聲波提取連翹葉總黃酮與總酚酸的實(shí)驗(yàn)研究

1、聲波提取連翹葉總黃酮與總酚酸的實(shí)驗(yàn)研究    【摘要】     目的確定實(shí)驗(yàn)室超聲波提取連翹葉總黃酮、總酚酸的最佳處理?xiàng)l件。方法采用正交設(shè)計(jì)法對(duì)甲醇濃度（A）、超聲時(shí)間（B）、提取次數(shù)（C）和提取溫度（D）4個(gè)因素進(jìn)行考察，確定最優(yōu)超聲提取條件。結(jié)果因素D和C對(duì)測(cè)定指標(biāo)均有顯著性影響，因素A、B為不顯著因素。結(jié)論以60%甲醇，超聲時(shí)間10 min/次，提取3次，提取溫度45 為最佳超聲提取條件。     【關(guān)鍵詞】  連翹葉； 總黃酮； 總酚酸； 正交實(shí)驗(yàn)

2、； 超聲提取    Ultrasonic Extraction and Content Determination of Total Flavonoids and Total Phenolic Acids from Forsythia suspense LeavesTIAN Su, TANG Longmei, XU Liqin, DING Yuexin, LIU Rujun, MA Li，XUE Peng（Hebei Medical University of Public Health, Shijiazhuang 050017, China）Abstr

3、act：ObjectiveTo ascertain the optimal ultrasonic condition for extraction of total flavonoids and total phenolic acids from Forsythia suspense leaves by orthogonal design. MethodsIn the method of orthogonal test, methanol concentration (60%, 70%, and 80%), ultrasonic time (10 min, 15 min and 20 min)

4、, extraction times (1, 2, and 3) and extraction temperature (5 , 25 , and 45 ) were analyzed, and the best ultrasonic condition was decided.ResultsExtraction temperature and extraction times had significant effect on either total flavonoids and total phenolic acids contents, methanol concentration a

5、nd ultrasonic time were unsignificant factors. ConclusionUltrasonic with 20 fold 60% methanol and three times (10 min each time) at 45 was the optimal condition for extraction of total flavonoids and total phenolic acids from Forsythia suspense leaves.Key words：Forsythia suspense leaves;  

6、 Total flavonoids;   Total phenolic acids;   Orthogonal design;   Ultrasonic extraction    連翹Forsythia suspense（Thunb.）Vahl作為傳統(tǒng)的中草藥，通常是以果實(shí)入藥，具有清熱解毒、消腫散結(jié)之功效1。在我國(guó)的河北和陜西等地，特別是在河北武安縣的長(zhǎng)壽村，使用連翹葉泡茶飲用是當(dāng)?shù)厝藗円恢毖永m(xù)至今的生活習(xí)慣。朱淑云等24研究了陜西產(chǎn)連翹葉沸水粗提取物的抗氧化、抗衰老作用。因此有人推測(cè)，武安縣的長(zhǎng)壽現(xiàn)

7、象可能與連翹葉的清除自由基、抗氧化和延緩衰老作用有關(guān)。    大量的研究證實(shí)多酚類化合物具有良好的清除自由基效果及較強(qiáng)的抗氧化能力5。超聲波提取因其獨(dú)特的提取機(jī)制及優(yōu)于常規(guī)法的提取效果，在中藥化學(xué)成分的提取中顯示出明顯的優(yōu)勢(shì)。但是到目前為止，尚未見(jiàn)超聲技術(shù)應(yīng)用于提取連翹葉多酚的研究報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)以酚酸及黃酮類化合物為焦點(diǎn)，探討了不同溶劑對(duì)提取連翹葉總黃酮、總酚酸的影響，進(jìn)而采用正交設(shè)計(jì)法對(duì)甲醇濃度、超聲提取時(shí)間、提取次數(shù)以及提取溫度4個(gè)因素進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，確定了實(shí)驗(yàn)室分析連翹葉中抗氧化成分的超聲最佳提取條件并測(cè)定了總黃酮、總酚酸含量。1  材料與儀器 

8、   連翹葉采摘自河北醫(yī)科大學(xué)校園內(nèi)，經(jīng)本校藥學(xué)院生藥教研室鑒定為木犀科植物連翹Forsythia suspense (Thunb.) Vahl的新鮮葉子。實(shí)驗(yàn)前拭凈葉面，34 干燥24 h，粉碎過(guò)篩后（40目）備用。    752N 型紫外可見(jiàn)分光光度儀（上海精密科學(xué)儀器有限公司）；KQ3200E型超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）。蕓香葉苷，即蘆?。⊿CRC國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）；沒(méi)食子酸（日本和光公司）；其他試劑均為分析純。2    方法與結(jié)果2.1    總黃酮含量測(cè)定

