié)構(gòu)鑒定黃酮紫外可見光譜分析配制濃度為的粗黃酮液上柱靜置平衡，調(diào)節(jié)流速，先用蒸餾水洗脫至檢測無黃酮流出，再用的乙醇以同樣的流速洗脫，收集含黃酮的洗脫液。真空濃縮后冷凍干燥，秤重，測黃酮含量。分析結(jié)果表明（表），洗脫流速對(duì)洗脫黃酮的純度影響不大，但流速為、時(shí)，洗脫時(shí)間長，黃酮洗脫54 2009, Vol. 30, No. 09吸光度波長（）圖黃酮及與AlCl3作用后紫外可見掃描圖食品科學(xué)離子峰強(qiáng)度（×）基礎(chǔ)研究圖黃酮的圖譜Fig.4 MS spectrogram of Ampelopsis grossedentataflavonesFig.1 UV-visible spectru

14、m of Ampelopsis grossedentata flavones-AlCl3 reaction system in methanol solution由圖可知，該物質(zhì)有兩個(gè)吸收帶，在波長處（帶）有最大吸收峰，在左右（帶）有一肩峰。與作用后，帶吸收峰紅移至處。已有分析表明，黃酮類化合物在帶在波長處有強(qiáng)吸收，在帶在波長處有肩峰往往是黃烷酮或雙氫黃酮醇。這類物質(zhì)與作用后，帶吸收峰紅移。黃酮紅外光譜分析色譜圖顯示，在出現(xiàn)單一的色譜峰，說明樣品較純。經(jīng)離子源轟擊后分子離子化，失去一個(gè)質(zhì)子，為，即原分子量為。根據(jù)已有文獻(xiàn)報(bào)道和上述分析結(jié)果，可以基本確定該物質(zhì)為二氫楊梅素。討論大孔吸附樹脂是一類

15、不含離子基團(tuán)的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)高分子聚合物吸附劑，具有吸附性（范德華力和氫鍵）和分子篩（多孔性結(jié)構(gòu)）的作用。大孔吸附樹脂按性質(zhì)分為非極性、弱極性和極性類，可根據(jù)相似相吸原理作為參考選擇樹脂。藤茶黃酮的主要成分為二氫楊梅素、楊透過率（）梅素，此外，還含有少量槲皮素、山萘酚、芹菜素、花旗松素以及他們的衍生物。大多屬中極性物質(zhì)。本實(shí)驗(yàn)所選用的種大孔樹脂都屬極性到弱極性樹脂。靜態(tài)吸附實(shí)驗(yàn)表明，極性的樹脂和對(duì)藤茶黃酮的吸附性最好，但解析率較差，因此，在生產(chǎn)運(yùn)用中會(huì)造成原料損失嚴(yán)重，樹脂污染也較嚴(yán)重，一般不宜選用。弱極性的和樹脂對(duì)藤茶黃酮的解析效果雖然較好，但吸附性較差，也會(huì)造成原料的大量浪費(fèi)。中極性的和號(hào)樹脂吸

16、附和解吸附效果都較好，可考慮作為藤茶黃酮純化的首選樹脂。從所選的號(hào)樹脂動(dòng)態(tài)吸附實(shí)驗(yàn)分析顯示，樹脂對(duì)藤茶黃酮的純化只能達(dá)到左右，黃酮要達(dá)到更高的純度還需依賴其他的純化手段。相關(guān)研究有待進(jìn)一步深入。結(jié)論波數(shù)（）圖黃酮的紅外光譜圖Fig.2 IR-spectrum of Ampelopsis grossedentata flavones由圖可見，波數(shù)有一強(qiáng)吸收峰，以及有吸收峰，這是締合的伸縮振動(dòng)引起。波數(shù)的吸收峰是由引起。、為芳環(huán)振動(dòng)吸收引起。推測為多羥基黃酮類物質(zhì)。黃酮的圖譜從種大孔樹脂中篩選出的號(hào)樹脂對(duì)黃酮有較高的的吸附量和解吸率，適宜于藤茶黃酮的分離，其吸附量可達(dá)，解析率達(dá)到。利用號(hào)樹脂分離藤

17、茶黃酮的適宜參數(shù)為：×規(guī)格的層析柱上樣濃度，加樣量，的乙醇洗脫液，流速，黃酮的洗脫率可達(dá)左右，純度達(dá)左右。經(jīng)號(hào)樹脂純化的黃酮用水進(jìn)一步重結(jié)晶，產(chǎn)品經(jīng)、和分析表明為二氫楊梅素。參考文獻(xiàn)：曹群華，瞿偉菁，李家貴，等大孔樹脂吸附純化沙棘籽渣總黃酮的時(shí)間（）圖黃酮高效液相色譜圖Fig.3 HPLC chromatogram of Ampelopsis grossedentata flavones基礎(chǔ)研究研究中國中藥雜志，（）：食品科學(xué)（）：2009, Vol. 30, No. 0955麻秀萍，蔣朝暉，楊玉琴，等大孔吸附樹脂對(duì)銀杏葉黃酮的吸附研究中國中藥雜志，（）：何琦，及元喬，丁立生，等大孔吸附樹脂銀杏黃酮提取性能研究天然產(chǎn)物研究與開發(fā)，（）：覃潔萍，許學(xué)健，董明姣廣西藤茶中黃酮類成份的提取工藝研究中國現(xiàn)代應(yīng)用藥學(xué)，（）：張友勝，楊偉麗，胡自勇增溫溶解，保溫過柱，溫水解吸提制二氫楊梅素（