細(xì)胞工程知識點(diǎn)總結(jié)

1、細(xì)胞工程 ：以生物細(xì)胞或組織為研究對象，應(yīng)用生命科學(xué)理論，借助工程學(xué)原理與技術(shù)，有目的的利用或改造生物遺傳特性，以獲得特定細(xì)胞、組織、產(chǎn)品或新型物種的一門綜合性學(xué)科。1. 微繁殖： 是指在離體培養(yǎng)條件下、將來自優(yōu)良植株的莖尖、腋芽、葉片、鱗片等器官、組織和細(xì)胞進(jìn)行無菌培養(yǎng)，經(jīng)過不斷地切割和重復(fù)培養(yǎng)，使其增殖并再生形成完整植株，在短期內(nèi)獲得大量遺傳性均一的個(gè)體的方法。2. 繁殖系數(shù) ：經(jīng)一次增值培養(yǎng)或在一定時(shí)間段內(nèi)由一個(gè)繁殖體所增殖獲得的總繁殖體數(shù)或苗數(shù)。3. 玻璃化 ：也稱超水化作用，是離體培養(yǎng)過程中試管苗發(fā)生形態(tài)、生理和代謝異常的現(xiàn)象。4. 褐變 ：是指組織培養(yǎng)中，由于材料被切割而使多酚氧化

2、酶活化將組織中的酚類物質(zhì)氧化形成棕褐色的醌類物質(zhì)，并向培養(yǎng)基中擴(kuò)散，抑制培養(yǎng)物生長甚至導(dǎo)致其死亡的現(xiàn)象。5. 原球莖： 蘭科植物的種子在萌發(fā)初期并不出現(xiàn)胚根，只是胚逐漸膨大，以后種皮的一端破裂，膨大的胚呈小圓錐狀，稱作原球莖。6. 莖尖分生組織： 指莖尖最幼齡葉原基上方的由2 或 3 層分生細(xì)胞組成的很小區(qū)域、一般最大直徑不超過 0.1mm, 長度 0.25mm，最小的莖尖長度僅有幾十微米，有時(shí)也稱頂端分生組織。7. 不定芽： 相對于頂芽和腋芽、由植物的其他部位或器官、組織上通過器官發(fā)生重新形成的、無固定著生位置的芽統(tǒng)稱為不定芽。細(xì)胞細(xì)胞工程知識點(diǎn)緒論研究內(nèi)容 （根據(jù)操作對象）： 1）器官組織

3、和細(xì)胞培養(yǎng) 2）原生質(zhì)體培養(yǎng) 3）植物胚胎培養(yǎng) 4）動(dòng)物胚胎工程5）轉(zhuǎn)基因動(dòng)植物6）胚胎干細(xì)胞7）染色體工程 研究內(nèi)容 ( 研究水平） ；個(gè)體、器官、組織、細(xì)胞、亞細(xì)胞、分子等不同研究層次動(dòng)物細(xì)胞發(fā)展經(jīng)歷了哪些階段？答：細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)細(xì)胞融合技術(shù)動(dòng)物胚胎移植技術(shù)體外受精技術(shù)動(dòng)物克隆技術(shù)轉(zhuǎn)基因動(dòng)物技術(shù)胚胎干細(xì)胞技術(shù) 生物工程 ： 1）發(fā)酵工程2)基因工程3）酶工程 4）細(xì)胞工程5）蛋白質(zhì)工程（第二章沒有放進(jìn)來！ ?。┑谌屡囵B(yǎng)原理細(xì)胞學(xué)說 ：1838 年，主要觀點(diǎn)：細(xì)胞是生物體的基本結(jié)構(gòu)單位，由它構(gòu)成整個(gè)生物個(gè)體。植物細(xì)胞的全能性：每個(gè)植物細(xì)胞都具有該物種的全部遺傳信息，在適宜條件下具有發(fā)育成完整

4、植株的能力。植物細(xì)胞全能性含義：（ 1）每個(gè)植物細(xì)胞都具有它母性的全部遺傳特征。（ 2）每一個(gè)細(xì)胞都可以在特定條件下發(fā)育成為與母體一樣的植株。全能性的 實(shí)現(xiàn)：一個(gè)已分化的細(xì)胞要實(shí)現(xiàn)其全能性兩個(gè)過程：一是脫分化，使外植體的細(xì)胞轉(zhuǎn)變成胚性細(xì)胞，從而獲得不斷分裂的能力；二是再分化，使胚性細(xì)胞分化形成器官。條件 ：具有較強(qiáng)全能性的細(xì)胞從植物組織抑制性影響下解脫出來，使其處于獨(dú)立發(fā)育的離體條件下；賦予離體細(xì)胞一定刺激，包括營養(yǎng)物質(zhì)、植物激素、光周期、溫度、酸堿度等。途徑： 1）以植物的體細(xì)胞為培養(yǎng)材料，可以誘導(dǎo)形成完整植株。2）以植物的性細(xì)胞為培養(yǎng)材料，可以誘導(dǎo)形成完整植株。3）用酶解法去除植物細(xì)胞的細(xì)

5、胞壁，培養(yǎng)裸露的原生質(zhì)體，原生質(zhì)體發(fā)育成植物體。4 ）加入促溶劑，可以誘導(dǎo)兩個(gè)不同種的原生質(zhì)體融合，繼續(xù)培養(yǎng)可發(fā)育成雜種植株。5）將外源基因通過不同基因載體引入植物細(xì)胞，使植物細(xì)胞在分子水平上發(fā)生修飾，經(jīng)離體培養(yǎng)后可再生成具有新性狀的植物體。（轉(zhuǎn)基因）植物細(xì)胞的分化 ：由發(fā)育起始狀態(tài)的合子沿個(gè)體發(fā)育方向不斷分化出形態(tài)結(jié)構(gòu)、生理功能不同的細(xì)胞、組織、器官而最終形成完整植株的過程。脫分化 ：在某些特定條件下，分化細(xì)胞的表型也不穩(wěn)定，其基因活動(dòng)模式也發(fā)生可逆的變化，細(xì)胞脫離原狀態(tài)而回復(fù)到分生狀態(tài)。細(xì)胞脫分化的結(jié)果產(chǎn)生愈傷組織。成熟細(xì)胞分生細(xì)胞多細(xì)胞團(tuán)形態(tài)建成完整植株外植體離體培養(yǎng)到再分化形成各器官三

6、個(gè)時(shí)期 ：（ 1）誘導(dǎo)期（ 2）分裂期（ 3）分化期植物愈傷組織： 植物受到機(jī)械、動(dòng)物或微生物等傷害后，創(chuàng)傷部位的細(xì)胞脫分化而不斷增值形成松散排列、無特定結(jié)構(gòu)和功能的非器官化組織。愈傷組織的類型：胚型 緊密型（胚性質(zhì)地較堅(jiān)實(shí)、乳白色或黃色、表面有球形顆粒）易碎型非胚性（松散易碎、黃的或褐色、表面粗糙、生長迅速）型（乳白色或綠色、結(jié)構(gòu)致密、復(fù)雜多樣、生長緩慢、不宜長時(shí)間保持胚性）。型（淡黃色或黃色、結(jié)構(gòu)松散、松軟、呈顆粒狀生長較快、能長時(shí)間保持胚性。）型（白色或灰色透明水漬狀，松軟無結(jié)構(gòu)，形似或冰針絮狀，繼代易褐化而死亡。）愈傷組織的 細(xì)胞組成（ 分生細(xì)胞、薄壁細(xì)胞、厚壁細(xì)胞和管狀細(xì)胞。）分生細(xì)