9、方法2.1.1  標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備   精密稱取干燥至恒重的蘆丁對(duì)照品20.0 mg， 置10 ml 量瓶中，加甲醇溶解定容，搖勻，得濃度為2 mg /ml的蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液。精確移取蘆丁的標(biāo)準(zhǔn)品溶液0.05，0.10，0.15，0.20，0.25，0.30 ml分別置于10 ml量瓶中，用甲醇補(bǔ)足1 ml。加入蒸餾水4 ml，混合放置5 min后，加5% 亞硝酸鈉溶液0. 3 ml和10% 氯化鋁溶液0. 3 ml，搖勻，放置6 min，加1 mol/L氫氧化鈉溶液 2 ml后, 用水定容至10 ml, 充分混合。510 nm處測(cè)定吸光度，以吸光度A（Y）與濃度C（X

10、）進(jìn)行直線回歸，得回歸方程為Y = 1.096 3X + 0.067 7，r = 0.999 9。在0.01 0.06 mg /ml線性關(guān)系良好。2.1.2  樣品溶液測(cè)定精密取適當(dāng)量的以下所得各樣品原液置于10 ml 量瓶中，用甲醇補(bǔ)足1 ml，搖勻，作為供試品溶液。按標(biāo)準(zhǔn)曲線制備項(xiàng)下操作，測(cè)定總黃酮含量。2.2    總酚酸含量測(cè)定方法2.2.1  標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備   精密稱取沒(méi)食子酸對(duì)照品18.8 mg，置100 ml 量瓶中，加甲醇溶解定容，搖勻，得濃度為1 mmol/L的沒(méi)食子酸標(biāo)準(zhǔn)溶液。精確移取沒(méi)食子酸的標(biāo)準(zhǔn)品溶

11、液0.015，0.030，0.045，0.060，0.075，0.090 ml分別置于3 ml離心管中，用甲醇補(bǔ)足0.5 ml。加入Folin - Ciocalteu試劑1 ml，混合放置3 min，加7.5% 碳酸鈉溶液1 ml，搖勻，放置90 min，10 000 r/min離心10 min，750 nm處測(cè)定吸光度，以吸光度A（Y）與濃度C（X）進(jìn)行直線回歸，得回歸方程為Y = 16.229X + 0.07，r = 0.999 9。在1.1 × 103 6.8 × 103 mg/ml內(nèi)線性關(guān)系良好。2.2.2  樣品溶液測(cè)定   精密取適

12、當(dāng)量的以下各樣品原液置于3 ml 離心管中，用甲醇補(bǔ)足0.5 ml，搖勻，作為供試品溶液。按標(biāo)準(zhǔn)曲線制備項(xiàng)下操作，測(cè)定總酚酸含量。2.3  提取溶液的選擇精密稱取連翹葉粉末0.50 g，18份，置于50 ml離心管中，分別加入5 ml石油醚進(jìn)行脫色脫脂處理，3 000 r/min離心，棄去醚液，重復(fù)進(jìn)行兩次后，將濾渣中的石油醚揮發(fā)干燥。分別加10 ml沸水、甲醇、乙醇、丙酮、醋酸乙酯、正己烷分3次超聲提取，20 min/次， 3 000 r/min離心，收集上清液減壓濃縮至干。殘?jiān)眠m量甲醇溶解，轉(zhuǎn)移至10 ml量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，作為樣品原液置于-18 冰箱保存。稀釋至適當(dāng)

13、濃度后，用于測(cè)定總黃酮、總酚酸含量。結(jié)果見(jiàn)表1。表1  不同提取溶劑提取總黃酮、總酚酸含量的測(cè)定結(jié)果（略）從不同提取溶劑提取總黃酮、總酚酸含量的測(cè)定結(jié)果來(lái)看，甲醇提取物的總黃酮、總酚酸含量最高，說(shuō)明甲醇提取連翹葉多酚成分的效果最好，故本研究選擇甲醇作為提取溶劑。2.4  超聲提取條件的確定2.4.1    正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)選用L9(34)正交表，每次實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，考察甲醇濃度（A）、超聲時(shí)間（B）、提取次數(shù)（C）和提取溫度（D）等因素對(duì)提取總黃酮、總酚酸的影響。見(jiàn)表2。表2  實(shí)驗(yàn)因素水平（略）2.4.2  實(shí)驗(yàn)與結(jié)果 精密移取

