選擇正確的緩沖液

1、P186選擇正確的緩沖溶液右表所示為常用緩沖溶液系統(tǒng)表。表中列出一部分常用緩沖溶液及其相應的pH值。其中，最常用的是磷酸鹽。作為一種緩沖溶液，當不同pH值的樣品加入到其中時，應當具有保持pH穩(wěn)定的能力。同時，緩沖溶液的緩沖容量為酸或堿的pK值上下浮動100%。在pH4時，磷酸鹽時一種弱的緩沖溶液，如果一種酸性或堿性更強的樣品加入到其中，其pH值會迅速朝著它的一個pKa值變化。通常，為保持流動相pH值的穩(wěn)定，流動相的pH值應控制在其pKa±1的范圍之內。在HPLC中，常用的緩沖溶液濃度為10-100mM。具體的濃度取決于樣品的尺寸和性質，以及色譜柱的填料。通常，含有極性基團的固定相，如

2、Hypersil Gold aQ，比傳統(tǒng)的烷基填料更適于在稀的緩沖溶液中使用。若想控制流動相在一個低的pH值范圍(2-3)，通常會選擇使用磷酸鹽、或較強的有機酸，如TFA或醋酸。若希望控制在pH4-5，醋酸鹽或檸檬酸鹽而不是磷酸鹽，是通?？紤]使用的試劑。右圖所示為pH值選擇對分離的重要性。如果不能正確緩沖，即使pH值微小變化，由測量的誤差、泵混合物或者流動相吸收空氣中的水所造成的變化，都會改變方法。當選擇一種緩沖溶液和有機溶劑混合時，應注意它們的互溶性，避免出現(xiàn)混合后緩沖鹽結晶析出從而造成系統(tǒng)污染的情況。訂貨號流動相流量檢測實驗完成后，應及時沖洗儀器和色譜柱，以防止緩沖鹽沉積在系統(tǒng)或篩板上。常

3、用緩沖溶液系統(tǒng)緩沖溶液pKapH有效緩沖范圍是否適用與MS三氟乙酸0.30是磷酸鹽pK12.11.1-3.1否pK27.26.2-8.2否pK312.311.3-13.3否檸檬酸鹽pK13.12.1-4.1否pK24.73.7-5.7否pK35.44.4-6.4否甲酸鹽3.84.4-6.4是醋酸鹽4.83.8-5.8是三氨基甲烷鹽酸緩沖液8.37.3-9.3是氨9.28.2-10.2是硼酸鹽9.28.2-10.2否二乙胺10.59.5-11.5是碳酸鹽pK16.4是pK210.2是三乙醇胺7.80是pH的微小變化對微離子化混合物分離的影響12訂貨或客戶支持，請參見封底P187LC/MS緩沖溶液

4、選擇緩沖溶液的選擇很大程度上取決于所使用的儀器和分析物。理想地，LC/MS系統(tǒng)中應使用易揮發(fā)的緩沖溶液以避免形成污染 源極的沉積。無機酸、不揮發(fā)的緩沖溶液以及離子對試劑應避免使用。常用的LC/MS緩沖溶液包括：l 醋酸銨/甲酸鹽/碳酸氫鹽(<50mM)l 甲酸/醋酸(0.01-1%v/v)l 三氟乙酸(<0.1%v/v)l 叔胺(<0.1%v/v)以及氨型堿溶液l TRISl BIS-TRIS丙烷提示：我公司可提供LC/MS儀器，如 Finnigan Surveyor MSQ LC/MS。該系統(tǒng)中加入了自清洗裝置以減小常規(guī)使用中無機鹽在源極上的累積。使用過程中應當注意，不要故

5、意過度污染儀器的源極，因為這可能會導致操作上的問題。流動相的準備正確準備溶劑是十分重要的，它能在減少鬼峰和基線噪聲問題上，節(jié)約大量時間。質量所有溶劑都應是高純度的，HPLC級的溶劑的價格會比其它純度的溶劑稍貴一些，但是它們的純度是不同的。HPLC級溶劑一般不會產生鬼峰，而其它級溶劑可能會由于雜質的存在而產生鬼峰。保證配制流動相的水的純度足夠高，由于去離子水經常含有一些有機化合物，因此不推薦用于HPLC中。超純HPLC用水（18M）是由去離子水通過離子交換床得到?，F(xiàn)代的水凈化儀器即是利用這一機理來大量生產這種純水。HPLC純水也可以從溶劑經銷商處買到。重要提示：不要把HPLC純水存放于塑料容器中