7、胞存在于分生組織和胚狀體內(nèi)，其細(xì)胞小，細(xì)胞核占比例大，細(xì)胞質(zhì)著色深，無或少有液泡。薄壁細(xì)胞較大，細(xì)胞非圓形，核小，且被中央大液泡擠到邊緣，很多薄壁細(xì)胞中不見核的存在，部分薄壁細(xì)胞已解體，胞質(zhì)內(nèi)無或殘留少量物質(zhì)，殘留物著色均一。厚壁細(xì)胞存在于愈傷組織表面，其細(xì)胞質(zhì)解體，細(xì)胞壁是通過木質(zhì)化或栓質(zhì)化加厚而形成的。管狀分子是由薄壁細(xì)胞經(jīng)細(xì)胞壁木質(zhì)化次生加厚形成的，有環(huán)紋、網(wǎng)紋和孔紋三種類型。特性 ：異質(zhì)性、嵌合性、變異性繼代培養(yǎng) ; 固體培養(yǎng)簡便易行，但有缺點(diǎn)：由于被培養(yǎng)愈傷組織僅一部分和培養(yǎng)基接觸，在培養(yǎng)過程中，接觸部位的營養(yǎng)物質(zhì)很快被吸收掉，而從培養(yǎng)基其他區(qū)域補(bǔ)充較慢，造成愈傷組織生長不平衡。愈傷

8、組織在培養(yǎng)過程中排出的有害物質(zhì)在培養(yǎng)物附近積累。在靜止放置情況下，受重力作用和單向受光等因素影響，愈傷組織極易出現(xiàn)極化和分化，產(chǎn)生微管分子和結(jié)節(jié)等分化細(xì)胞，最終難以獲得均一的細(xì)胞群體。液體培養(yǎng)的優(yōu)點(diǎn) ：在液體培養(yǎng)基中愈傷組織一手營養(yǎng)均衡，易獲得均一的細(xì)胞群體；愈傷組織塊在液體震蕩培養(yǎng)中會分裂成更小的細(xì)胞團(tuán)或單細(xì)胞，因而產(chǎn)生更大的吸收表面積。在液體培養(yǎng)基中，體細(xì)胞胚胎發(fā)生比固體培養(yǎng)基更容易。被子植物對愈傷組織的誘導(dǎo)較敏感；雙子葉植物比單子葉植物容易誘導(dǎo)成功；草本植物比木本植物易產(chǎn)生愈傷組織及進(jìn)行其后的形態(tài)建成。極性 ：在器官、組織甚至細(xì)胞中，在不同的軸向上存在某種形態(tài)結(jié)構(gòu)和生理生化上的梯度差異。

9、造成了細(xì)胞內(nèi)生活物質(zhì)的定向和定位。1. 生長素： IAA NAA IBA 2-4D2. 細(xì)胞分裂素： KP ZP 玉米素 6-BA 促進(jìn)細(xì)胞分裂調(diào)節(jié)作用發(fā)生在有絲分裂準(zhǔn)備期，即G2 期。3. 脫落酸： ABA 低水平的 ABA有利于胚性愈傷組織的形成。ABA的效應(yīng)與外植體的發(fā)育時(shí)期有關(guān)。4. 乙烯： Eth 乙烯抑制劑可促進(jìn)高度胚性愈傷組織的形成。培養(yǎng)條件的影響P48器官發(fā)生：植物根、莖、葉、花、果實(shí)等器官的分化與形成。生長素和細(xì)胞分裂素之間的平衡控制器官發(fā)生。發(fā)生方式： 直接發(fā)生途徑 ：直接產(chǎn)生不定芽。 間接發(fā)生途徑 ：先產(chǎn)生愈傷組織生長中心形成器官原基及器官形成。影響器官發(fā)生的因素：體細(xì)胞

10、胚胎 ：離體培養(yǎng)下沒有經(jīng)過受精過程，但經(jīng)過了胚胎發(fā)育過程所形成的胚的類似物。（SE）體細(xì)胞胚是離體培養(yǎng)的產(chǎn)物，只限于離體培養(yǎng)范圍使用，以區(qū)別于無融合生殖胚。體細(xì)胞胚起源于非合子細(xì)胞，區(qū)別于由受精卵發(fā)育而成的合子胚。體細(xì)胞經(jīng)過了胚胎發(fā)育過程，具有胚根、胚芽和胚軸的完整結(jié)構(gòu)。與合子胚區(qū)別 ：無真正胚柄子葉常不規(guī)范體積明顯小無明顯的休眠期，心形期后可直接分化為植株。與器官發(fā)生的比較： 一：體細(xì)胞胚最根本特征兩極性：即在發(fā)育的早期階段從方向相反的兩端分化出莖端和根端；器官發(fā)生是單極性的。二：體細(xì)胞胚的維管組織分布是獨(dú)立的“ Y”字形結(jié)構(gòu)，與外植體組織無結(jié)構(gòu)上的聯(lián)系，出現(xiàn)所謂的生殖隔離現(xiàn)象。三：由體細(xì)胞

11、胚形成的再生植株其遺傳性相對穩(wěn)定，變異性遠(yuǎn)小于由器官發(fā)生途徑形成的再生植株。來源 1. 直接從外植體上產(chǎn)生體細(xì)胞胚（在一定的培養(yǎng)條件下，許多離體培養(yǎng)的植物器官外植體表面已分化細(xì)胞脫分化后均可產(chǎn)生胚狀體。）2. 由愈傷組織產(chǎn)生 （離體培養(yǎng)時(shí)，存在于愈傷組織內(nèi)部的一些薄壁細(xì)胞開始分裂，形成一個(gè)球形的分生中心，球形胚進(jìn)一步發(fā)育成心形胚至魚雷形胚。）3.懸浮培養(yǎng)中由胚性細(xì)胞復(fù)合體表面產(chǎn)生。4. 由懸浮培養(yǎng)中游離的單細(xì)胞產(chǎn)生。5. 由單倍體細(xì)胞產(chǎn)生。影響體細(xì)胞胚發(fā)生因素 （ 1）氮源（ 2）生長素（ 3）組織起源 P54人工種子 技術(shù) ：通過將植物組織培養(yǎng)中所產(chǎn)生的體細(xì)胞胚胎或胚芽等包埋在“人工胚乳”和

12、“人工種皮”里，制成的具有播種功能、類似天然種子的顆粒。結(jié)構(gòu)： 1 體細(xì)胞胚：胚狀體、愈傷原球莖、不定芽、頂芽、腋芽2 人工胚乳：養(yǎng)分 3 人工種皮：防機(jī)械損傷、保護(hù)、干燥意義 ： 1）人工種子能代替試管苗的快速繁殖，體細(xì)胞胚具有數(shù)量多、繁殖快、結(jié)構(gòu)完整的特點(diǎn)。2）體細(xì)胞胚是由無性繁殖體系產(chǎn)生的。固定雜種優(yōu)勢。3）使自然條件下不結(jié)實(shí)或種子生產(chǎn)成本昂貴的植物得以繁殖。 4）可以加入植物激素及有益微生物或抗蟲、抗病農(nóng)藥，而賦予人工種子比自然種子更優(yōu)越的特性?？刂婆咝约?xì)胞同步化的方法：1. 抑制劑法促進(jìn)細(xì)胞同步分裂2. 低溫處理促進(jìn)細(xì)胞同步分裂3. 滲透壓控制同步化法4. 同步胚的分段收集篩選法5.

