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文檔簡介
1、基礎(chǔ)分子生物學(xué)單元測驗(yàn) 時間 2000 10 9 一、 是非題 1ABC 這三種 DNA 都是有右手螺旋,而 ZDNA 是左手螺旋 ( ) 2在 DNA 的半保留復(fù)制過程中,每條 DNA 鏈都產(chǎn)生崗崎片段 ( ) 3基因就是編碼蛋白質(zhì)的多核苷酸序列 ( ) 4實(shí)驗(yàn)室常用 Rnase A 來降價 DNARNA 雜合體中的 RNA 分子 ( ) 二、 簡答題 1 為什么高含 GC 的 DNA 序列有較高的 Tm 值? 2 試論兼并密碼子的分子基礎(chǔ)。 3.他能用什么樣的實(shí)驗(yàn)證明模板mRNA只能識別tRNA而不是氨基酸?4.知大腸桿菌DNA總量為4.4x106bp, Cot1/2=9, 有終身物,其C
2、ot1/2=3x10-1,求其細(xì)胞中的DNA總量。 三、問答題1 .說說DNA組裝成染色體的主要過程。2 .寫出肽鏈合成起始、延伸和終止三個階段的主要步驟和主要因子。第五講第五講 分子生物學(xué)研究法分子生物學(xué)研究法 一、一、 重組重組 DNADNA 技術(shù)發(fā)展史上的重大事件技術(shù)發(fā)展史上的重大事件 1.1. 4040 年代確定了遺傳信息的攜帶者,即基因的分子載年代確定了遺傳信息的攜帶者,即基因的分子載體是體是 DNADNA 而不是蛋白質(zhì),解決了遺傳的物質(zhì)基礎(chǔ)問而不是蛋白質(zhì),解決了遺傳的物質(zhì)基礎(chǔ)問題;題; 2.502.50 年代提示了年代提示了 DNADNA 分子的雙螺旋結(jié)構(gòu)模型和半分子的雙螺旋結(jié)構(gòu)模
3、型和半 保留復(fù)制機(jī)制保留復(fù)制機(jī)制, ,解決了基因的自我復(fù)制和世代交替問題;解決了基因的自我復(fù)制和世代交替問題; 3.503.50 年代末至年代末至 6060 年代,相繼提出了“中心法則”和操年代,相繼提出了“中心法則”和操縱子學(xué)說縱子學(xué)說, ,成功地破譯了遺傳密碼, 充分認(rèn)識了遺傳信息成功地破譯了遺傳密碼, 充分認(rèn)識了遺傳信息的流動的流動和表達(dá)。和表達(dá)。 重組重組 DNA 技術(shù)歷史上的主要事件技術(shù)歷史上的主要事件 年份年份 事事 件件 1869 F Miescher 首次從萊茵河鮭魚精子中首次從萊茵河鮭魚精子中分離分離 DNA。 1944 O.T. Avery 證實(shí)證實(shí) DNA 是遺傳物質(zhì)。是
4、遺傳物質(zhì)。 1952 A.D. Hershey 和和 M.Chase再次證實(shí)噬再次證實(shí)噬菌體的遺傳物質(zhì)是菌體的遺傳物質(zhì)是 DNA。 1953 J.D.Watson 和和 F.H.C.Crick提出提出 DNA分子結(jié)構(gòu)的雙螺旋模型。分子結(jié)構(gòu)的雙螺旋模型。 M.Wilkins 用用 X-射線衍射法證實(shí)了這射線衍射法證實(shí)了這一結(jié)構(gòu)。一結(jié)構(gòu)。 1957 A.Kornberg 從大腸桿菌中發(fā)現(xiàn)了從大腸桿菌中發(fā)現(xiàn)了DNA 聚合酶聚合酶 I。 1958 M. Meselson 和和 F. W. Stahl 證實(shí)了證實(shí)了DNA 的半保留復(fù)制模型。的半保留復(fù)制模型。 1959- 1960 S. Ochoa 發(fā)現(xiàn)
5、發(fā)現(xiàn) RNA 聚合酶和信使聚合酶和信使RNA, 并證明, 并證明 mRNA 決定了蛋白質(zhì)分決定了蛋白質(zhì)分子中的氨基酸序列。子中的氨基酸序列。 1961 Nirenberg 破譯了第一個遺傳密碼;破譯了第一個遺傳密碼; F. Jacob和和 J. Monod提出了調(diào)節(jié)基因提出了調(diào)節(jié)基因表達(dá)的操縱子模型。表達(dá)的操縱子模型。 1964 C. Yanofsky 和和 S. Brenner 等人證明,等人證明,多肽鏈上的氨基酸序列與該基因中的多肽鏈上的氨基酸序列與該基因中的核苷酸序列核苷酸序列存在著共線性關(guān)系。存在著共線性關(guān)系。 1965 S. W. Holley完成了酵母丙氨酸完成了酵母丙氨酸t(yī)RNA
