肺組織灌注前后雙向電泳的比較

1、肺組織灌注前后雙向電泳的比較    作者：李圣青，趙峰，戚好文，張曉君，趙馨，潘剛，吳哲，王宇, 闕海萍，劉少君 【關(guān)鍵詞】 雙向電泳    摘要：目的 尋找更加有效的雙向電泳方法以展示肺組織蛋白。方法 取6只Wistar大鼠隨機(jī)分為對(duì)照組和灌注組，用丙酮/三氯醋酸法提取肺組織蛋白并進(jìn)行雙向電泳分離，將2D膠銀染后用ImageScanner掃描儀掃描，采用ImageMaster 2D Elite 3.10軟件進(jìn)行圖象分析。結(jié)果 對(duì)照組2D膠的蛋白點(diǎn)計(jì)數(shù)為1095±5，灌注組蛋白點(diǎn)計(jì)數(shù)為1 569±

2、;10。在分子質(zhì)量30-70ku范圍內(nèi)，灌注組的蛋白點(diǎn)計(jì)數(shù)顯著高于對(duì)照組(P<0.01)，在其他分子質(zhì)量范圍內(nèi)二者蛋白點(diǎn)計(jì)數(shù)無顯著性差異。在pH值5-8、9-10范圍內(nèi)，灌注組的蛋白點(diǎn)計(jì)數(shù)顯著高于對(duì)照組(P<0.01)，在其他pH值范圍內(nèi)二者蛋白點(diǎn)計(jì)數(shù)無顯著性差異。結(jié)論 生理鹽水灌注法可顯著減少肺組織中的血液蛋白成分，使得肺組織蛋白可以更好的在2D 膠上展示。 關(guān)鍵詞：雙向電泳；肺組織；灌注 ABSTRACT: Objective To find a better way to display lung tissue proteins by 2dimensional electro

3、phoresis(2DE). Methods Lung tissue was obtained directly or after saline perfusion. Proteins were extracted by acetone/TCA methods and separated by 2DE to identify differently displayed proteins. The silverstained 2DE were scanned with digital ImageScanner and analyzed with ImageMaster 2D Elite 3.10

4、 software. Comparison of protein spots obtained directly or after saline perfusion was carried out in statistical ways. Results The saline perfusion group displayed 1569±10 protein spots on 2DE gels and the control group 1095±5 protein spots. The saline perfusion group displayed more prote

5、ins between 30-70ku than the control group, and had no difference with it in the other molecular weight range. The saline perfusion group also displayed more proteins between pH 5-8 and 9-10 than the control group, and had no difference with it in the other pH range. Conclusion The saline perfusion

6、methods can greatly reduce a few families of high abundance proteins(albumin, immunoglobulins) in sera, so the lung tissue proteins can be better displayed on 2DE gels. KEY WORDS: 2dimensional electrophoresis; lung tissue; perfusion 蛋白質(zhì)組學(xué)是繼基因組學(xué)之后飛速發(fā)展的一個(gè)學(xué)科。比較蛋白質(zhì)組學(xué)在研究疾病的發(fā)生、發(fā)展和轉(zhuǎn)歸，尋找疾病特異性的診斷指標(biāo)和藥靶方面發(fā)揮著越來

7、越重要的作用。雙向電泳技術(shù)是一種先進(jìn)的蛋白展示技術(shù)，是蛋白質(zhì)組學(xué)的重要研究方法之一。目前，在呼吸系統(tǒng)疾病的研究中，雙向電泳技術(shù)多用于肺部腫瘤細(xì)胞系、腫瘤組織、肺泡灌洗液的研究。但該技術(shù)用于展示栓塞肺組織的蛋白仍未見報(bào)道，究其原因，主要是海綿樣的肺實(shí)質(zhì)中充斥著大量的血液成分。這些血液成分(蛋白)，如血漿白蛋白、轉(zhuǎn)鐵蛋白、免疫球蛋白和血紅蛋白等，在蛋白提取過程中混雜于肺組織蛋白中，由于這些蛋白均為高豐度蛋白，不但會(huì)在2D膠上掩蓋肺組織蛋白，而且也會(huì)使肺組織的低豐度蛋白難以顯示。為了克服這一難題，我們希望摸索出一套技術(shù)路線，能夠利用雙向電泳技術(shù)更好地展示肺組織蛋白，獲得更多的生物學(xué)信息。 1 材料與

8、方法 1.1 材料 二硫蘇糖醇(DTT)、尿素(Urea)、十二烷基硫酸鈉(SDS)、甘氨酸(glycine)、瓊脂糖(agarose)、甘油(glycerol)、溴酚藍(lán)(bromophenol blue)、3(3膽胺丙基)二甲氨基1丙磺酸(CHAPS)、苯甲基磺酰氟(PMSF)、兩性電解質(zhì)(CA)、丙烯酰胺(acrylamide)、甲叉丙烯酰胺(N,Nmethylene bisacrylamide)、三羥甲基氨基甲烷(Tris)、碘乙酰胺(iodoacetamide)、四乙基乙二胺(TEMED)、低分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)蛋白、IPG緩沖液、IPG覆蓋液和IPG干膠條(3-10NL和3-10L，18cm