13、通氣法問題 ：高頻誘導(dǎo)可能發(fā)生變異人工種皮還存在缺陷儲存、發(fā)芽技術(shù)不夠成熟工廠化生產(chǎn)配套設(shè)施成本過高2、愈傷組織的形成大致可分為幾個(gè)時(shí)期？各有何特點(diǎn)？答：（ 1）啟動(dòng)期 ( 誘導(dǎo)期 ) ：主要是指細(xì)胞準(zhǔn)備分裂的時(shí)期, 需要采用合適的誘導(dǎo)劑, 如 NAA(萘乙酸 ) 、IAA（吲哚乙酸）、2， 4-D（ 2， 4- 二氯苯氧乙酸）等或細(xì)胞分裂素。特征：距傷口較近的薄壁細(xì)胞略有增大，細(xì)胞質(zhì)開始增多，相應(yīng)的液泡縮小，核變大，呈球形，并由細(xì)胞邊沿向中央移動(dòng)；核仁明顯變大， RNA含量增加，細(xì)胞恢復(fù)到具有分裂能力的狀態(tài)，進(jìn)入分裂的準(zhǔn)備階段，開始脫分化。（ 2）分裂期：進(jìn)入分裂期就是脫分化的完成，同時(shí)也是

14、再分化的開始。特征：被啟動(dòng)的細(xì)胞全面地進(jìn)行活躍分裂。啟動(dòng)分裂的細(xì)胞體積變小，細(xì)胞內(nèi)有旺盛的物質(zhì)合成，并逐漸恢復(fù)到分生組織狀態(tài)。如果此時(shí)經(jīng)常更換培養(yǎng)液，愈傷組織就可以無限制地進(jìn)行分裂而維持不分化狀態(tài)。（ 3）分化期（形成期）：細(xì)胞內(nèi)部開始發(fā)生一系列形態(tài)和生理的變化，分化出形態(tài)和功能不同的細(xì)胞。特征：這一時(shí)期與分裂期沒有明顯界限，一方面細(xì)胞不斷分裂增殖，形成愈傷組織，另一方面細(xì)胞開始再分化。3. 愈傷組織有何生長特征？答： 1、愈傷組織的類型：根據(jù)組織學(xué)外觀特征及其再生方式分為：胚性愈傷組織（EC）：質(zhì)地較堅(jiān)實(shí)，顏色有乳白或黃色，表面具有球形顆粒，生長緩慢。又可分為：致密型、易碎型。非胚性愈傷組織

15、（NEC）：松疏易碎，顏色有黃色或褐色，表面粗糙，生長迅速。一般只有胚性愈傷組織有再生能力。某些植物的非胚性愈傷組織經(jīng)適當(dāng)繼代培養(yǎng)可轉(zhuǎn)變?yōu)榕咝杂鷤M織。5、培養(yǎng)條件下的器官發(fā)生有哪些方式？影響其發(fā)生的因素有哪些？（ 1）有直接發(fā)生與間接發(fā)生兩種途徑。（2）影響其發(fā)生的因素有：1、外源激素的影響2、物理因素：光照、溫度3、外植體的生理狀態(tài)4、培養(yǎng)物的年齡8、影響器官發(fā)生的主要因素有哪些？答 :1 、外源激素的影響2、物理因素：光照、溫度3、外植體的生理狀態(tài)4、培養(yǎng)物的年齡9、何謂胚狀體？胚狀體與合子胚有何異同？答：胚狀體離體培養(yǎng)條件下，沒有經(jīng)過受精過程，但是經(jīng)過了胚胎發(fā)育過程所形成的胚狀類似物，

16、此現(xiàn)象無論在體細(xì)胞培養(yǎng)還是生殖細(xì)胞培養(yǎng)中均可以看到，因而統(tǒng)稱為體細(xì)胞胚或胚狀體。異同：細(xì)胞胚具有兩極性，而器官發(fā)生是單極的。細(xì)胞胚維管組織分布是獨(dú)立的Y 字形結(jié)構(gòu)，形成的再生植株遺傳性比器官發(fā)生的穩(wěn)定。10、離體培養(yǎng)條件下，胚狀體的產(chǎn)生有幾種方式？答：（ 1）、直接從外植體上產(chǎn)生體細(xì)胞胚由愈傷組織產(chǎn)生（ 2）懸浮培養(yǎng)中由胚性細(xì)胞復(fù)合體表面產(chǎn)生 （ 3）有懸浮培養(yǎng)中游離的單細(xì)胞產(chǎn)生（ 4）由單倍體細(xì)胞產(chǎn)生第四章 離體無性繁殖離體無性繁殖：是指在離體培養(yǎng)條件下，將來自優(yōu)良植株的莖尖、腋芽、葉片、鱗片等器官、組織和細(xì)胞進(jìn)行 無菌培養(yǎng) ，經(jīng)過不斷地切割和重復(fù)培養(yǎng)，使其增殖并再生形成完整植株 ，在短期內(nèi)

17、獲得大量遺傳性均一的個(gè)體的方法。意義 ：（ 1）利用 較少的植物材料 ，在無菌和人工控制條件下， 不受季節(jié)限制 在有限空間 內(nèi)實(shí)現(xiàn)規(guī)?；B續(xù)生產(chǎn)， 繁殖周期短、速度快 ，節(jié)約大量的土地和人力資源。（ 2） 與脫病毒技術(shù)相結(jié)合，可以為生產(chǎn)上提供健康無病毒植株。（ 3） 繁殖苗體積微小、 不攜帶病原菌 ，便于儲運(yùn)和種質(zhì)材料交換。（ 4） 保持優(yōu)良性狀。類型 1. 腋生枝型：指在離體條件下利用外植體上已有的頂芽和腋芽誘導(dǎo)其發(fā)育成枝并培養(yǎng)成苗的繁殖方式。 2 不定芽型：指利用外植體上形成的不定芽培養(yǎng)成苗的繁殖方式。3. 體細(xì)胞胚型：指通過離體外植體培養(yǎng)，誘導(dǎo)胚胎發(fā)生形成體細(xì)胞胚，再由體細(xì)胞胚發(fā)育成苗的

18、繁殖方式。 （1）成苗率低（ 2）胚狀體的發(fā)生和發(fā)育情況極為復(fù)雜（ 3）再生植株有明顯的遺傳變異及返幼特性4. 原球莖型：指由外植體培養(yǎng)形成原球莖，通過原球莖進(jìn)行增殖并培養(yǎng)成苗的方式。離體無性繁殖的技術(shù)P66 生根培養(yǎng)基特點(diǎn)試管苗的特點(diǎn)移栽方法取材滅菌接種誘導(dǎo)繼代分化生根煉苗技術(shù)問題 : 1. 污染：指在組織培養(yǎng)過程中培養(yǎng)基和培養(yǎng)材料滋生雜菌，導(dǎo)致培養(yǎng)失敗的現(xiàn)象。2. 褐變：組織培養(yǎng)中，由于材料被切割而使多酚氧化酶活化將組織中的酚類物質(zhì)氧化形成棕褐色的醌類物質(zhì)，并向培養(yǎng)基中擴(kuò)散，抑制培養(yǎng)物生長甚至導(dǎo)致其死亡的現(xiàn)象。3. 玻璃化：也稱“超水化作用”，是離體培養(yǎng)過程中試管苗發(fā)生的形態(tài)、生理和代謝異

19、常的現(xiàn)象。P69 玻璃化特點(diǎn)防止方法光自養(yǎng)培養(yǎng)P70莖尖和根尖分生組織病毒含量低的原因：（ 1） 分生細(xì)胞構(gòu)成，無維束管，胞間連絲也不發(fā)達(dá)，病毒很難進(jìn)入。（ 2） 分生細(xì)胞不斷進(jìn)行活躍的分裂增殖，消耗大量的能量，代謝旺盛，能抑制病毒的復(fù)制（ 3） 莖尖和根尖中內(nèi)源激素濃度水平較高，抑制了病毒的復(fù)制（ 4）可能跟 RNA干擾有關(guān)二脫病毒的方法及原理1. 物理方法：不能殺死病毒。如熱處理、低溫處理。2. 化學(xué)方法：主要是抑制細(xì)胞分裂3. 生物學(xué)方法：莖尖分生組織培養(yǎng)：（ 1）莖尖分生組織 ; 莖尖最幼齡葉原基上方的由2 或 3 層分生細(xì)胞組成的很小區(qū)域，一般最大直徑不超過 0.1mm，長度約 0.