14、各樣品原液0.04 ml置于10 ml 量瓶中，用甲醇補(bǔ)足1 ml，搖勻，作為供試溶液，測(cè)定總黃酮含量。精密移取濃度為5 mg/ ml各樣品溶液500 l置于3 ml 離心管中，作為供試溶液，測(cè)定總酚酸含量。結(jié)果見(jiàn)表3，SPSS軟件數(shù)據(jù)處理的方差分析見(jiàn)表4。表3  正交實(shí)驗(yàn)方案及結(jié)果（略）每列數(shù)據(jù)中字母相同的結(jié)果之間沒(méi)有顯著性差異（P>0.05）表4  方差分析（略）通過(guò)方差分析表可知，超聲次數(shù)（C）及超聲溫度（D）對(duì)總黃酮含量有顯著性影響，甲醇濃度（A）及超聲時(shí)間（B）對(duì)實(shí)驗(yàn)均沒(méi)有顯著意義，影響次序依次為D CB A。4種因素對(duì)總酚酸含量測(cè)定結(jié)果都有顯著性影響，其中

15、D和C為關(guān)鍵因素，對(duì)實(shí)驗(yàn)影響較大，影響次序?yàn)镈C A B。經(jīng)兩兩比較可知（見(jiàn)表3），這2個(gè)考察指標(biāo)的最佳超聲處理?xiàng)l件都為A1B1C3D3，即甲醇濃度為60%，超聲時(shí)間10 min/次，提取3次，超聲溫度為45 。2.5    連翹葉總黃酮、總酚酸含量的測(cè)定按上述確定的超聲提取條件進(jìn)行連翹葉的超聲提取實(shí)驗(yàn)，操作方法同前述，測(cè)定結(jié)果見(jiàn)表5。表5  驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)結(jié)果（略）連翹葉中總黃酮含量為153 mg/ g，總酚酸含量為41.1 mg/ g。經(jīng)檢驗(yàn)與正交實(shí)驗(yàn)方案中得到最好結(jié)果的A1B3C3D3組比較沒(méi)有顯著性差異。這與SPSS軟件數(shù)據(jù)處理中因素B兩兩比較后顯示的

16、第1水平和第3水平之間沒(méi)有顯著意義的結(jié)果一致?？紤]到超聲時(shí)間為不顯著因素，為了提高實(shí)驗(yàn)效率，最終選擇了超聲提取條件為A1B1C3D3，且該提取方法是穩(wěn)定可行的。3  討論    作為資源更為豐富的連翹葉，其茶制品的抗氧化、抗衰老作用越來(lái)越受到關(guān)注，且研究表明連翹葉中有效成分的含量遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于果實(shí)6。酚酸和黃酮類成分是植物中廣泛存在的抗氧化物質(zhì)，甲醇、乙醇、丙酮和二甲亞砜被報(bào)道是最常用的實(shí)驗(yàn)室提取多酚類成分的有機(jī)溶劑，而甲醇水溶液是使用最頻繁的7。根據(jù)有關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道8，9及本研究結(jié)果，確定了甲醇是提取連翹葉中酚酸及黃酮類成分的最適溶劑。己烷提取物和醋酸乙酯提取物

17、因在甲醇中的溶解性差而表現(xiàn)出較低的總黃酮、總酚酸含量。    近些年，因?yàn)槌曒o助提取具有快捷、經(jīng)濟(jì)、效率高等優(yōu)點(diǎn)而被廣泛應(yīng)用于分析化學(xué)領(lǐng)域中。張華峰等10的研究揭示超聲輔助提取減小了淫陽(yáng)藿葉子樣品的顆粒大小，且可以促進(jìn)溶劑對(duì)葉子樣品的浸透以及樣品細(xì)胞中分析物的釋放，而表現(xiàn)出優(yōu)于沸水提取和索氏提取的效果。本研究通過(guò)正交實(shí)驗(yàn)確定了實(shí)驗(yàn)室超聲提取連翹葉總黃酮、總酚酸條件，結(jié)果證明最佳提取條件是用20倍量60%甲醇做溶劑，45 下超聲提取3次，10 min/次，總黃酮含量為153 mg/ g，總酚酸含量為41.1 mg/ g。另外，因?yàn)槠渌蛩叵嗤?、超聲時(shí)間為10 mi

18、n和20 min這兩組實(shí)驗(yàn)的結(jié)果沒(méi)有呈現(xiàn)出顯著性的差異。為了提高效率和避免超聲時(shí)間過(guò)長(zhǎng)可能造成部分成分有所損失，所以在以后的研究中超聲提取時(shí)間選擇10 min。此方法的確定不僅為進(jìn)一步深入地解析連翹葉的抗氧化、抗衰老成分提供了快捷有效的提取手段，而且對(duì)合理地利用和開(kāi)發(fā)連翹葉資源具有參考意義。    【參考文獻(xiàn)】  1 國(guó)家藥典委員會(huì).中國(guó)藥典,部S.北京:化學(xué)工業(yè)出版社, 2005：117.2 朱淑云,楊建雄,李發(fā)榮. 連翹葉提取物對(duì)小鼠氧化損傷的保護(hù)作用J. 中藥藥理與臨床, 2004, 20 (1): 18.3 楊建雄,李發(fā)榮,朱淑云. 連

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