6、的的全序列測定;科學(xué)家證明細(xì)菌的抗藥性全序列測定;科學(xué)家證明細(xì)菌的抗藥性通常由“質(zhì)?!蓖ǔS伞百|(zhì)?!盌NA 所決定。所決定。 1966 M.W.Nirenberg,S. Ochoa、H.G. Khorana、F.H.C.Crick 等人破譯了全部等人破譯了全部遺傳密碼。遺傳密碼。 1970 H.O.Smith,K.W.Wilcox 和和 T.J.Kelley分離了第一種限制性核酸內(nèi)切酶。分離了第一種限制性核酸內(nèi)切酶。 H.M.Temin和和D.Baltimore從從RNA腫瘤腫瘤病毒中發(fā)現(xiàn)反轉(zhuǎn)錄酶。病毒中發(fā)現(xiàn)反轉(zhuǎn)錄酶。 1972 - 1973 H.Boyer,P.Berg 等人發(fā)展了等人發(fā)展了
7、 DNA 重組重組技術(shù),于技術(shù),于 72 年獲得第一個重組年獲得第一個重組 DNA 分分子,子,73 年完成第一例細(xì)菌基因克隆。年完成第一例細(xì)菌基因克隆。 1975 - 1977 F.Sanger 與與 A.Maxam、W.Gilbert 等人等人發(fā)明了發(fā)明了 DNA 序列測定技術(shù)。序列測定技術(shù)。1977 年完年完成了全長成了全長5387bp的噬菌體的噬菌體174基因組基因組測定。測定。 1978 首次在大腸桿菌中生產(chǎn)由人工合成基因首次在大腸桿菌中生產(chǎn)由人工合成基因表達(dá)的人腦激素和人胰島素。表達(dá)的人腦激素和人胰島素。 1980 美國聯(lián)邦最高法院裁定微生物基因工程美國聯(lián)邦最高法院裁定微生物基因工
8、程可以專利化??梢詫@?1981 R. D. Palmiter 和和 R. L. Brinster 獲得獲得轉(zhuǎn)基因小鼠;轉(zhuǎn)基因小鼠; A. C. Spradling 和和 G. M. Rubin 得到轉(zhuǎn)基因果蠅。得到轉(zhuǎn)基因果蠅。 1982 美、英批準(zhǔn)使用第一例基因工程藥物美、英批準(zhǔn)使用第一例基因工程藥物胰島素;胰島素;Sanger 等人完成了入噬等人完成了入噬菌體菌體 48,502bp 全序列測定。全序列測定。 1983 獲得第一例轉(zhuǎn)基因植物。獲得第一例轉(zhuǎn)基因植物。 1984 斯坦福大學(xué)獲得關(guān)于重組斯坦福大學(xué)獲得關(guān)于重組 DNA 的專的專利。利。 1986GMO初次在環(huán)境中釋放。初次在環(huán)境
9、中釋放。 1988J. D. Watson出任出任“人類基因人類基因組方案首席科學(xué)家。組方案首席科學(xué)家。 1989DuPont公司獲得轉(zhuǎn)腫瘤基公司獲得轉(zhuǎn)腫瘤基因小鼠因小鼠“Oncomouse。 1992歐共體歐共體35個實(shí)驗(yàn)室結(jié)合完成個實(shí)驗(yàn)室結(jié)合完成酵母第三染色體全序列測定酵母第三染色體全序列測定(315kb)。 1994 第一批基因工程西紅柿在美第一批基因工程西紅柿在美國上市。國上市。 1996 完成了酵母基因組完成了酵母基因組(1.25107bp)全序列測定。全序列測定。 1997 英國愛丁堡羅斯林研究所獲英國愛丁堡羅斯林研究所獲得克隆羊。得克隆羊。 基因工程中常見的名詞:基因工程中常見的