9、)均購自Amersham Pharmacia公司，考馬斯亮藍(lán)R250購自Amresco公司，雙向電泳所有溶液均用MilliQ水配制。紫外分光光度計(jì)UV330購自英國(guó)Unicam公司，IPGphorTM等電聚焦儀、Ettan Dalt電泳設(shè)備、Hoefor凝膠自動(dòng)染色儀、ImageScanner掃描儀、ImageMaster 2D Elite 3.10圖象分析軟件均購自Amersham Pharmacia公司。雄性Wistar大鼠購自解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。 1.2 方法 1.2.1 大鼠肺組織的提取 取雄性Wistar大鼠6只，每只體重約300g，隨機(jī)分為2組，即對(duì)照組和灌注組各3只

10、。將灌注組大鼠用10g/L戊巴比妥0.1mL麻醉，分離一側(cè)的頸總靜脈和頸總動(dòng)脈。結(jié)扎頸總靜脈遠(yuǎn)端，插入輸液管，結(jié)扎固定，剪斷頸總動(dòng)脈的同時(shí)打開輸液器，快速加壓輸注生理鹽水500mL。迅速開胸，取出肺組織，用生理鹽水反復(fù)沖洗，-80凍存。對(duì)照組可直接將大鼠麻醉后取肺組織。 1.2.2 肺組織蛋白的提取 采用三氯醋酸/丙酮沉淀法提取肺組織蛋白。首先將肺組織剪碎，然后加入含DTT(2g/L)的100g/L三氯醋酸的丙酮溶液中進(jìn)行機(jī)械勻漿；-20沉淀過夜；用含2g/L DTT的預(yù)冷丙酮反復(fù)洗滌沉淀，最后在通風(fēng)櫥中使丙酮揮發(fā)。在沉淀中加入裂解液(9mol/L Urea，40g/L CHAPS，10g/L

11、 DTT，5mL/L CA，1mmol/L EDTA，35mg/L PMSF，0.7mg/L抑肽素，0.5mg/L亮肽素)，15，40000×g，離心1h，取上清。用Bradford法對(duì)上清進(jìn)行蛋白定量，分裝后-80保存。 1.2.3 一向等電聚焦 對(duì)照組采用18cm pH3-10NL膠條，灌注組采用18cm pH3-10NL膠條。肺組織蛋白1mg(考染檢測(cè))與再水合液(8mol/L Urea, 20g/LCHAPS，痕量溴酚藍(lán)，臨用前加入20mmol/L DTT和5mL/L IPG Buffer)充分混合，總體積為350L。一向等電聚焦在IPGphor等電聚焦儀上進(jìn)行，參數(shù)設(shè)置為3

12、0V 再水合12h；200V，1h；500V，1h；1000V，1h；8000V，逐漸升壓30min，最后維持在8000V，總計(jì)聚焦功率達(dá)到50000伏小時(shí)。    1.2.4 膠條平衡 等電聚焦結(jié)束后，將膠條先后在平衡液(6mol/L Urea，300mL/L Glycerol，20g/L SDS，50mmol/L TrisHCl，pH8.8，痕量溴酚藍(lán), 臨用前加入2g/L DTT)和平衡液(用前加入25g/L碘乙酰胺, 不加DTT,其余成分同平衡液)中各平衡15min。 1.2.5 二向SDS PAGE電泳 采用Ettan Dalt電泳系統(tǒng)，PAG

13、E膠濃度為14%T, 3%C。參數(shù)設(shè)置為5W/gel運(yùn)行30min；然后25W/gel運(yùn)行4h，直至溴酚藍(lán)至底邊約1cm處停止。    1.2.6 硝酸銀染色 銀染在Hoefor凝膠自動(dòng)染色儀上進(jìn)行。固定液(500mL/L無水乙醇，100mL/L冰醋酸)固定1h；更換增敏液(300mL/L無水乙醇，2.5mL/L戊二醛，2g/L硫代硫酸鈉和68g/L無水醋酸鈉)30min；去離子水洗3次，每次5min；加入25g/L硝酸銀溶液(含0.2mL/L甲醛)避光反應(yīng)20min；加顯色液(25g/L無水碳酸鈉和0.1mL/L甲醛)3-10min；最后加入終止液(1

14、4.6g/L乙二胺四乙酸二鈉)，10min后終止反應(yīng)。以上各步驟在20振蕩下進(jìn)行。 1.2.7 掃描和圖象分析 分別選取對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組的2D膠各3張，采用ImageScanner掃描儀，應(yīng)用ImageLabScan軟件，以300bpi分辨率掃描2D膠。用ImageMaster 2D Elite 3.01圖象分析軟件進(jìn)行點(diǎn)檢測(cè)，背景消減，二維校正等，以確定蛋白點(diǎn)的差異。    1.2.8 信息學(xué)分析 登陸/ch2d/網(wǎng)站，檢索SWISS2DPAGE數(shù)據(jù)庫，將本實(shí)驗(yàn)得到的2D膠與血漿和紅細(xì)胞的2D膠圖譜分別進(jìn)行比對(duì)，采用

