高通量篩選技術(shù)及其應用

1、生物技術(shù)通報技術(shù)與方法BIOTECHNOLOGYBULLETIN2005年第2期高通量篩選技術(shù)及其應用韓闖楊盛昌(廈門大學生命科學學院,廈門361005)摘要:主要介紹了高通量篩選技術(shù)(HTS,HighThroughputScreening)的原理,包括非細胞相篩選、細胞相篩選和生物表型篩選及其在生命科學和藥學領域中的應用以及高通量篩選技術(shù)的發(fā)展趨勢。關(guān)鍵詞:高通量篩選非細胞相篩選細胞相篩選生物表型篩選HighThroughputScreeningAssayandApplicationHanChuangYangShengchang(SchoolofLifescience,XiamenUnive

2、rsity,Xiamen361005)Abstract:ThisreviewmainlydescribesHighThroughputAssay,2screen2ing,cell2basedscreeningandanimalphenotypescreening,andoffieldsoflifescienceandpharmaceuticsaswellasthetrendKeywords:HTSNon2Cellphenotypescreening最近CombinatorialChemistry)1,使得人們能夠在短時間合成大量化合物,同時分子生物學、分子遺傳學和生物化學的研究如人類基因組計劃

3、、蛋白質(zhì)組學等以幾何級數(shù)增加了新的靶分子的數(shù)量。然而常規(guī)的篩選方法處理不了如此眾多的化合物和靶分子,因此高通量篩選技術(shù)應運而生2并隨著組合化學、微芯片技術(shù)和基因組學的發(fā)展而不斷發(fā)展。目前一個普通的藥學高通量篩選實驗室每天篩選的靶分子超過10萬個3,而在1997年這個數(shù)字還不到3000。HTS可以根據(jù)待測樣品的種類分為非細胞相篩選、細胞相篩選、生物表型篩選。不能逐個處理。幸運的是流式細胞儀(FCM,FlowCytometry)的發(fā)明使得這項工作變的簡單而迅捷。FCM根據(jù)穿過毛細管的細胞熒光強度或類型分離細胞。由于不同的分子與標記有不同熒光素的受體或抗體結(jié)合,利用和細胞大小相似的Microbead

4、作為固相載體取代細胞通過FCM,不同熒光標記的Microbead就被分離出來,于是靶分子或目標分子就很容易的被分離、純化。關(guān)于這項技術(shù)公開的研究報道最早發(fā)表于1996年,Lanza等利用這項技術(shù)測定了患有脊髓發(fā)育不良綜合癥(MyelodysplasticSyndrome)和急性骨髓源白血病病人體內(nèi)的各種細胞因子受體CR(GM2CSF/R:Cw116;ckit/R:CD117;IL3/R,G2CSF/RandFLT3)表達量的變化4。同樣的,Microbead2FCM方法最近還被用于分析RNA蛋白質(zhì)之間的相互作用5。1.2放射免疫性檢測最近幾十年來,放射性同位素法已應用到研究體內(nèi)生理生化反應,各

5、種化合物的結(jié)合與分布,信號傳導通路等實驗中。H,12C,31P,32S,127I的放射性同位素3H,14C,32P,35S,125I因為后者幾乎有與前者相同的化學性質(zhì)所以很容易替換前者并用于1非細胞相篩選1.1Microbead2FCM聯(lián)合篩選利用組合化學的方法,人們可以在極小的固體支持相上合成分子物質(zhì)并且化合物種類可以高達數(shù)百萬種,然而如何高效地篩選固體支持相上的幾個pmol量的活性分子卻是一個極大的難題。過去人們使用彩色受體或是染色的抗體,用手工的方法逐個選出目標固相載體。但是,依據(jù)染料強度來決定活性程度的方法是不準確的,而且大量的固相載體收稿日期:20042122172005年第2期韓闖