10、名詞: 遺傳工程遺傳工程genetic engineering, 基因操作基因操作gone manipulation, 重組重組 DNA 技術(shù)技術(shù) recombinant DNA technology, 基因克隆基因克隆gone cloning, 分子克隆分子克隆molecular cloning。 基因工程的主要內(nèi)容或步驟基因工程的主要內(nèi)容或步驟 從生物有機(jī)體基因組中,分離出從生物有機(jī)體基因組中,分離出帶有目的基因的帶有目的基因的 DNA 片段。片段。 將帶有目的基因的外源將帶有目的基因的外源 DNA 片片段連接到能夠自我復(fù)制的并具有段連接到能夠自我復(fù)制的并具有選擇記號的載體分子上,形成重選
11、擇記號的載體分子上,形成重組組 DNA 分子。分子。 將重組將重組 DNA 分子轉(zhuǎn)移到適當(dāng)?shù)姆肿愚D(zhuǎn)移到適當(dāng)?shù)氖荏w細(xì)胞(亦稱寄主細(xì)胞)并與受體細(xì)胞(亦稱寄主細(xì)胞)并與之一起增殖。之一起增殖。 4 4、從大量的細(xì)胞繁衍群體中,挑選出、從大量的細(xì)胞繁衍群體中,挑選出獲得了重組獲得了重組DNADNA分子的受體細(xì)胞,并挑分子的受體細(xì)胞,并挑選出曾經(jīng)得到擴(kuò)增的目的基因。選出曾經(jīng)得到擴(kuò)增的目的基因。5 5、將目的基因克隆到表達(dá)載體上,導(dǎo)、將目的基因克隆到表達(dá)載體上,導(dǎo)入寄主細(xì)胞,使之在新的遺傳背景下入寄主細(xì)胞,使之在新的遺傳背景下實(shí)現(xiàn)功能表達(dá),產(chǎn)生出人類所需求的實(shí)現(xiàn)功能表達(dá),產(chǎn)生出人類所需求的物質(zhì)。物質(zhì)。D
12、NA的脈沖電泳技術(shù)的脈沖電泳技術(shù)PFGE pulse-field gel electrophoresis無規(guī)那么ab c aba超大分子,不超大分子,不能有效地被普能有效地被普通電泳所分別。通電泳所分別。a、b表示每次表示每次電泳的不同方電泳的不同方向,向,c為為DNA分子的最終挪分子的最終挪動方向。動方向。運(yùn)用脈沖電場運(yùn)用脈沖電場技術(shù),可分別技術(shù),可分別高達(dá)高達(dá)107bp的的DNA分子。分子。二、二、 基因操作的主要技術(shù)原理基因操作的主要技術(shù)原理 1 1 核酸的凝膠電泳核酸的凝膠電泳 (Agarose (Agarose & Polyacrylamide& Polyacryla
13、mide) ) 將某種分子放到特定的電場將某種分子放到特定的電場中,它就會以一定的速度向適當(dāng)?shù)闹校蜁砸欢ǖ乃俣认蜻m當(dāng)?shù)碾姌O移動。電極移動。 某物質(zhì)在電場作用下的遷移某物質(zhì)在電場作用下的遷移速度叫作電泳的速率,它與電場強(qiáng)速度叫作電泳的速率,它與電場強(qiáng)度成正比,與該分子所攜帶的凈電度成正比,與該分子所攜帶的凈電荷數(shù)成正比,而與分子的磨擦系數(shù)荷數(shù)成正比,而與分子的磨擦系數(shù)成反比(分子大小、極性、介質(zhì)的成反比(分子大小、極性、介質(zhì)的粘度系數(shù)等) 。粘度系數(shù)等) 。 在生理?xiàng)l件下,核酸分子中的磷酸在生理?xiàng)l件下,核酸分子中的磷酸基團(tuán)是離子化的,所以,基團(tuán)是離子化的,所以,DNADNA 和和 RNAR
14、NA 實(shí)實(shí)際上呈多聚陰離子狀態(tài)(際上呈多聚陰離子狀態(tài)(PolyanionsPolyanions) 。) 。 將將 DNADNA、RNARNA 放到電場中,它就會由放到電場中,它就會由負(fù)極正極移動。負(fù)極正極移動。 AgaroseAgarose 的分離范圍在的分離范圍在 50bp50bp數(shù)十?dāng)?shù)十 kbkb (4.0%) (0.3%) (4.0%) (0.3%) Polyacrylamide(PAGE)Polyacrylamide(PAGE),1 11000bp1000bp (20%) (4%) (20%) (4%) 在凝膠電泳中,一般加入溴化乙在凝膠電泳中,一般加入溴化乙錠(錠(EB)ethidi