20、25mm，最小莖尖長度僅有幾十微米。這一區(qū)域通常不含病毒，取這個(gè)組織進(jìn)行培養(yǎng)可獲得無病毒植株。（ 2）供體選擇： a：實(shí)用性和典型性 b ：健康，病感程度輕的植株c ：生理狀態(tài)和部位（ 3）莖尖分生組織的分離：莖尖大小的選擇要兼顧脫毒率和成活率兩方面。三 植物病毒的檢測及無病毒苗的保存和繁殖1. 指示植物檢測法 ：指示植物指對某一種或某一類病毒非常敏感的植物。病毒的鑒定工作必須在防蟲網(wǎng)室 內(nèi)進(jìn)行。對于主要通過汁液傳染的病毒可采用汁液感染法 來檢測。2 . 血清學(xué)檢測法 ：利用抗體和抗原在體外的特異性結(jié)合進(jìn)行病毒檢測的方法。基本程序包括：抗原制備、抗血清制備和病毒鑒定三步。 P773. 分子生物

21、學(xué)檢測法：通過檢測病毒核酸來證實(shí)病毒的存在。二：植物離體無性繁殖主要適用于哪些植物？與常規(guī)無性繁殖相比有什么優(yōu)勢？植物離體無性繁殖主要適用于園藝觀賞植物、農(nóng)作物、藥用植物及經(jīng)濟(jì)林木的種苗生產(chǎn)。1. 周期短，便于控制培養(yǎng)條件。繁殖速度快，經(jīng)濟(jì)效益高。2. 占用空間小，不受地區(qū)、季節(jié)限制。3. 繁殖珍稀、瀕臨苗木和突變體，是優(yōu)良品種培養(yǎng)的有效途徑。4. 利物保持原來品種的特性。三：離體無性繁殖中, 培養(yǎng)物的增殖方式有哪幾種？各有何特點(diǎn)？離體無性繁殖中 , 培養(yǎng)物的增殖方式有 4 種。1 腋生枝型特點(diǎn)（ 1）繁殖率高 （2）能保持植物遺傳穩(wěn)定性（ 3）可縮短林木繁殖周期。2 不定芽型特點(diǎn)：（ 1）繁

22、殖率非常高，但繁殖速度較慢；（ 2）遺傳性穩(wěn)定。 3 胚狀體發(fā)生型特點(diǎn)：（ 1）胚狀體發(fā)生數(shù)量多，速度快，結(jié)構(gòu)完整，繁殖系數(shù)高；（2）遺傳性穩(wěn)定。4 原球莖型是蘭花種子萌發(fā)時(shí)產(chǎn)生的呈珠粒狀、縮短的、類似嫩莖的器官，可萌發(fā)成苗。四：離體無性繁殖一般可分為哪幾個(gè)階段？簡述其操作的一般程序。離體無性繁殖一般可分為5 個(gè)階段。 1、植株的準(zhǔn)備：供體植株應(yīng)生長旺盛、健壯、不病蟲害，并盡可能生長在干凈的環(huán)境中。2、無菌培養(yǎng)物的建立：獲得無菌材料并誘導(dǎo)外植體生長和發(fā)育。包括從供體植株上采取外植體進(jìn)行消毒、接種及啟動(dòng)外植體生長等程序。3、 培養(yǎng)物的增殖：通過反復(fù)培養(yǎng)使第一階段獲得的數(shù)量有限的嫩枝、芽苗、胚狀體

23、或原球莖等培養(yǎng)物的總量增加。4、 生根培養(yǎng)：將增殖階段形成的無根芽苗轉(zhuǎn)移到生根培養(yǎng)基上誘導(dǎo)產(chǎn)生不定根，獲得健壯的具有根、芽、莖的完整小植株。5 、 試管苗的移栽及鑒定：移栽是將具根試管苗轉(zhuǎn)移到土壤中的過程，是試管苗從離體培養(yǎng)逐步適應(yīng)溫室或田間生長環(huán)境的過程。六：離體繁殖中常見得技術(shù)問題有哪些? 如何克服或防止其發(fā)生？污染問題和褐變、玻璃化污染問題預(yù)防措施、通風(fēng)、去濕、光照、防霉5、改進(jìn)外植體消毒方法或使用抗生素等。褐變防治措施 1、選擇合適的外植體：一般來說，最好選擇生長處于旺盛的外植體。2、合適的培養(yǎng)條件：無機(jī)鹽成分、植物生長物質(zhì)水平、適宜溫度和光照、及時(shí)繼代培養(yǎng)均可以減輕材料的褐變現(xiàn)象。3

24、、使用抗氧化劑：在培養(yǎng)基中，使用半胱氨酸、抗壞血酸等。4、使用吸附劑：使用聚乙烯基吡咯烷酮、0.1%-0.5 的活性炭對防止褐變也有較為明顯的效果。玻璃化防治措施1、降低細(xì)胞分裂素的濃度，調(diào)節(jié)激素配合2、增加培養(yǎng)基中的溶質(zhì)水平，以降低培養(yǎng)基的滲透勢。3、降低氨態(tài)氮，提高硝態(tài)氮的含量4 、增加容器的氣體交換，降低容器內(nèi)相對濕度5、降低培養(yǎng)溫度，增加自然光照6、在培養(yǎng)基中添加間苯三酚、根皮苷或生長抑制劑等物質(zhì)。九、脫除植物病毒病有哪些方法？其原理是什么？物理方法（1）、高溫處理又稱熱療法原理 : 一些病毒對熱不穩(wěn)定, 在高于常溫的溫度下(35-40 ) 即鈍化失活 , 繁殖力下降 , 失去侵染能力

25、 , 而植物基本不受傷害 .(2) 、低溫處理又稱冷凍療法原理：降低溫度能使病毒活力下降。化學(xué)處理 (1).病毒抗血清預(yù)處理：用齒舌蘭環(huán)斑病毒 （ ORV）的血清處理蘭屬離體分生組織，提高了再生株中無ORV的植株頻率。(2).RNA抑制劑處理：煙草愈傷組織培養(yǎng)基中加入2- 硫脲嘧啶，可除去組織中馬鈴薯Y 病毒（ PVY）。放線菌 D 和放線菌酮能抑制原生質(zhì)體中病毒的復(fù)制。（ 3）.三氯唑核苷：病毒唑，化學(xué)名稱1,2,4-3 唑 -3- 酰胺 -1- -D- 呋喃核苷，防治動(dòng)物RNA病毒和 DNA病毒病的廣譜性抗病毒制劑。生物脫毒方法（原理：培養(yǎng)材料中通常不含病毒，可通過植物組織培養(yǎng)就行脫毒）

26、（ 1）、莖尖分生組織培養(yǎng)（ 2）、微體嫁接脫毒（3）、愈傷組織培養(yǎng)脫毒（ 4）、珠心胚培養(yǎng)脫毒（ 5）、花藥培養(yǎng)脫毒十：簡述通過莖尖分生組織培養(yǎng)脫除植物病毒的一般程序選取感病程度輕的植株分離大小合適的莖尖分生組織莖尖分生組織培養(yǎng)病毒檢驗(yàn)十二：無病毒植物的檢測方法有哪些？（ 1）、直接檢測法: 直接觀察（ 2）、電鏡檢測法3）、指示植物法（4）、血清學(xué)檢測法（ 5）、分子檢測技術(shù)：PCR技術(shù)、探針雜交技術(shù)第五章1. 植物細(xì)胞培養(yǎng) (plant cell culture): 是指在離體條件下對植物單個(gè)細(xì)胞或小的細(xì)胞團(tuán)進(jìn)行培養(yǎng)并使其增殖，獲得大量細(xì)胞群體的一種技術(shù)。2. 植物單細(xì)胞分離： 由完整的

27、植物器官中分離單細(xì)胞機(jī)械法 ：指通過機(jī)械磨碎、切割植物體從而獲得游離的單細(xì)胞。細(xì)胞不受到酶的傷害；不用質(zhì)壁分離；細(xì)胞產(chǎn)量低；細(xì)胞易破。酶解法： 指用專一的水解酶 ( 纖維素酶、果膠酶、瓊脂酶等）在溫和條件下分解胞間層，分離細(xì)胞。細(xì)胞受到酶的傷害；要質(zhì)壁分離；細(xì)胞產(chǎn)量高；細(xì)胞不易破由培養(yǎng)組織分離單細(xì)胞：從培養(yǎng)的未分化的且疏松易碎的愈傷組織中分離單細(xì)胞3植物單細(xì)胞的培養(yǎng)技術(shù)：平板培養(yǎng) ：植板率 是能長出細(xì)胞團(tuán)的單細(xì)胞在接種單細(xì)胞總和中所占的比例?？醋o(hù)培養(yǎng) 是指用一塊活躍生長的愈傷組織來促進(jìn)培養(yǎng)細(xì)胞持續(xù)分裂和增殖的培養(yǎng)方法。飼養(yǎng)層培養(yǎng) 用處理過的、無活性或分裂慢的細(xì)胞來飼養(yǎng)所需培養(yǎng)的細(xì)胞，使其分裂和