6、等:高通量篩選技術(shù)及其應用23體內(nèi)的治療和檢測。放射免疫性檢測(RIA,Radioimmunoassay)的基本原理是利用標記抗原(Ag3)和非標記抗原(Ag)對特異性抗體(Ab)發(fā)生競爭性結(jié)合。在反應系統(tǒng)中,當只有Ag3和Ab時,只產(chǎn)生Ag32Ab復合物,并保持可逆的動態(tài)平衡。如反應系統(tǒng)中同時加入Ag,因Ag與Ag3免疫活性完全相同,故與Ab具有相同的親合力。當Ag3為一定量、Ab為有限量、Ag與Ag3的量之和超過Ab上的有效結(jié)合位點時,Ag32Ab復合物的生成量與Ag的量之間呈一定的函數(shù)關(guān)系。即當Ag量少時,Ag2Ab生成量少,而Ag32Ab生成量(B)增多,游離的Ag3(F)減少,反之亦

7、然?？梢夾g32Ab復合物生成量是受Ag含量制約的。因此,在放射免疫分析中,用已知不同濃度的標準物和一定量的Ag3及限量的Ab反應,一定方法將B與F分開,度下Ag32T)6后,。RIA與EIA和IFA相比有更高的靈敏度,然而放射性元素的使用使得RIA的應用受到較大的限制。1.3熒光檢測(FA)熒光材料在一定條件下每個分子能釋放數(shù)千個光子,使理論上的單一分子水平檢測成為可能。這種特性以及可采用多種熒光模式,使得熒光檢測技術(shù)(FA,FluorescenceAssay)成為高通量篩選必不可少的方法7。然而,這個方法也有局限。熒光化合物不能像放射性同位素那樣取代活性抗原的元素,它們必須連在抗原的某些連

8、接位點上,而且這種修飾不能影響抗原的活性。熒光技術(shù)在非細胞相篩選分析中廣為應用。1.3.1熒光共振能量轉(zhuǎn)移熒光共振能量轉(zhuǎn)移(FRET,FluorescenceResonanceEnergyTransfer)體的發(fā)射域和受體的吸收域的重疊同時受體的量子產(chǎn)量還與溶劑有關(guān)。通常R0約為4050。40約是分子量為26000道爾頓的球蛋白的直徑。如果兩個熒光分子相互距離小于R0,當供體的吸收光被發(fā)射的時候,理論上受體的熒光將會增強。如果其距離大于R0,當同樣的光被發(fā)射時,將會檢測到供體的熒光增強。所以,如果將熒光分子連接到如蛋白酶那樣可作激酶的小分子酶上,很容易檢測酶的活性。Rodems等用FRET實驗

9、平臺高通量的篩選了酪氨酸和絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶和磷酸酶的作用底物9。事實上不僅是小分子,GFP(CFP和YFP),CFP、YFP融合蛋白研究了EK29細胞株Helix2loop2Helix(bHLH)轉(zhuǎn)錄因子HAND1以及HAND1點突變的蛋白2蛋白間的相互作用10。1.3.2與時間相關(guān)的熒光熒光分析的靈敏度常受來源于試劑和容器等背景信號的限制。為了降低熒光背景,人們發(fā)明了與時間相關(guān)的熒光技術(shù)(TRF,Time2resolvedFluorescence)。普通熒光分子的激發(fā)態(tài)存在周期通常僅有幾微秒,但是鑭系元素的可達幾毫秒。利用脈沖激發(fā)光源和門控檢測器(或相調(diào)節(jié)技術(shù))可在樣品熒光信號采集之前

10、讓背景熒光信號消失。TRF可與FRET聯(lián)用,Kennedy等利用TRF2FRET技術(shù)測定了與早老性癡呆癥(AD)密切相關(guān)的beta2secretase(BACE1)蛋白活性11。1.3.3熒光偏振檢測熒光偏振檢測(FPA,Fluo2rescencePolarizedAssay)可測定一個由平面偏振光線激發(fā)的分子所發(fā)射出水平和垂直平面的光線,這兩部分光線強度之差除以強度總和即為偏振值(P)。當溶液的溫度和粘度都固定時,P值主要取決于熒光子的分子體積。由于熒光偏振光強度與熒光物質(zhì)受激發(fā)時分子轉(zhuǎn)動速度成反比,所以小分子物質(zhì)在激發(fā)狀態(tài)旋轉(zhuǎn)速度快,P值較小;大分子物質(zhì)在激發(fā)狀態(tài)中旋轉(zhuǎn)速度較慢,P值較大。