15、um bromide 染染色, 此時, 核酸分子在紫外光下發(fā)出色, 此時, 核酸分子在紫外光下發(fā)出熒光, 肉眼能看到約熒光, 肉眼能看到約 50ng DNA 所形所形成的條帶。成的條帶。 D DN NA A的的 脈脈 沖沖 電電 泳泳 技技 術(shù)術(shù) ( (P PF FG GE E P Pu ul ls se e- -f fi ie el ld d g ge el l e el le ec ct tr ro op ph ho or re es si is s) ). . 2 核酸的分子雜交技術(shù)核酸的分子雜交技術(shù) 在大多數(shù)核酸雜交反應(yīng)中,經(jīng)過在大多數(shù)核酸雜交反應(yīng)中,經(jīng)過凝膠電泳凝膠電泳 分離的分離的
16、DNA或或RNA分子,分子,都是在雜交之前,通過毛細(xì)管作用或都是在雜交之前,通過毛細(xì)管作用或電導(dǎo)作用按其在凝膠中的位置原封不電導(dǎo)作用按其在凝膠中的位置原封不動地“吸印”動地“吸印” 轉(zhuǎn)移到濾膜上的。常用轉(zhuǎn)移到濾膜上的。常用的濾膜有尼龍濾膜、 硝酸纖維素濾膜,的濾膜有尼龍濾膜、 硝酸纖維素濾膜,疊氮苯氧甲基纖維素濾紙(疊氮苯氧甲基纖維素濾紙(DBM)和)和二乙氨基乙基纖維素濾膜(二乙氨基乙基纖維素濾膜(DEAE)等。等。 核酸分子雜交實(shí)驗(yàn)包括如下兩個步驟:核酸分子雜交實(shí)驗(yàn)包括如下兩個步驟: 1.將核酸樣品轉(zhuǎn)移到固體支持物濾膜將核酸樣品轉(zhuǎn)移到固體支持物濾膜上,這個過程特稱為核酸印跡上,這個過程特稱
17、為核酸印跡(nucleic acid blotting)轉(zhuǎn)移,主要有電泳凝膠核酸印跡轉(zhuǎn)移,主要有電泳凝膠核酸印跡法 、 斑 點(diǎn) 和 狹 線 印 跡 法法 、 斑 點(diǎn) 和 狹 線 印 跡 法(dot and slot blotting)、 菌落和噬菌斑印跡法、 菌落和噬菌斑印跡法(colony and plaque blotting); 2.將具有核酸印跡的濾膜同帶有放射將具有核酸印跡的濾膜同帶有放射性標(biāo)記或其它標(biāo)記的性標(biāo)記或其它標(biāo)記的 DNA 或或 RNA 探針進(jìn)探針進(jìn)行雜交。所以有時也稱這類核酸雜交為印行雜交。所以有時也稱這類核酸雜交為印跡雜交跡雜交。 3 細(xì)菌的轉(zhuǎn)化細(xì)菌的轉(zhuǎn)化 所謂細(xì)菌轉(zhuǎn)化
18、,是指一種細(xì)菌所謂細(xì)菌轉(zhuǎn)化,是指一種細(xì)菌菌株由于捕獲了來自另一種細(xì)菌菌菌株由于捕獲了來自另一種細(xì)菌菌株的株的 DNA,而導(dǎo)致性狀特征發(fā)生遺,而導(dǎo)致性狀特征發(fā)生遺傳改變的生命過程。這種提供轉(zhuǎn)化傳改變的生命過程。這種提供轉(zhuǎn)化DNA 的菌株叫做供體菌株,而接受的菌株叫做供體菌株,而接受轉(zhuǎn)化轉(zhuǎn)化 DNA 的寄主菌株則稱做受體的寄主菌株則稱做受體菌株。菌株。 大大腸腸桿桿菌菌是是最最廣廣泛泛使使用用的的實(shí)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)菌菌株株。在在加加入入轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)化化 DNA 之之前前,必必須須預(yù)預(yù)先先用用 Cacl2 處處理理大大腸腸桿桿菌菌細(xì)細(xì)胞胞,使使之之呈呈感感受受態(tài)態(tài) (Competent Cells) 。 Mg2+對對