15、生物信息學(xué)方法確認(rèn)2D膠上的高豐度蛋白點(diǎn)是何種性質(zhì)蛋白。 1.2.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS10.0統(tǒng)計(jì)軟件分析，兩組間比較采用t檢驗(yàn)，P<0.05為差異顯著。 2 結(jié)    果 2.1 雙向電泳圖分析 信息學(xué)分析結(jié)果提示對(duì)照組3張2D膠上的高豐度蛋白點(diǎn)主要為血漿中的白蛋白、轉(zhuǎn)鐵蛋白和紅細(xì)胞的血紅蛋白鏈和鏈成分，由于這些無意義高豐度蛋白的存在，使得真正肺組織的蛋白難以在2D膠上顯示。與此形成鮮明對(duì)照的是灌注組3張2D膠的上述高豐度蛋白顯著減少，從而肺組織的蛋白點(diǎn)相應(yīng)增加，蛋白點(diǎn)比較銳利(圖1)。圖1 肺組織的雙向電泳圖（略） 2.2 蛋白分布特點(diǎn)

16、比較 對(duì)照組的蛋白點(diǎn)計(jì)數(shù)為1095±5，灌注組的蛋白點(diǎn)計(jì)數(shù)為1569±10。在分子量30-70ku范圍內(nèi)，灌注組的蛋白點(diǎn)計(jì)數(shù)顯著高于對(duì)照組(P<0.01)，在其他分子量范圍內(nèi)二者蛋白點(diǎn)計(jì)數(shù)無顯著性差異(圖2)。圖2 不同分子量的肺組織蛋白分布（略）。在pH值5-8和9-10范圍內(nèi)，灌注組的蛋白點(diǎn)計(jì)數(shù)顯著高于對(duì)照組(P<0.01)，在其他pH值范圍內(nèi)二者蛋白點(diǎn)計(jì)數(shù)無顯著性差異(圖3)。圖3 不同等電點(diǎn)的肺組織蛋白分布（略） 3 討    論 肺栓塞的動(dòng)物模型分為兩類：一類是藥物引起的肺部彌漫性微血栓；另一類是各種栓子引起的肺

17、部大血管堵塞。我們采用的是第二類肺栓塞動(dòng)物模型，因?yàn)檫@種模型更接近臨床實(shí)際情況。實(shí)驗(yàn)證明，采用頸靜脈插管，生理鹽水灌注的方法，可以有效地去除肺組織內(nèi)的血液成分，使肺組織蛋白能夠更好地在2D膠上展示。首先，對(duì)照組2D膠上出現(xiàn)的高豐度血液蛋白成分，如：白蛋白、轉(zhuǎn)鐵蛋白及紅細(xì)胞的血紅蛋白鏈和鏈等，在灌注組2D膠上顯著減少，相應(yīng)的增加了肺組織中低豐度蛋白的上樣量。其次，灌注組2D膠上的肺組織蛋白成分相應(yīng)增加，表現(xiàn)為蛋白點(diǎn)計(jì)數(shù)的提高。對(duì)照組的蛋白點(diǎn)計(jì)數(shù)為1095±5，灌注組的蛋白點(diǎn)計(jì)數(shù)為1569±10。在分子量30-70ku范圍內(nèi)，灌注組的蛋白點(diǎn)計(jì)數(shù)顯著高于對(duì)照組(P<0.01

18、)，在其他分子量范圍內(nèi)二者蛋白點(diǎn)計(jì)數(shù)無顯著性差異。在pH值5-8和9-10范圍內(nèi)，灌注組的蛋白點(diǎn)計(jì)數(shù)顯著高于對(duì)照組(P<0.01)，在其他pH范圍內(nèi)二者蛋白點(diǎn)計(jì)數(shù)無顯著性差異。 需要注意的是在對(duì)肺組織進(jìn)行生理鹽水灌注時(shí)，需要嚴(yán)格控制生理鹽水的量和灌注時(shí)間。生理鹽水量不足，使血液成分得不到有效置換；灌注時(shí)間過長(zhǎng)，會(huì)使肺組織蛋白分解。本實(shí)驗(yàn)每只大鼠的生理鹽水用量為500mL，采用加壓輸注的方法，使灌注時(shí)間控制在5min內(nèi)，既可有效去除血液成分，也可防止蛋白分解。    參考文獻(xiàn)： 1Sam H. Disease proteomics . Nature, 2003, 422(2): 226232. 2Eric P, Philippe IHB, Zhu H, et al. Protein analysis on a proteomic scale . Nature, 2003, 422(2):208215. 3de Hoog CL, Mann M. Proteomics . Annu Rev Genomics Hu