11、因此,這種技術(shù)可以用于分析多種分子之間的相互作用如DNA2蛋是一種用來確定與不同熒光團結(jié)合的二個分子間距離的技術(shù)。當供體激發(fā)態(tài)能量滿足光學和空間上的要求時,其能量就能有效地通過偶極子相互作用轉(zhuǎn)移給受體。能量轉(zhuǎn)移效率(Kt)隨供體(D)和受體(A)之間第六能級距離而成相反變化,故分子間小的空間變化(幾個埃)能顯著影響能量的有效轉(zhuǎn)移率8。R0(50%能量轉(zhuǎn)移效率時D2A的距離)與供242005年第2期生物技術(shù)通報BiotechnologyBulletin白、蛋白2蛋白、抗原2抗體12。Gagne等在384孔板上利用FP技術(shù)和BODIPYTMR熒光染料改進了對與G蛋白偶聯(lián)受體相互作用的物質(zhì)的高通量篩

12、選方法13。1.3.4熒光相關(guān)性光譜熒光相關(guān)性光譜(FCS,FluorescenceCorrelationSpectroscopy)是一種通過監(jiān)測微區(qū)域內(nèi)分子熒光波動來獲取分子動態(tài)參數(shù)或微觀信息的靈敏的單分子檢測技術(shù)14。AndreKol2termann等將雙色熒光相關(guān)性光譜(dual2colorFCS)用于高通量篩選中,發(fā)展了一種新的生物工藝學2RAPIDFCS,在模擬HTS過程中,RAPIDFCS可1.4閃爍接近檢測閃爍接近檢測于1995年在美國和日本被提請專利。由于當固定在固相載體或96孔圓片上的受體被放射性標記的材料篩選時,需要過濾等額外步驟以定量分析放射性。為簡化此步驟,研究人員發(fā)明

13、了閃爍接近檢測(SPA,ScintillationProximityAssay)法。在這個方法中,高產(chǎn)量的熒光分子被附到帶有受體的固體上,通過放射性配體引起成鍵反應。同時,仍存留于溶液中的未成鍵的放射性配體被水分子抑制,而與熒光受體成鍵的配體的放射線被其周圍的熒光分子吸收。因此,活性分子僅以熒(圖1)。Fratte2)C區(qū)的抑制以在1秒中內(nèi)完成對一個樣品的精確分析,在一天內(nèi)可以完成104105個樣品的分析。RAPIDFCS具有檢測速度快,靈敏性高,上樣量少等特點,是超高通量篩選的一種理想工具15。圖1SPA原理示意圖。當供體和受體空間距離足夠近時,能量轉(zhuǎn)移才會發(fā)生。1.5酶連接的免疫吸附檢測(

14、ELISA)ELISA廣泛用作非放射性同位素的實驗中。析。目前許多種疾病的診斷,人群流行病學的普查,活性物質(zhì)篩選均采取這種方法。其基本原理是首先使抗原或抗體結(jié)合到某種固相載體表面(一般為96孔板),并保持其免疫活性;然后使抗原或抗體與某種酶連接成酶標抗原或抗體,這種酶標抗原或抗體既保留其免疫活性,又保留酶的活性。在測定時,把受檢標本(測定其中的抗體或抗原)和酶標抗原或抗體按不同的步驟與固相載體表面的抗原或抗體起反應。用洗滌的方法使固相載體上形成的抗原抗體復合物與其他物質(zhì)分開,最后結(jié)合在固相載體上的酶量與標本中受檢物質(zhì)的量成一定的比例。加入酶反應的底物后,底物被酶催化變?yōu)橛猩a(chǎn)物,產(chǎn)物的量與標本