19、維維持持外外源源 DNA 的的穩(wěn)穩(wěn)定定性性起起重重要要作作用用,質(zhì)質(zhì)粒粒 DNA 中中的的抗抗生生素素是是篩篩選選標(biāo)標(biāo)記記。 對對絕絕大大多多數(shù)數(shù) hsdR-,hsdM-突突變變體體菌菌株株 (k12) , 每每 ug DNA 可可得得 107-108個個轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)化化子子。 4 DNA 序列分析序列分析 a. Sanger 的雙脫氧鏈終止法的雙脫氧鏈終止法 Cambridge的的F. Sanger在在1977年發(fā)明用雙脫年發(fā)明用雙脫氧鏈終止法測定單鏈氧鏈終止法測定單鏈 DNA 的序列,其基本原的序列,其基本原理如下:理如下: DNA 聚合酶能夠用單鏈聚合酶能夠用單鏈 DNA 作為模板, 合作為模板
20、, 合成準(zhǔn)確的成準(zhǔn)確的 DNA 互補(bǔ)鏈;互補(bǔ)鏈; 該酶能夠用該酶能夠用 2,3雙脫氧核苷三磷酸作雙脫氧核苷三磷酸作底物并將其聚合到新生寡核苷酸鏈的底物并將其聚合到新生寡核苷酸鏈的3-末端,末端,從而終止其延伸反應(yīng)。從而終止其延伸反應(yīng)。 在在 DNA 測測序序反反應(yīng)應(yīng)中中,加加入入模模板板 DNA,引引物物(特特異異性性引引物物,如如 T7,T3,M13 等等) ,DNA 聚聚合合酶酶,dA,dT,dG,dC 和和一一種種 ddNTP。 常常用用 Klenow 大大片片段段,無無 53外外切切酶酶活活性性。 b b MaxamMaxam- -GilbertGilbert 化學(xué)修飾法化學(xué)修飾法(
21、(哈哈佛大學(xué)佛大學(xué)) ) 該方法的基本原理是用化學(xué)試劑該方法的基本原理是用化學(xué)試劑處理具有末端放射性標(biāo)記的處理具有末端放射性標(biāo)記的 DNADNA 片片段,造成堿基的特異性切割并產(chǎn)生一段,造成堿基的特異性切割并產(chǎn)生一組具有不同長度的組具有不同長度的 DNADNA 鏈降解產(chǎn)物,鏈降解產(chǎn)物,經(jīng)凝膠電泳分離和放射自顯影之后,經(jīng)凝膠電泳分離和放射自顯影之后,可直接讀出待測可直接讀出待測 DNADNA 片段的核苷酸序片段的核苷酸序列。列。 該反應(yīng)的關(guān)鍵在于使該反應(yīng)的關(guān)鍵在于使 DNA的的 4種核苷酸中,只有種核苷酸中,只有 1-2 種發(fā)生特異種發(fā)生特異性的化學(xué)切割反應(yīng):性的化學(xué)切割反應(yīng): 堿基的特異性修飾
22、;堿基的特異性修飾; 被修飾的堿基從核糖環(huán)上轉(zhuǎn)被修飾的堿基從核糖環(huán)上轉(zhuǎn)移;移; 失去堿基的糖環(huán)部位發(fā)生失去堿基的糖環(huán)部位發(fā)生 DNA鏈斷裂。鏈斷裂。 專門用來對核苷酸作化學(xué)修飾,專門用來對核苷酸作化學(xué)修飾,并打斷磷酸二酯鍵的化學(xué)試劑有硫并打斷磷酸二酯鍵的化學(xué)試劑有硫酸 二 甲 酯酸 二 甲 酯 (dimethylsulphate) 和 肼和 肼(hydrazine)。 硫酸二甲酯是堿性化學(xué)試劑,硫酸二甲酯是堿性化學(xué)試劑,能使能使 DNA 鏈中鳥嘌呤的鏈中鳥嘌呤的 N7 和腺嘌和腺嘌呤的呤的 N6 位發(fā)生甲基化,在中性位發(fā)生甲基化,在中性 PH環(huán)境中就能使糖苷鍵發(fā)生水解,并環(huán)境中就能使糖苷鍵發(fā)生
23、水解,并引起引起 DNA 鏈的斷裂。鏈的斷裂。 在堿性條件下,肼能特在堿性條件下,肼能特異性切割異性切割 C 和和 T。如果加。如果加入入 1 mol/L 的的 Nacl,那么,那么,只有只有 C 被特異性切割。被特異性切割。 c c D DN NA A 序序列列分分析析自自動動化化 用用四四甲甲基基若若丹丹明明( (T Te et tr ra am me et th hy yl lr rh ho od da am mi in ne e) ) 作作 為為熒熒光光劑劑標(biāo)標(biāo)記記 D DN NA A 引引物物,帶帶有有這這種種引引物物的的 D DN NA A 片片段段能能在在激激光光誘誘導(dǎo)導(dǎo)下下發(fā)發(fā)