6、，因為塑料中的添加劑可能會滲入水中造成污染。通常用玻璃瓶存儲HPLC純水。緩沖溶液所有的緩沖溶液都應是現(xiàn)用現(xiàn)配的，這樣能確保不會因為緩沖溶液儲藏時間過長使流動相的pH受到影響，同時也可避免微生物生長。pH的改變和微生物都可能會影響色譜分離效果。緩沖溶液儲存應該有一定的時間限制。藥典或者相關的資料都有一些相關要求。緩沖溶液可能包含穩(wěn)定劑，例如：硫代硫酸鈉。這些穩(wěn)定劑可能會影響緩沖溶液在光學和色譜方面的性能，因此，比較理想的是購買沒有添加穩(wěn)定劑的溶劑。重復使用的固體試劑容器很容易被污染。所以推薦買小容量容器裝溶劑。過濾理想情況下，要求所有HPLC用溶劑都應通過0.45m的濾膜過濾后再用。這樣能夠有

7、效防止微粒導致的堵塞。過濾后，應把溶劑放在一個密封的容器中，防止灰塵等所造成的重新污染。過濾后的溶劑既可做色譜分析，也可沖洗系統(tǒng)。譬如，泵頭、柱塞桿、單向閥和密封圈，都應該最大程度上處理好，保持良好性能狀態(tài)。脫氣在流動相進入HPLC系統(tǒng)中之前，應首先脫氣。常用的流動相脫氣方法有：l 氦氣脫氣l 超聲脫氣l 真空脫氣。如果流動相沒有脫氣，那么進入到高壓系統(tǒng)的氣泡會使系統(tǒng)不穩(wěn)，出現(xiàn)鬼峰等。流動相中的氣體引起的基線噪聲氦氣或其他低溶解度氣體是有效的脫氣方法，流動相連續(xù)脫氣可以防止空氣重新溶解在溶劑中從而對實驗產生影響。注意：確保溶劑瓶里有孔與大氣相通，以防止溶劑瓶內部有壓力。P188溶劑性質(vs硅

8、膠)溶劑溶劑強度1 極性指數紫外截止2 (nm)折光率2粘度3 (cP,20)沸點3()水溶性(w/w%)氟利昂正己烷異辛烷正庚烷正癸烷環(huán)己烷環(huán)戊烷1- 氯丁烷正丁醚鄰二甲苯異丙醚甲苯甲基叔二丁醚正丁醇氯仿二氯甲烷甲基丁基酮四氫呋喃互溶環(huán)己酮甲基乙基酮甲氧醚環(huán)己醇互溶丙酮互溶二氧六環(huán)互溶乙酸乙酯乙酸甲酯二甲亞砜互溶N,N-二甲基甲酰胺互溶硝基甲烷乙腈互溶N,N-二甲基乙酰胺N-甲基酰胺正丙醇(1-丙醇)互溶異丙醇(2-丙醇)互溶乙醇互溶甲醇互溶乙二醇互溶醋酸互溶水1. L.R. Snyder, J. Chromatogr. Sci., 16 (1978) 2232. Burdick and J

9、ackson reference tables (wavelength at 1.0 absorbance units).3. CRC Handbook of Chemistry and Physics.P189溶劑互溶性醋酸丙酮乙腈苯正丁醇乙酸丁酯四氯化碳氯仿環(huán)己烷1,2-二氯乙烷二氯甲烷二甲基甲酰胺二甲基亞砜二氧六環(huán)乙醇乙酸乙酯二乙醚庚烷己烷甲醇甲基叔二丁醚甲基乙基酮戊烷正丙醇異丙醇二異丙醚四氫呋喃甲苯三氯乙烯水二甲苯不相溶的那些陰影方格所示“不相溶”是指，兩種溶劑在某種比例下混合，會產生兩相。P190發(fā)色團檢測波長發(fā)色團是光吸收基團，可利用其測定分析物。分析物通常有一個或多個檢測波長，每