15、中受檢物質(zhì)的量直接相關(guān),故可根據(jù)顏色反應的深淺刊物定性或定量分2細胞相篩選細胞相篩選在多步信號傳遞中有篩選大量靶蛋白的優(yōu)點,由于含有諸如信號傳導、物質(zhì)代謝等關(guān)于細胞生命活動的信息,因此可以省去體外篩選中的許多步驟。高通量細胞相篩選主要涉及到選擇性殺死策略,離子通道檢測,報告基因分析。2.1選擇性殺死策略首先確定活體生物(通常是芽殖酵母)的類型并選出帶有癌細胞缺陷的類型,然后尋找僅殺死缺陷類型的而不傷害正常類型的藥物。這種方法目前在化學生物學領域廣泛使用,以尋找能過濾有毒分子并選擇性殺死目標物的分子。2005年第2期韓闖等:高通量篩選技術(shù)及其應用252.2離子通道檢測離子通道是細胞信號傳遞的基本

16、途徑之一,也是細胞許多生理活動過程的重要組成部分。于是電壓敏感性FRET染料被用來研究多種藥物在細胞內(nèi)同離子通道的相互作用這對篩選和發(fā)現(xiàn)作用于離子通道藥物大有幫助17。同時這種方法還被用來檢測鈣離子濃度、膜電位、pH值等的變化。2.3報告基因檢測報告基因(ReporterGene)是一種編碼可被檢測的蛋白質(zhì)或酶的基因,是一個其表達產(chǎn)物非常容易被鑒定的基因。把它的編碼序列和基因表達調(diào)節(jié)序列相融合形成嵌合基因,或與其它目的基因相融合,在調(diào)控序列控制下進行表達,從而利用它的表達產(chǎn)物來標定目的基因的表達調(diào)控,篩選得到轉(zhuǎn)化體。Terstappen等18利用報告基因分析技術(shù),mGluR7的調(diào)節(jié)子進行了細胞

17、為基礎的靶目標的確認、二次篩選、前導化合物優(yōu)化和結(jié)構(gòu)活性分析的傳統(tǒng)方法22。隨著科技的發(fā)展,HTS/HCS技術(shù)將不斷向著微型化、自動化、高效化、低廉化和微量化方向發(fā)展。參考文獻1DoylePM.JChemTechnolBiotechnol,1995,64(4):317324.2GrableyS,ThierickeR.AdvBiochemEngBiotechnol,1999,64:101154.3StevenA.CurrentOpinioninBiotechnology,2000,11:474MacroDanova,MassimoAglietta.Haematologica,1997,82:62

18、26295BrodskyAS,JohnstonAP,TrauM,etOpinMolTher,5(3)240.6.成都:,7JH,ChenT,etal.JBiomolScreen,:55.8Jares2ErijmanEA,JovinTM.NatureBiotechnol,2003,21(11):138795.9RodemsSM,HammanBD,LinC,etal.AssayDrugDevTech2nol,2002,1(1Pt1):919.10CentonzeVE,FirulliBA,FirulliAB.BiolProcedOnline,2004,6:7882.11KennedyME,WangW

19、,SongL,etal.AnalBiochem,2003,319(1):4955.12WJChecovich,REBolger,T.Burke.Nature,1995,375:254等,培養(yǎng)的HE的與G(GPCRs)的高通量篩選。193生物表型篩選伴隨著基因組學的發(fā)展,人們建立了線蟲、果蠅、斑馬魚和小鼠等整體動物模型來研究特定的生理病理學表型和基因突變及表達的關(guān)系。因為小鼠較果蠅與人類更近一些,因而具有與人類疾病相似的顯型的小鼠變異類型將對醫(yī)療應用以及新基因功能的發(fā)現(xiàn)有重要幫助。研究人員通過用化學誘變劑如ENU(N2乙基2N2亞硝基脲)等處理雄鼠,使其精子細胞產(chǎn)生變異,然后產(chǎn)出變異的后代來研究人類遺傳疾病基因突變的情況20。然而從顯型表現(xiàn)來在整個基因組中尋找變異基因的過程太麻煩。不過隨著功能基因組學的發(fā)展以及最近RNAi技術(shù)的發(fā)明,研究人員可以有目的敲除或屏蔽掉某些未知功能的基因21并通過表型來研究這些基因的功能和進行藥物篩選。256.13GagneA,BanksP,HurtSD.JReceptSignalTransductRes,2002,22(124):333343.14MooreKJ,TurconiS,AshmanS,etal.JBiomolScreen,1999,4(6)