24、出出熒熒光光。按按照照標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)準(zhǔn)的的雙雙脫脫氧氧終終止止法法或或化化學(xué)學(xué)終終止止法法進(jìn)進(jìn)行行測測序序反反應(yīng)應(yīng),跑跑 D DN NA A 凝凝膠膠后后用用計計算算機(jī)機(jī)檢檢測測。 d d. .D DN NA A雜雜交交測測序序法法( (S SB BH H- -S Se eq qu ue en nc ci in ng g b by y h hy yb br ri id di iz za at ti io on n) ) 如如果果一一段段較較短短的的 D DN NA A 探探針針能能與與較較長長的的 D DN NA A 片片段段雜雜交交,并并形形成成完完全全的的雙雙鏈鏈結(jié)結(jié)構(gòu)構(gòu),我我們們就就推推測測在在
25、靶靶 D DN NA A 上上存存在在著著相相應(yīng)應(yīng)的的互互補(bǔ)補(bǔ)序序列列,這這就就是是 D DN NA A 雜雜交交測測序序法法的的基基本本原原理理。 如如果果將將一一種種 12-mer 的的靶靶 DNA 與與完完全全隨隨機(jī)機(jī)合合成成的的8-mer 寡寡核核苷苷酸酸控控針針混混合合雜雜交交,在在總總數(shù)數(shù)為為 48=65536種種 8-mer 的的控控針針群群體體中中,僅僅有有 5 種種探探針針會會與與靶靶 DNA雜雜交交,形形成成完完全全互互補(bǔ)補(bǔ)的的雙雙鏈鏈分分子子。 當(dāng)靶當(dāng)靶 DNADNA 與標(biāo)記探針形成與標(biāo)記探針形成 G G- -T T 或或G G- -A A 末端堿基錯配的雙鏈體時,檢測末
26、端堿基錯配的雙鏈體時,檢測有一定難度。寡核苷酸探針越短,堿有一定難度。寡核苷酸探針越短,堿基錯配造成的去穩(wěn)定效應(yīng)越明顯, 較基錯配造成的去穩(wěn)定效應(yīng)越明顯, 較易與完全的雙鏈體分子相區(qū)分。易與完全的雙鏈體分子相區(qū)分。 但是,探針短,雜交產(chǎn)物的總體但是,探針短,雜交產(chǎn)物的總體穩(wěn)定性下降,信穩(wěn)定性下降,信/ /噪比下降,影響結(jié)噪比下降,影響結(jié)果的可靠性。所以,果的可靠性。所以,6 6- -mermer 寡核苷酸寡核苷酸矩陣芯片只能用于測定矩陣芯片只能用于測定 500bp500bp 的靶的靶DNADNA;7 7- -mer=2000bpmer=2000bp,8 8- -mer=8000bpmer=80
27、00bp。 SBH 的應(yīng)用:的應(yīng)用: 可有效檢測靶可有效檢測靶 DNA 中的單堿基突變;中的單堿基突變; 可用于不同可用于不同 DNA 片段之間的序列比較;片段之間的序列比較; 可用于檢測不同生長發(fā)育狀態(tài)下細(xì)胞中特可用于檢測不同生長發(fā)育狀態(tài)下細(xì)胞中特定基因的表達(dá)狀況;定基因的表達(dá)狀況; 可用于檢驗(yàn)傳統(tǒng)測序技術(shù)的準(zhǔn)確性??捎糜跈z驗(yàn)傳統(tǒng)測序技術(shù)的準(zhǔn)確性。 5 基因的定點(diǎn)誘變(基因的定點(diǎn)誘變(site-directed mutagenesis) 使已克隆基因或使已克隆基因或 DNA片段中的任何片段中的任何一個特定堿基發(fā)生取代、插入或缺失變化一個特定堿基發(fā)生取代、插入或缺失變化的過程叫作基因的定點(diǎn)誘變
28、,是基因工程的過程叫作基因的定點(diǎn)誘變,是基因工程和蛋白質(zhì)工程的重要手段。和蛋白質(zhì)工程的重要手段。 a. 盒式誘變盒式誘變(cassette mutagenesis),包括,包括盒式取代誘變和混合寡核苷酸誘變兩盒式取代誘變和混合寡核苷酸誘變兩種方式。種方式。 b 寡寡核核苷苷酸酸引引物物誘誘變變 應(yīng)應(yīng)用用化化學(xué)學(xué)合合成成的的含含有有突突變變堿堿基基的的寡寡核核苷苷酸酸短短片片段段做做引引物物,進(jìn)進(jìn)行行 DNA 復(fù)復(fù)制制,使使寡寡核核苷苷酸酸引引物物成成為為新新合合成成的的 DNA 子子鏈鏈的的一一個個部部分分。 CPCRG 與與 PCR 誘誘變變 6 6 利用利用 DNADNA 與蛋白質(zhì)的相互與