28、生長。液體淺層靜置培養(yǎng)法：將一定密度懸浮細(xì)胞放在培養(yǎng)皿中形成一淺薄層封口靜止培養(yǎng)。細(xì)胞懸浮培養(yǎng)法：細(xì)胞接種于液體培養(yǎng)基中，在保持良好的分散狀態(tài)下培養(yǎng)。微室培養(yǎng) ：在人工制造的無菌小室中，將一滴懸浮細(xì)胞液培養(yǎng)在少量培養(yǎng)基上，使其分裂增殖形成細(xì)胞團(tuán)的方法4. 植物細(xì)胞的大規(guī)模培養(yǎng) （ p89-p95 ）懸浮培養(yǎng) ：分批培養(yǎng)，連續(xù)培養(yǎng)， 半連續(xù)培養(yǎng)固定化培養(yǎng) ：包埋法，吸附法植物細(xì)胞 大規(guī)模懸浮培養(yǎng)的優(yōu)點(diǎn) 1）可以增加培養(yǎng)細(xì)胞與培養(yǎng)液的接觸面，促進(jìn)營養(yǎng)吸收。2）可帶走培養(yǎng)物產(chǎn)生的有害代謝產(chǎn)物，避免高濃度積聚對細(xì)胞的傷害。3）保證良好的混合狀態(tài)，從而獲得良好的氣體傳遞效果細(xì)胞同步化： 同一懸浮培養(yǎng)體系

29、的所有細(xì)胞都同時(shí)通過細(xì)胞周期的某一特定時(shí)期，使細(xì)胞保持相對一致的細(xì)胞學(xué)和生理學(xué)狀態(tài)，便于研究細(xì)胞分裂和細(xì)胞代謝。細(xì)胞固定化 : 將游離的細(xì)胞包埋在多糖或多聚化合物制備成的網(wǎng)狀支持物中，培養(yǎng)液呈流動(dòng)狀態(tài)，進(jìn)行無菌培養(yǎng)的一種技術(shù)。細(xì)胞固定化意義 1）細(xì)細(xì)胞生長較慢，有利于次生代謝物的積累。2）易控制化學(xué)環(huán)境、收獲次生代謝產(chǎn)物。3）細(xì)胞經(jīng)包埋后受剪切力損傷小。4）有利于進(jìn)行連續(xù)培養(yǎng)和生物轉(zhuǎn)化。5. 影響次生代謝產(chǎn)物的因素1）生物因素：細(xì)胞株，細(xì)胞凋亡，細(xì)胞團(tuán)，生物合成機(jī)制2）化學(xué)因素：營養(yǎng)鹽，前體，誘導(dǎo)子，反饋抑制3）物理因素：光照，溫度，PH4）工程技術(shù)問題：培養(yǎng)液的流變特性，氣體傳遞，攪拌與剪切

30、力，泡沫與器壁表面粘附性P92細(xì)胞生長量的計(jì)算提高次生代謝產(chǎn)物產(chǎn)量的途徑1）培養(yǎng)設(shè)備：選擇或設(shè)計(jì)合適的生物反應(yīng)器。2）培養(yǎng)工藝：誘導(dǎo)子添加、前體喂養(yǎng)、添加競爭途徑代謝產(chǎn)物抑制劑、培養(yǎng)條件（培養(yǎng)基、環(huán)境條件）優(yōu)化與控制、流加培養(yǎng)、起始材料的選擇。 3）培養(yǎng)技術(shù)：固定化培養(yǎng)技術(shù)、兩相培養(yǎng)技術(shù)、兩步法培養(yǎng)（第1 步細(xì)胞生長；第 2 步產(chǎn)物積累）、毛狀根培養(yǎng)技術(shù)、冠癭培養(yǎng)技術(shù)、反義技術(shù)）。6、植物細(xì)胞生物反應(yīng)器：用于植物細(xì)胞批量化培養(yǎng)的裝置及其相應(yīng)控制系統(tǒng)。要求：具有適宜的氧傳遞、良好的流動(dòng)性和較低的剪切力。根據(jù)大規(guī)模培養(yǎng)方法主要分為懸浮培養(yǎng)生物反應(yīng)器和固定化培養(yǎng)生物反應(yīng)器兩種。7、初級代謝產(chǎn)物 ：通

31、過初級代謝產(chǎn)生的維持細(xì)胞生命活動(dòng)必需的物質(zhì)，如氨基酸、核苷酸、多糖、脂類等。 8、次級代謝產(chǎn)物 ：通過次級代謝合成的產(chǎn)物，是指植物中一大類并非植物生長發(fā)育所必需的小分子有機(jī)化合物，其產(chǎn)生和分布通常有種屬、器官組織和生長發(fā)育期的特異性。9、生產(chǎn)次生代謝物的程序：（ 1）誘導(dǎo)植物產(chǎn)生旺盛生長的愈傷組織和懸浮細(xì)胞系；（2）篩選高產(chǎn)細(xì)胞系 ( 株 ) ；（ 3）在生物反應(yīng)器中進(jìn)行大規(guī)模培養(yǎng)，獲得所需次生代謝物；培養(yǎng)條件p103 前體飼喂誘導(dǎo)子10、細(xì)胞系 ：由原代培養(yǎng)經(jīng)傳代培養(yǎng)純化，獲得的以一種細(xì)胞為主的、能在體外長期生存的不均一的細(xì)胞群體。11、細(xì)胞株：從一個(gè)經(jīng)過生物學(xué)鑒定的細(xì)胞系用單細(xì)胞分離培養(yǎng)或

32、通過篩選的方法，由單細(xì)胞增殖形成的細(xì)胞群。再由原細(xì)胞株進(jìn)一步分離培養(yǎng)出與原株性狀不同的細(xì)胞群，亦可稱之為亞株7. 什么是懸浮細(xì)胞培養(yǎng) ?固定化培養(yǎng) ?答：細(xì)胞懸浮培養(yǎng)法：指將細(xì)胞接種于液體培養(yǎng)基中，在保持良好的分散狀態(tài)下培養(yǎng)。與固體培養(yǎng)相比。懸浮培養(yǎng)優(yōu)點(diǎn)： 增加培養(yǎng)細(xì)胞與培養(yǎng)液的接觸面積，改善營養(yǎng)供應(yīng)，避免有毒代謝產(chǎn)物的聚集，保證氧氣的充分供應(yīng)等。懸浮培養(yǎng)類型：成批培養(yǎng)、連續(xù)培養(yǎng)和半連續(xù)培養(yǎng)。細(xì)胞固定化 ：指將游離的細(xì)胞包埋在多糖或多聚化合物制備成的網(wǎng)狀支持物中，培養(yǎng)液呈流動(dòng)狀態(tài)，進(jìn)行無菌培養(yǎng)的一種技術(shù)。包括包埋法和吸附法。細(xì)胞固定化意義 1）細(xì)胞生長較慢，有利于次生代謝物的積累。 2）易控制