10、個檢測波長都有與其相應的摩爾吸收系數。下表是部分常用發(fā)色團的相關信息，可供色譜分析參考。發(fā)色團結構max (nm)max(L/m/cm)炔-CC-175-1806000醛-CHO210強280-30011-18胺-NH21952800酰胺>C=N-1905000偶氮-N=N-285-4003-257006,900170羧基-COOH200-21050-70酯-COOR20550醚-O-1851000烯-C=C-1908000酮>C=O萘220275312112,0001755600硝酸鹽-ONO227012-(C=C)-無環(huán)-(C=C)3C=C-C=CC=

11、C-C=NC=C-C=OC=C-NO2210-230260219220210-250300-35021,00035,0006,50023,00010,000-20,000弱氰-CN-ONO160220-230300-4001000-200010硝基-NO2210強亞硝基-N=O302100肟-NOH1905000嘧0006,0001,700砜-SO2-180亞砜>S-O2101500硫醚-S-19421546001600硫醇-SH1951400氫離子型用25的0.1M的H2SO4溶液以0.1mL/min的流量反向沖冼416h。用25的20/80的乙腈/水溶液以0

12、.1mL/min的流量反向沖冼4h。用65的20/80的ACN/0.01MH2SO4溶液以0.1mL/min的流量反向沖冼4h。鈣離子埋用850.1mol?L pH6.的Ca(NO3)2溶液以0.1mL/mif的量反沖冼416h。用25的20/80的乙腈/水溶涺以0/1mL/man的流量反向沖冼4h。甈25的20/80的乙腈/水溶液以0.1mL/min的流量反向沖th。鈉離型用85的0.1mol/L!pH6.3的Ca(NO3-2溶澲以0.1mL/min的流量反向沖冼416h。用25的20/0的乙腈/水溶液0.1mL/min的流量反向沖冼4h。用25的2/80的乙腈/氶溶液以0.1mL/min的

13、流量反向沖冼4h。鉛離子型用85的pH 5.3的0.1M Pb(NO3)2溶液以0.1mL/min的流量反向沖冼416h。用25的20/80的乙腈/水溶液以0.1mL/min的流量反向沖冼4h。用25的20/80的乙腈/水溶液以0.1mL/min的流量反向沖冼4h。P192GC方法選擇和優(yōu)化是否找到適合的應用查看應用索引(見P201、291)下圖所示為GC方法建立和優(yōu)化的通用步驟。其它在本產品目錄中與之有關信息的頁碼均在圖中標示出來。改變固定相極性柱對極性樣品保留更強，反之亦然。 見P114考慮使用UltraFast GC可減少20倍分析時間減小膜厚減小分析物在固定相上的停留時間使用短柱減小載

14、氣的線速度增加溫度梯度速度降低分配系數及分析物在固定相上的保留時間加快分析速度增加柱長維持線速度增加膜厚可根據樣品在固定相上的停留時間改善分辨率改變柱尺寸使用小內徑、長柱減小載氣的線速度增強與固定相的相互作用，增加保留、分辨率但譜峰擴展減小溫度梯度速度增加分配系數以及分析物在固定相中的停留時間增加膜厚增加樣品與膜的相互作用減小載氣的線速度增強與固定相的相互作用，增加保留、分辨率但譜峰擴展提高分辨率改變固定相極性柱對極性樣品保留更強，反之亦然。 見P114減小溫度梯度速度增加分配系數以及分析物在固定相中的停留時間增加保留驗證是減小柱內徑以減小HETP增加壓力以維持線速度減小膜厚使譜峰更尖銳增加進

15、樣體積提高靈敏度驗證方法優(yōu)化用TRACETMTR-5MS進行初始方法開發(fā)見P118否確認分析物開始P193195GC故障排除在開始故障排除之前，首先需查看相關的實驗室安全規(guī)程。了解試劑的理化性質及其相應的材料安全數據表(MSDS)。同時，還需將所有的電器都關機并拔下其電源插頭。帶好護目鏡。以下是GC實驗中的常見問題、可能的原因及相應的解決方法?，F(xiàn)象原因解決方法基線相關問題基線漂移固定相積聚。除去色譜柱末端部分。載氣瓶壓力太低，不易控制。更換氣瓶，增加壓力。載氣或燃燒氣流量波動。檢查氣閥。色譜柱污染。檢查氣體的純度，使用相應純度的氣體?；€下漂系統(tǒng)載氣泄漏。做泄漏測試，檢查載氣線路中的連接件是否