29、蛋白質(zhì)的相互作用進(jìn)行核酸研究作用進(jìn)行核酸研究. . a.a. 凝 膠 滯 緩 實(shí) 驗(yàn)?zāi)?膠 滯 緩 實(shí) 驗(yàn) (Gel (Gel retardation assay)retardation assay),又稱,又稱 DNADNA遷移率變化試驗(yàn)遷移率變化試驗(yàn)(DNA mobility (DNA mobility shift assayshift assay-EMSA)EMSA)。 b DNase I 印跡試驗(yàn)(印跡試驗(yàn)(DNase I foot printing) 主要步驟:主要步驟: 用用32P標(biāo)志標(biāo)志DNA雙鏈末端,雙鏈末端,并用并用RE切去一端;切去一端; 參與細(xì)胞特定周期蛋白質(zhì)提參與細(xì)胞特
30、定周期蛋白質(zhì)提取物,溫育;取物,溫育; 參與適量參與適量DNaseI或硫酸二甲或硫酸二甲酯酯六氫吡啶,使六氫吡啶,使DNA鏈發(fā)生斷裂。鏈發(fā)生斷裂。這一反響中,這一反響中,DNaseI或硫酸二甲酯或硫酸二甲酯的用量非常關(guān)鍵,要保證一條鏈只發(fā)生的用量非常關(guān)鍵,要保證一條鏈只發(fā)生一次斷裂!一次斷裂!沉淀沉淀 DNA(包括與(包括與 DNA 相結(jié)合的蛋白相結(jié)合的蛋白質(zhì)) ;質(zhì)) ; 進(jìn)行進(jìn)行 DNA 凝膠分析。凝膠分析。 如果某個蛋白質(zhì)已經(jīng)與如果某個蛋白質(zhì)已經(jīng)與 DNA 的特定區(qū)段相的特定區(qū)段相結(jié)合,那么,它就會保證該區(qū)段結(jié)合,那么,它就會保證該區(qū)段 DNA 免受免受消化或降解作用。消化或降解作用。
31、在電泳凝膠的放射自顯影在電泳凝膠的放射自顯影圖片上, 相應(yīng)于蛋白質(zhì)結(jié)合的部位不產(chǎn)生放圖片上, 相應(yīng)于蛋白質(zhì)結(jié)合的部位不產(chǎn)生放射性標(biāo)記的條帶。射性標(biāo)記的條帶。 c c 甲基化干擾試驗(yàn)甲基化干擾試驗(yàn)(Methylation (Methylation interference assay)interference assay)。 用用 DMSDMS 處理靶處理靶 DNADNA,使平均每條,使平均每條鏈上只有一個鏈上只有一個 G G 被甲基化。將局部被甲基化。將局部甲基化的甲基化的 DNADNA 與含與含 DNADNA 結(jié)合蛋白的結(jié)合蛋白的細(xì)胞提取物共溫育后進(jìn)行凝膠滯緩細(xì)胞提取物共溫育后進(jìn)行凝膠滯緩試
32、驗(yàn)。分離各種試驗(yàn)。分離各種 DNADNA 條帶,并用六條帶,并用六氫吡啶切割甲基化的殘基。氫吡啶切割甲基化的殘基。 假設(shè)因某個假設(shè)因某個G G殘基的甲基化作殘基的甲基化作用而阻止了蛋白質(zhì)與用而阻止了蛋白質(zhì)與DNADNA的結(jié)的結(jié)合,那么,六氫吡啶對這個合,那么,六氫吡啶對這個甲基化甲基化G G殘基的切割作用,就殘基的切割作用,就只能在沒有蛋白質(zhì)結(jié)合的只能在沒有蛋白質(zhì)結(jié)合的DNADNA中察看到。中察看到。d 體體內(nèi)內(nèi)足足跡跡試試驗(yàn)驗(yàn) 用用適適量量 DMS 處處理理完完整整的的游游離離細(xì)細(xì)胞胞,使使染染色色質(zhì)質(zhì)中中的的 G 殘殘基基甲甲基基化化,提提取取 DNA 并并加加入入六六氫氫吡吡啶啶切切割割