33、化學(xué)環(huán)境、收獲次生代謝產(chǎn)物。3）細(xì)胞經(jīng)包埋后受剪切力損傷小。4）有利于進(jìn)行連續(xù)培養(yǎng)和生物轉(zhuǎn)化。8. 植物細(xì)胞大規(guī)模培養(yǎng)體系的建立程序是怎樣的?答：誘導(dǎo)植物產(chǎn)生旺盛生長的愈傷組織和懸浮細(xì)胞系篩選高產(chǎn)細(xì)胞系( 株 ) 在生物反應(yīng)器中進(jìn)行大規(guī)模培養(yǎng)，獲得所需次生代謝物1、分離植物單細(xì)胞的方法有哪些？答： a、機(jī)械法：先將葉片常規(guī)消毒后于無菌條件下輕輕研碎，在經(jīng)過一定孔徑的不銹鋼篩網(wǎng)過濾和離心得到凈化細(xì)胞；b、酶解法：利用果膠酶和纖維素酶處理植物葉片，使細(xì)胞分離；c、愈傷組織誘導(dǎo)法。、2、植物單細(xì)胞培養(yǎng)的方法有哪些？各有何特點(diǎn)？答： a、平板培養(yǎng)法特點(diǎn)：單細(xì)胞在培養(yǎng)基中分布均勻，便于定點(diǎn)觀察，易篩選；

34、通氣差，排泄物易積累造成細(xì)胞毒害b、看護(hù)培養(yǎng)特點(diǎn)：簡便、成功率高；不能在顯微鏡下直接觀察.c 、飼養(yǎng)層培養(yǎng)特點(diǎn)：操作簡便；不能在顯微鏡下追蹤細(xì)胞的分裂和細(xì)胞團(tuán)的形成 d、微室培養(yǎng)法特點(diǎn)：在培養(yǎng)過程中可連續(xù)進(jìn)行顯微鏡觀察；由于培養(yǎng)基少，水分難以保持，培養(yǎng)基的成分及pH 等也易于變動(dòng)，細(xì)胞短期培養(yǎng)后往往不能再生長。e、液體淺層靜置培養(yǎng)法特點(diǎn) : 易于補(bǔ)加新鮮培養(yǎng)基、可以鏡檢3、什么叫細(xì)胞的懸浮培養(yǎng)？分批培養(yǎng)和連續(xù)培養(yǎng)各有何特點(diǎn)？答：懸浮培養(yǎng) : 是指將單個(gè)游離細(xì)胞或小細(xì)胞團(tuán)在液體培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)增殖的技術(shù)。分批培養(yǎng)的特點(diǎn)：a、有一定的氣體交換；b、培養(yǎng)系統(tǒng)不與外部環(huán)境進(jìn)行物質(zhì)交換；c、培養(yǎng)體積固定

35、。連續(xù)培養(yǎng)的特點(diǎn)：a、培養(yǎng)規(guī)模大； b、可以添加新鮮培養(yǎng)液； c、使細(xì)胞保持在對數(shù)期。4、在細(xì)胞懸浮培養(yǎng)中，如何進(jìn)行細(xì)胞生長量的計(jì)算？答：細(xì)胞生長量的測定一般方法有：（1）細(xì)胞計(jì)數(shù)：在顯微鏡下記數(shù)，以cells/ml表示單位體積里的細(xì)胞濃度（2）細(xì)胞密實(shí)體積（ PCV）：以每毫升培養(yǎng)液中細(xì)胞總體積的毫升數(shù)表示。測定時(shí)，將細(xì)胞離心于離心管內(nèi)，測定細(xì)胞層所占的體積。（ 3）細(xì)胞鮮重或干重：過濾后直接稱重為鮮重，干燥后再稱得到的是干重。（4）有絲分裂指數(shù)（MI）：是指在一個(gè)細(xì)胞群體中，處于有絲分裂的細(xì)胞占總細(xì)胞的百分?jǐn)?shù)。對于愈傷組織有絲分裂指數(shù)的測定一般采用富爾根染色法。對于懸浮培養(yǎng)的細(xì)胞則先離心，

36、然后置于載玻片上用乙酸洋紅染色并鏡檢。5、懸浮培養(yǎng)細(xì)胞同步化的方法？答： A、物理方法 (1)體積選擇法 :將培養(yǎng)一段時(shí)間的細(xì)胞經(jīng)過一定大小的篩網(wǎng)過濾 , 收集篩網(wǎng)上層的細(xì)胞; 再經(jīng)過較小孔徑篩網(wǎng)上面的細(xì)胞. 選擇每一孔徑篩網(wǎng)過濾得到的細(xì)胞分別再進(jìn)行培養(yǎng).(2)冷處理法 :收集細(xì)胞 , 在 4溫度下處理數(shù)天, 添加新鮮培養(yǎng)液培養(yǎng).B 、化學(xué)方法 (1) 饑餓法：先對細(xì)胞斷絕供應(yīng)一種進(jìn)行細(xì)胞分裂所必需的營養(yǎng)成分或激素，使細(xì)胞停滯在G1期或 G2 期，經(jīng)過一段時(shí)間的饑餓之后，當(dāng)重新在培養(yǎng)基中加入這種限制因子時(shí)，靜止細(xì)胞就會同步進(jìn)入分裂。 (2) 抑制法：通過向培養(yǎng)基中添加尿苷(1 g/ml),5-

37、氟脫氧尿苷 (2 g/ml) 等化學(xué)抑制劑抑制細(xì)胞分裂 , 可使培養(yǎng)細(xì)胞同步化。 (3) 有絲分裂抑制法 : 在指數(shù)生長期的細(xì)胞懸浮培養(yǎng)物中加入一定濃度的秋水仙素。6、如何提高植物次生代謝產(chǎn)物的產(chǎn)量？答： A、篩選得到高產(chǎn)細(xì)胞系（株）常用方法有：（1）、克隆選擇（有相同遺傳基因的細(xì)胞群） ：指通過單細(xì)胞克隆技術(shù)和細(xì)胞團(tuán)克隆技術(shù)，將培養(yǎng)細(xì)胞中能夠積累較多次生代謝物且具有相同遺傳基因的細(xì)胞群挑選出來，并加以適當(dāng)?shù)呐囵B(yǎng)形成高產(chǎn)細(xì)胞系。（2）、抗性選擇：指在選擇壓力下，通過直接或間接的方法得到抗性變異的細(xì)胞系。（3）、誘導(dǎo)選擇：是通過化學(xué)誘變或紫外線照射等各種物理化學(xué)方法誘變產(chǎn)生比原親本細(xì)胞全成能力高

38、的細(xì)胞系（株）B、培養(yǎng)條件（ 1）、適宜溫度（ 2）、不斷調(diào)節(jié) PH（ 3）、營養(yǎng)成分：一方面要滿足植物細(xì)胞的生長所需，另一方面要使每個(gè)細(xì)胞都能合成和積累次生代謝產(chǎn)物。（4）、光：包括光強(qiáng)、光質(zhì)和光照時(shí)間對細(xì)胞生長和次生代謝產(chǎn)物合成都有一定影響。（5）、通氣量和攪拌轉(zhuǎn)速（ 6）、前體飼喂。 7、活力鑒定的方法。 答： a、相差顯微鏡觀察法：在相差顯微鏡下觀察細(xì)胞質(zhì)環(huán)流和正常細(xì)胞核的存在與否來鑒別細(xì)胞的活性； b、 FDA 染色法： FDA 既不發(fā)熒光也不具極性。能自由地穿越細(xì)胞質(zhì)膜；c、伊凡藍(lán)染色法：利用 0.025%的伊凡藍(lán)溶液對細(xì)胞進(jìn)行處理時(shí)，只有活力受損傷的細(xì)胞和死細(xì)胞能夠攝取這種染料，

39、而完整的活細(xì)胞則不不能攝取，所以不染色的細(xì)胞為活細(xì)胞。第六章植物原生質(zhì)體培養(yǎng)和體細(xì)胞雜交植物細(xì)胞原生質(zhì)體： 除去細(xì)胞壁后裸露的有活力的原生質(zhì)團(tuán)。用機(jī)械方法 和或 酶解法 可除去細(xì)胞壁，得到原生質(zhì)體。原生質(zhì)體培養(yǎng)： 將植物細(xì)胞游離成原生質(zhì)體，在適宜的培養(yǎng)條件下，使其再生細(xì)胞壁，進(jìn)而細(xì)胞進(jìn)行持續(xù)分裂形成細(xì)胞團(tuán)，進(jìn)一步生長行程愈傷組織或胚胎，最后分化或發(fā)育形成完整植株的過程。體細(xì)胞雜交 又稱原生質(zhì)替融合，是指在人工控制條件下，不經(jīng)過有性過程，兩種體細(xì)胞原生質(zhì)體相互融合產(chǎn)生雜種細(xì)胞。細(xì)胞壁 的主要成分是纖維素，半纖維素，果膠質(zhì)和少量的蛋白質(zhì)。去除細(xì)胞壁，獲得大量有活力的植物原生質(zhì)體是進(jìn)行原生質(zhì)體培養(yǎng)和