16、擰緊。色譜柱未老化好。延長色譜柱的平衡時間?；€從一個較高的初始值慢慢下漂。在實驗過程中，沖洗閥一直處于關閉狀態(tài)。改變GC程序。具體方法參見儀器使用說明。沖洗流速太低。增加沖洗流速。沖洗閥關閉時間過長?？s短沖洗時間。溶劑峰拖尾。增強溶劑抑制，縮短沖洗時間。前過濾器污染(當使用四極桿質譜檢測器時)聯(lián)系服務代表?；€上漂色譜柱內雜質堆積。檢查氣體的純度，使用相應純度的氣體。檢測器污染。檢查檢測器，并清洗之。GC柱泄漏。檢修色譜柱，更換色譜柱。空氣進入系統(tǒng)之中。查找并修補泄漏點。溫度程序控制下的基線上漂。色譜柱污染。檢修色譜柱?；€穩(wěn)定在高示值。載氣流速太快。降低載氣流速。色譜柱污染檢修色譜柱。氣體

17、污染。更換氣瓶，替換氣體過濾器。色譜柱固定液流失。檢查柱溫，確保其不超過色譜柱的最高使用溫度；修理色譜柱；更換色譜柱。連接件未擰緊。檢查并確保所有的連接件及螺絲等都處于擰緊的狀態(tài)?；€形狀不規(guī)則：溶劑出峰后開始下降檢測器污染。檢測器退火。清洗檢測器?；€不形規(guī)則：S形程序升溫過程中色譜柱泄漏。降低色譜柱的使用溫度。色譜柱退火。更換一支耐溫更高的色譜柱。氧氣污染導致固定相分解。在氣路上安裝氧氣過濾器。檢查氣體系統(tǒng)及入口是否有泄漏。使用氧氣含量低的氣體?；€高頻噪聲檢測器污染。將檢測器與其它電子儀器隔離開。如果噪聲消失，清洗檢測器。燃燒氣流速太低或者太高。檢查檢測器的氣體流速。色譜柱污染。檢修色譜

18、柱。檢測器氣源污染。檢查氣體純度，安裝相應的過濾器。檢測器溫度高于色譜柱的最高使用溫度。將檢測器溫度下調至色譜柱的最高使用溫度。色譜柱接頭松動。擰緊接頭?；€出現(xiàn)尖峰色譜柱離火焰太近(使用FID時)。將色譜柱調整到合適的位置(噴嘴末端下2-3mm)噴嘴或檢測器污染。將檢測器與其它電子儀器隔離開。如果尖峰消失，清洗噴嘴和收集器。若使用FID，其溫度太低。將FID的溫度至少調高到150。譜峰相關問題譜峰展寬柱流量太快。降低流量至微高于最佳值。柱流量太低。增加流量至微高于最佳值。分流進樣時，分流流量太低。將流量增加至40-50mL/min。柱效降低。在最佳流速下測試色譜柱。進樣器污染。清洗并更換襯墊

19、。固定相積聚在出口。從柱中除去最后兩卷。檢測器溫度太低。將檢測器溫度上調至色譜柱最高使用壓力下5。樣品過載。降低樣品的進樣量或者進樣濃度。出現(xiàn)雙峰進樣速度太慢。進樣快速連貫。錯誤的自動進樣速度或模式?？焖龠M樣。前伸峰柱或檢測器過載。減小進樣量；降低分析物的濃度；增加分流比。柱溫太低提高柱溫。固定相量太少。使用一支膜厚更大的色譜柱。進樣技術欠佳。反復練習，提高進樣技術。鬼峰載氣被污染。更換氣瓶，更換過濾器。由玻璃器皿造成的污染。清洗玻璃器皿，確保所使用的玻璃器皿干凈，不會造成污染。已進樣的樣品分解降低進樣口溫度。采用柱上進樣技術。樣品溶液污染樣品進樣前需進行充分的預處理。寬的鬼峰入口或氣動裝置污

