激光共聚焦顯微鏡樣品制備方法講解

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4、39;<*! ftl tlU L電子顯微學報 J.Chin.Eleetr.Microse.Soc第 29卷圖I氣體CO:冷凍裝置。Fig.lGas C02froze n equipme nt.鏡下操作后，置于干冰上（臨時無干冰,也可置于一 80C冰箱,待冷凍完全后，將樣 品移至冷凍切片機中，溫度平衡后，將樣品從冷凍包埋模具中取出，進行冷凍切片。冷 凍包埋模具見圖2。圖2冷凍包埋模具。Fig.2Froze n embedd ing mold.液氮冷凍法：成年小鼠和大鼠的腦及稍大一些的組織塊也可采用此方法冷凍。將組織塊置于樣品臺的OCT中，為防止組織塊爆裂，先在液氮中迅速浸提幾次，時間從1s

5、開始逐漸增加，直至樣品溫度與液氮溫度平衡，之后移至冷凍切片機中，使溫度 與切片機箱體溫度一致，進行冷凍切片。直接冷凍法：將樣品直接粘著在涂有OCT的樣品臺上，于冷凍切片機(箱體溫度 在一 20 C以下中直接冷凍。3冷凍組織切片的免疫熒光標記將冷凍組織切片從一 80C冰箱中取出，室溫放 置10min,待切片回溫并干燥，浸于PBS中10min洗去OCT,可以無需Triton處理即 可進行免疫熒光抗體標記，操作步驟與培養(yǎng)細胞反應方法相同口 。反應在避光濕盒 中進行，反應結束時用無熒光封固劑封片,4oC保存。先用熒光顯微鏡觀察，確認標記 成功,移至激光共聚焦顯微鏡掃描成像。4熒光染料及熒光蛋白傳統(tǒng)應用

6、于熒光標記的染料如異硫氰酸熒光素 (fluoreseinisothiocyanate,FITC,ex490nm/em520 nm 四甲基異硫氰酸羅丹明(TRITC,ex550nm/em 620am、羅丹明(Rhodamine,ex560nm/em540 660nn、四甲基 羅丹明(tetramethyl rhodamine, TMR,ex570nm/em595 600nm、德克薩斯紅(Texas red,ex592nm/em610rim 氨甲基香豆素(Aminomethylcoumarin acetic acid,AMCA,ex345 nm/em425am等,結合激光共聚焦顯微鏡技術的發(fā)展，這

7、些經典的 熒光染料逐漸被層出不窮的新的熒光染料所替代。如Cyanine類熒光染料，其中Cy3(ex554nm/em568nm的激發(fā)峰值更接近于新型固體 561am激光器，且比TRITC等更 亮、更穩(wěn)定，已被廣為應用于免疫熒光抗體標記舊1;Alexa Fluor系列熒光染料激發(fā)和發(fā)射光譜窄，可用于多重熒光標記而更少光譜重疊;ATTO系列熒光染料具有較強 的光穩(wěn)定性和熱穩(wěn)定性，已被應用于STED (Stimulated Emission Depletion受激發(fā)射 損耗超高分辨率顯微成像技術 TDyLigh、CF等更多新型熒光染料系列都將因其較 高的激發(fā)效率、良好的光穩(wěn)定性、寬泛的 PH穩(wěn)定性等優(yōu)

8、越的特性而被廣泛的應用 于組織及細胞免疫熒光標記。組織切片的細胞核標記目前仍然采用DAPI(4, 6 一聯(lián)脒一 2-苯基U引哚,ex359nm /em461am其特點是專一性強、靈敏度高、穩(wěn)定性好、毒性小，且可被400405am激光器有效地激發(fā)，獲取明亮的核標記熒光圖像。Pl（碘化丙啶 ex536am/em617llm也可以用于核標記，因其可識別DNA和RNA,核染色前須進行適 當?shù)腞NA酶處理。TOTO系列、YOYO系列熒光染料也可作為組織細胞核熒光染 料。表達熒光蛋白的組織經冷凍切片制樣后，可直接封片，觀察并掃描圖像，也可配合 使用其它熒光染料進行免疫熒光抗體標記和核染色。同時表達 GFP

9、和RFP熒光蛋 白的組織切片，如還需作免疫熒光抗體標記,應選擇可以被633am和405nm波長激光 器激發(fā)的熒光染料，如CY5、Alexa fluor633和Alexa fluor405等。5樣品制備中相關實驗方法400400用于免疫熒光抗體標記組織切片的載玻片需 i-ijutmin i .w iHl.cMhi * 1* IJMBtl r««»>«ni4 t乘卄j 血 r viLfl-a* «*.ttiq 14ib.a'ir PV-：KH_ # H « i n 業(yè)«扌-1打“ 電導鼻r 士曲占ft .HIEVf

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13、niinimfcuflfMHl Mk*I 2 I3# rf tiwr «dwii« 2MS*N IN htavbaMv !'J-fca I IItfetovi 14*1 d * ii-feart* 丨-4hal400400rn FiRKis400激光共聚焦顯微鏡樣品制備方法（組織切片樣品作者:邊瑋,BIAN Wei作者單位：中國科學院上海生命科學研究院生物化學與細胞生物學研究所海,200031刊名：電子顯微學報英文刊名:JOURNAL OF CHINESE ELECTRON MICROSCOPY SOCIETY年，卷（期:2010,29（4參考文獻（5條1斯佩克特D L.戈德曼R D.萊因萬德L A.黃培堂細胞室驗指南20052.