40、體細(xì)胞雜交的前提和基礎(chǔ)。一 . 原生質(zhì)體的分離（一） 材料來源1.植物幼嫩的葉片 2.無菌實(shí)生苗的子葉和下胚軸3.外植體來源的愈傷組織和懸浮培養(yǎng)細(xì)胞系4.花粉細(xì)胞（二）材料的 預(yù)處理： 枝條暗處理，低溫處理，葉片萎蔫處理，預(yù)培養(yǎng)，藥物及添加物處理和預(yù)先質(zhì)壁分離處理等。（三）酶的種類及酶液配制1.酶的種類： 纖維素酶類，果膠酶類，蝸牛酶和胼胝質(zhì)酶 。在分離原生質(zhì)體時(shí)，常常將纖維素酶和果膠酶混合使用，利用果膠酶分解果膠質(zhì)的特性從組織中將細(xì)胞游離出來，再在纖維素酶的作用下，把細(xì)胞壁分解而釋放出原生質(zhì)體。2.酶液 配制：分離培養(yǎng)基，酶和滲透壓穩(wěn)定劑組成。植物材料經(jīng)酶液處理后的混合物中，除了完整無損的原

41、生質(zhì)體外，還有混雜有亞細(xì)胞碎片，維管束成分，未解離細(xì)胞，細(xì)胞團(tuán)和破碎的原生質(zhì)體等。（一）過濾 -離心法（二）漂浮法三）界面法活力測定： 形態(tài)識別法和染色法。染色法 :1.熒光素二乙酸脂染色法（ 當(dāng)紫外光照射時(shí)，熒光素便產(chǎn)生綠色熒光；而無活力的原生質(zhì)體不能分解 FDA,因此無熒光產(chǎn)生。）2. 伊凡藍(lán)染色法 （有活力但受損傷的細(xì)胞或死細(xì)胞能攝入，而完整的活細(xì)胞則不能。）3.酚藏花紅染色法（酚藏花能使無活力的原生質(zhì)體染成紅色，有活力的原原生質(zhì)體不染色。）原生質(zhì)體 數(shù)量和活力的因素：( 一) 材料的基因型和外植體( 二 ) 酶的種類、濃度與酶解時(shí)間( 三 ) 滲透壓穩(wěn)定劑( 四 ) 質(zhì)膜穩(wěn)定劑( 五)

42、 酶解方式 ( 六) 酸堿度 ( 七) 溫度和光照原生質(zhì)體的培養(yǎng)意義：第一建立單細(xì)胞無性系，第二用于原生質(zhì)體融合，第三遺傳轉(zhuǎn)化的良好受體，第四多種基礎(chǔ)理論研究的實(shí)驗(yàn)材料。培養(yǎng)方法： 液體淺層培養(yǎng)，固體平板培養(yǎng)和固液雙層培養(yǎng)三種。(一 )液體淺層培養(yǎng) 。優(yōu)點(diǎn)：操作 簡單，對原生質(zhì)體 傷害小 ，通氣性好 ，代謝物易擴(kuò)散， 形成 細(xì)胞團(tuán)或小愈傷物組織 后也易于轉(zhuǎn)移。缺點(diǎn)：原生質(zhì)體在培養(yǎng)基內(nèi)分布不均，常發(fā)生粘連或造成局部原生質(zhì)體的密度過高 ，從而 影響原生質(zhì)體再生細(xì)胞的進(jìn)一步生長發(fā)育 。(二 )固體平板培養(yǎng)， 優(yōu)點(diǎn)：原生質(zhì)體的位置被固定，可以避免細(xì)胞間有害代謝產(chǎn)物的影響，有利于單個(gè)原生質(zhì)體的細(xì)胞壁再生

43、以及細(xì)胞團(tuán)的形成全過程進(jìn)行定點(diǎn)觀察，易于統(tǒng)計(jì)分裂頻率和植板率 。缺點(diǎn)：操作 要求比較嚴(yán)格， 特別是原生質(zhì)體懸浮液與瓊脂糖培養(yǎng)基混合時(shí) 溫度必須合適。(三 )固液雙層培養(yǎng)， 優(yōu)點(diǎn)：當(dāng)液體培養(yǎng)基蒸發(fā)完消耗完時(shí)，分裂的小細(xì)胞團(tuán)會散落在固體培養(yǎng)基上而被固定，估計(jì)培養(yǎng)基中的成分也可以緩慢地釋放到培養(yǎng)基中，補(bǔ)充營養(yǎng)的消耗 。植物再生過程 1.細(xì)胞壁再生2.細(xì)胞分裂 3.植株再生影響原生質(zhì)體的培養(yǎng)因素：(一 )材料 1.基因型 2.原生質(zhì)體的來源（二）培養(yǎng)基 1.基本培養(yǎng)基2.無機(jī)鹽 3.激素 4.活性物質(zhì)5.酸堿度(三 )滲透壓穩(wěn)定劑（四）原生質(zhì)體的培養(yǎng)濃度（五）培養(yǎng)條件1.光照 2.溫度原生質(zhì)體步驟 1

44、 材料準(zhǔn)備（選材） 2 原生質(zhì)體分離（預(yù)處理） 3原生質(zhì)體純化 4 原生質(zhì)體培養(yǎng) 5體細(xì)胞胚的誘導(dǎo)與植株再生體細(xì)胞雜交意義 P125融合類型 自發(fā)融合 ：當(dāng)細(xì)胞壁溶解后， 胞間連絲 發(fā)生膨大，相鄰細(xì)胞原生質(zhì)體和細(xì)胞器通過膨大的胞間連絲融合 形成同核體，實(shí)現(xiàn)原生質(zhì)體的自發(fā)融合。誘發(fā)融合 ：將植物原生質(zhì)體制備出后，再加入誘導(dǎo)劑 或其他方法促使兩親本原生質(zhì)體融合的方法。（一）化學(xué)誘導(dǎo)融合法1.無機(jī)鹽誘導(dǎo)融合法 NaNO3能誘導(dǎo)原生質(zhì)體融合的原因是鈉離子能中和原生質(zhì)體表面的負(fù)電荷，使凝聚的原生質(zhì)體質(zhì)膜緊密接觸，促進(jìn)細(xì)胞融合。2.高 PH-高鈣離子誘導(dǎo)融合法鈣離子決定著細(xì)胞膜的穩(wěn)定性和可塑性，影響原生質(zhì)

45、體膜的融合；高PH既能夠改變質(zhì)膜的表面電荷，也能促進(jìn)原生質(zhì)體的集聚和融合。3.PEG 誘導(dǎo)融合法 PEG 是一種多聚化合物，由于PEG 分子具有輕微的負(fù)電性，可與具有正極集團(tuán)的水、蛋白質(zhì)和糖類等形成氫鍵，在原生質(zhì)體之間形成分子橋，從而使原生質(zhì)體發(fā)生粘連。優(yōu)點(diǎn)：成本低無需特殊設(shè)備融合細(xì)胞率高4.PEG-高 PH-高鈣離子誘導(dǎo)融合法 PEG 是相鄰原生質(zhì)體表面的分子橋。當(dāng) PEG 被高 PH、高鈣離子洗掉時(shí)，可能引起原生質(zhì)層表面電荷的紊亂和再分布，從而促進(jìn)了融合。體細(xì)胞雜種的篩選 : 1.互補(bǔ)選擇法 生長互補(bǔ)選擇法營養(yǎng)缺陷性互補(bǔ)選擇法抗性互補(bǔ)選擇法細(xì)胞代謝互補(bǔ)選擇法2.機(jī)械選擇法 :# 利用融合親