20、染。卸下色譜柱，bake out入口。使用高質量的隔膜。更換分流出口過濾器。在氣動裝置和入口之間安裝在線過濾器。前次實驗的樣品未完全洗脫下來。提高柱溫箱最后的程序溫度或總運行時間。增加柱流量。不規(guī)則椅裝峰色譜柱溶劑溢出。提高初始柱溫，減小進樣體積(OC)。安裝一個保留縫隙(OC)。溶劑峰后未見有譜峰載氣流速太快。降低載氣流速。燃燒氣流量錯誤。檢查燃燒氣的流量。檢測器污染。Bake out或清洗檢測器。FID火焰被溶劑峰淹沒。檢查檢測器溫度。進樣量過大。減小進樣量。S/SL進樣器上，色譜柱位置錯誤(太高)。檢查色譜柱的位置。進樣后不出峰進樣針阻塞。更換或修理進樣針。色譜柱破裂或未連接。檢查色譜柱

21、及連接。電壓計或放大器故障。更換電壓計，更換放大器。記錄儀故障。更換記錄儀。FID火焰熄滅。重新點燃。電子連接件損壞或丟失。檢查電纜連接。S/SL進樣器上，色譜柱位置錯誤(太高)。檢查色譜柱的位置。樣品峰拖尾色譜柱降解。進樣標準品混合物，測試色譜柱。柱溫太低。提高柱溫。不要超過固定相的最高建議使用溫度。襯墊污染。清洗或更換襯墊。玻璃纖維或入口襯墊引起。用硅烷化過的纖維及干凈的入口襯墊替換。入口溫度太低。提高入口溫度。柱接頭堵塞或連接不好。重置色譜柱入口接頭。固定相選擇錯誤。根據色譜柱生產廠商提供的文獻資料重新選擇色譜柱。溶劑峰拖尾色譜柱在進樣口端位置不正確。重新安裝色譜柱。初始柱溫太高。(柱上

22、)降低初始柱溫。隔膜凈化流量太小，分流出口流量太低。檢查并調整隔膜凈化裝置及出口流量。進樣量過大。減小進樣量。峰分不開載氣流速太高。降低載氣流速。柱損壞。更換色譜柱。柱溫太高。降低柱溫箱溫度。色譜柱過短。更換一支更長的色譜柱。色譜柱選擇錯誤。更換一支適合的色譜柱。不恰當的進樣技術。選擇正確的進樣技術。不連續(xù)、高相應值的污染物峰從GC柱中流出檢修或更換色譜柱。從隔膜流出更換隔膜。樣品環(huán)隔膜污染樣品棄去樣品。將樣品直立存于冰箱中。使用一面有TeflonTM的隔膜，將Teflon面朝下(即朝向樣品)。結果相關問題峰面積重復性差樣品濃度與檢測系統(tǒng)的動態(tài)范圍不相容。確保樣品濃度適合檢測系統(tǒng)。不恰當的進樣

23、技術。嘗試使用不同的進樣技術。不適合的進樣參數。檢查進樣溫度。檢查流速。非重復性的樣品進樣技術。評價樣品制備結果。將實驗結果與標準進樣結果相比較。進樣針或襯墊泄漏。定期檢查并更換進樣針。定期檢查并更換襯墊。進樣泄漏。檢查柱接頭，啟動泄漏檢查。進樣技術差。精確計算進樣量。使用一支干凈、高質量進樣針。分流控制問題。監(jiān)測流量。更換在線過濾器。隨著保留時間增加，靈敏度降低。載氣流速太低。提高載氣流速，查找并除去氣路中可能存在的阻塞。檢查進樣器/柱密封圈。正常保留時間下靈敏度降低。柱溫箱或進樣器參數未達最佳。調整柱溫箱或進樣器參數。GC氣路泄漏。啟動泄漏測試，并修理之。進樣過程中，進樣針泄漏。更換進樣針或活塞密封。分流進樣溫度太低。提高進樣器的溫度。色譜柱柱效低，或者色譜柱類型選擇有誤。檢修色譜柱，更換色譜柱。保留時間減少氧氣