46、本的形態(tài)色澤上的差異 篩選雜種細(xì)胞#利用 熒光素標(biāo)記 分離雜種細(xì)胞#利用熒光激活細(xì)胞分選儀 自動(dòng)分離雜種細(xì)胞再生植株的鑒定 : 1. 形態(tài)學(xué)鑒定2. 細(xì)胞學(xué)鑒定 3. 同工酶鑒定 4.分子生物學(xué)鑒定1，目前用做原生質(zhì)體分離的材料主要有哪些？優(yōu)點(diǎn)？答：原生質(zhì)體的來源：(1) 來自各種植物的幼嫩的葉片、根尖，其中葉片由于取材容易而廣泛采用。（2）來自花粉，尤其是適合制備單倍體的原生質(zhì)體。（ 3）從組織培養(yǎng)產(chǎn)生的愈傷組織中獲得2、試述原生質(zhì)體分離的方法和步驟答： (1) 機(jī)械法：在細(xì)胞質(zhì)壁分離的狀態(tài)下，用利刀切割細(xì)胞壁,使原生質(zhì)體流出或釋放出來(2) 酶解法：常用的制備原生質(zhì)體的酶包括；果膠酶、蝸牛

47、酶、纖維素酶等。實(shí)際應(yīng)用中需要根據(jù)不同的細(xì)胞來源選擇合適的酶。酶解法分： 順序法（兩步法）：先用果膠酶預(yù)處理，再用纖維素酶直接法（一步法）：直接用果膠酶和纖維素酶優(yōu)點(diǎn)：獲得量大，適用廣泛。缺點(diǎn)：商品酶制劑均含有核酸酶、蛋白酶、過氧化物酶以及酚類物質(zhì)。會影響所獲原生質(zhì)體的活力。3、影響原生質(zhì)體分離效果的因素有哪些？試做分析答：供試材料的基因型和外植體酶解條件：酶質(zhì)量、組合、濃度、pH、光照和溫度、滲透壓穩(wěn)定劑質(zhì)膜穩(wěn)定劑分離條件：離心次數(shù)、離心速度、純化方法、分離純化持續(xù)時(shí)間、分離用具4、原生質(zhì)體純化主要有哪些方法？答： 1、過濾 -離心法 2、漂浮法：原生質(zhì)體比重較小,能在具有一定滲透壓的溶液

48、(如 25% 的蔗糖溶液 )中漂浮，然后用吸管收集。轉(zhuǎn)入另一管中，如此反復(fù)離心、懸浮 23次，即可獲得純原生質(zhì)體。優(yōu)點(diǎn): 制備的原生質(zhì)體較純凈.。缺點(diǎn):丟失的較多3、界面法：又稱不連續(xù)梯度法，采用兩種密度不同的溶液形成不連續(xù)梯度，通過離心使原生質(zhì)體與破損細(xì)胞分別處于不同液相中，從而純化原生質(zhì)體的方法。優(yōu)點(diǎn)：可以收集到數(shù)量較大的純凈原生質(zhì)體，同時(shí)保持著相同的滲透強(qiáng)度使原生質(zhì)體免受滲透沖擊而受損。5、為什么原生質(zhì)體要培養(yǎng)在等滲培養(yǎng)基中？答：只有培養(yǎng)在等滲培養(yǎng)基中植物才能正常生長如果植物的原生質(zhì)體培養(yǎng)在非等滲培養(yǎng)液中植物有可能會因?yàn)闈舛炔疃蚴鞘畯亩鴮?dǎo)致植物的死亡，所以植物的原生質(zhì)體要培養(yǎng)在等

49、滲培養(yǎng)基中。6、原生質(zhì)體培養(yǎng)中如何穩(wěn)定培養(yǎng)基的PH？答：分離原生質(zhì)體時(shí)，酶液的pH 值是值得注意的問題。因?yàn)榻到饷傅幕盍图?xì)胞活力最適 pH 值是不一致的。為了維持酶液的 PH 恒定，常用 0.05-0.1mol/L 的磷酸鹽溶液來配制酶液。此外， MES 對保持酶解物的酸堿環(huán)境也有緩沖作用。7、試分析影響原生質(zhì)體培養(yǎng)的主要因素供試材料的基因型和外植體酶解條件：酶質(zhì)量、組合、濃度、pH 、光照和溫度滲透壓穩(wěn)定劑質(zhì)膜穩(wěn)定劑分離條件：離心次數(shù)、離心速度、純化方法、分離純化持續(xù)時(shí)間。分離用具8、原生質(zhì)體的培養(yǎng)方法有哪些？各有何優(yōu)缺點(diǎn)？液體淺層培養(yǎng)法： 優(yōu)點(diǎn)： 原生質(zhì)體在液體環(huán)境中有較強(qiáng)的吸收營養(yǎng)物質(zhì)

50、的能力，表現(xiàn)出較強(qiáng)的細(xì)胞分裂能力。操作簡單，對原生質(zhì)體的損傷小，且易于添加新鮮培養(yǎng)基和轉(zhuǎn)移培養(yǎng)物。缺點(diǎn)：原生質(zhì)體分布不均勻，常常發(fā)生原生質(zhì)體之間的粘連現(xiàn)象而影響其進(jìn)一步的生長和發(fā)育。此外，難以跟蹤觀察某一個(gè)細(xì)胞的發(fā)育情況。雙層培養(yǎng)法液體 - 固體雙層培養(yǎng)法：優(yōu)點(diǎn)： 固體培養(yǎng)基中的營養(yǎng)物質(zhì)可以緩慢放到液體培養(yǎng)基中，如果在下層固體培養(yǎng)基中添加一定量的活性炭，則還可能吸附培養(yǎng)物產(chǎn)生的一些有害物質(zhì)，促進(jìn)原生質(zhì)體的分裂和細(xì)胞團(tuán)的形成。缺點(diǎn)：不易觀察細(xì)胞的發(fā)育過程。固體薄層培養(yǎng)法優(yōu)點(diǎn)：使原生質(zhì)體處于固定位置，避免了原生質(zhì)體的漂浮游動(dòng)，有利于對單個(gè)原生質(zhì)體的細(xì)胞壁再生及細(xì)胞團(tuán)形成的全過程進(jìn)行定點(diǎn)觀察。缺點(diǎn)：

51、培養(yǎng)基溫度對薄層質(zhì)量和原生質(zhì)體分布有一定影響；另外，固體中單細(xì)胞生活能力弱，通氣狀況不良，第一次細(xì)胞分裂時(shí)間會推遲2d 左右。9、為什么說原生質(zhì)體培養(yǎng)系統(tǒng)是現(xiàn)代生物技術(shù)的載體？（ 1）原生質(zhì)體培養(yǎng)可在遺傳學(xué)方面進(jìn)行基因互補(bǔ)，不親和性，連鎖群和基因鑒定，分析基因的激活和失活水平的研究。在研究分化問題時(shí)，用一個(gè)均一的原生質(zhì)體群體可以篩選數(shù)以千計(jì)的不同。營養(yǎng)和激素條件，探索誘導(dǎo)單細(xì)胞的分化條件等。（ 2）用于遠(yuǎn)緣體細(xì)胞融合，進(jìn)行體細(xì)胞雜交。這是一種新的遠(yuǎn)緣雜交方法，為人們提供新的育種方法。兩個(gè)親緣關(guān)系較遠(yuǎn)的植株用一般雜交方法是不容易成功的，而用細(xì)胞融合的方法卻成為可能。首先，兩個(gè)原生質(zhì)體融合形成異核體，異核體再再生細(xì)胞壁，進(jìn)行有絲分裂，發(fā)生核融合，產(chǎn)生雜種細(xì)胞，由此可培養(yǎng)新的雜種。10、原生質(zhì)體融合要經(jīng)過哪些過程？(1) 選擇親株為了獲得高產(chǎn)優(yōu)質(zhì)的融合子，首先應(yīng)該選擇遺傳性狀穩(wěn)定且具有優(yōu)勢互補(bǔ)的兩個(gè)親株。(2)