33、 DNA 鏈鏈。與與對對照照的的裸裸露露DNA 經(jīng)經(jīng)甲甲基基化化處處理理后后形形成成的的梯梯度度相相對對照照,就就能能發(fā)發(fā)現(xiàn)現(xiàn) DNA 鏈鏈上上的的蛋蛋白白質(zhì)質(zhì)結(jié)結(jié)合合區(qū)區(qū)。 三三、分子克隆技術(shù)、分子克隆技術(shù) 1 1、高質(zhì)量、高質(zhì)量 mRNAmRNA 的制備的制備 應(yīng)用應(yīng)用 Promega PolyAT tract mRNA Promega PolyAT tract mRNA Isolation SystemIsolation System 分離分離 Poly(A)RNAPoly(A)RNA。將將 Biotinylated Oligo(dT)Biotinylated Oligo(dT)引物與細(xì)
34、引物與細(xì)胞總胞總 RNARNA 共溫育,加入與微磁球相連共溫育,加入與微磁球相連的的 StreptavidinStreptavidin,用磁場吸附與,用磁場吸附與 PMPPMP相連的相連的 SASA- -Biotinylated Oligo(dT)Biotinylated Oligo(dT)mRNAmRNA。 2 反轉(zhuǎn)錄成反轉(zhuǎn)錄成 cDNA 可 同 時 在反 轉(zhuǎn) 錄系統(tǒng) 中 加 入可 同 時 在反 轉(zhuǎn) 錄系統(tǒng) 中 加 入Oligo(dT)12-18-mer 及隨機(jī)引物及隨機(jī)引物R6,以保證得到全長,以保證得到全長 cDNA; 應(yīng) 選 用 活性 較 高的反 轉(zhuǎn) 錄 酶應(yīng) 選 用 活性 較 高的反
35、 轉(zhuǎn) 錄 酶(Reverse transcriptase) ;) ; 應(yīng)選用甲基化應(yīng)選用甲基化 dCTP; 應(yīng)保證所獲得雙鏈應(yīng)保證所獲得雙鏈 cDNA 的方向的方向性。性。 Super Script Choice cDNA 合成系統(tǒng)中所用合成系統(tǒng)中所用的的 poly(dT)引物)引物 5GAGAGAGAGAGAGAGAGAGAACTA GAGA序列序列 GTCTCGAGTTTTTTTTTTTTTTTTTT3 XhoI Poly(dT) 與與 EcoR I 酶切位點(diǎn)相連的接合序列酶切位點(diǎn)相連的接合序列 5 AATTCGGCACGAG 3 3 GCCGTGCTC 5 因?yàn)榻^大多數(shù)大腸因?yàn)榻^大多數(shù)大
36、腸桿菌細(xì)胞都會切除帶桿菌細(xì)胞都會切除帶有有 5-methyl C 的外源的外源DNA,所以,應(yīng)選用,所以,應(yīng)選用mcrA- mcrB-菌株。菌株。 3分子克隆的主要方法分子克隆的主要方法 (1)構(gòu)建)構(gòu)建 cDNA、核、核 DNA 文庫,文庫,應(yīng)用現(xiàn)有核酸探針分離新的目的應(yīng)用現(xiàn)有核酸探針分離新的目的基因;基因; (2) 差式雜交) 差式雜交(differential screen)和扣除雜交和扣除雜交(subtractive hybridization)技術(shù);技術(shù); (3)DD-RT-PCR 法及差別顯示法及差別顯示技術(shù);技術(shù); 4差別分析法差別分析法 (RDA法,即法,即Representa
37、tional difference analysis; 5 酵 母 雙 雜 交 體 系 酵 母 雙 雜 交 體 系 Tw o -hybrid system;6圖位克隆法圖位克隆法map-based cloning與染色體步移與染色體步移 genomic DNA Walking。 習(xí)慣上,人們用克隆表示由同一物種具有相同習(xí)慣上,人們用克隆表示由同一物種具有相同基因型的兩個或多個個體組成的群體。所以,基因型的兩個或多個個體組成的群體。所以,從 同 一 受 精 卵 分 裂 而 來 的 單 卵 雙 生 子從 同 一 受 精 卵 分 裂 而 來 的 單 卵 雙 生 子(monozygotic twins
38、)便屬于同一克隆。)便屬于同一克隆。 細(xì) 胞 學(xué) 上 , 克 隆 是 指 由 同 一 個 祖 細(xì) 胞細(xì) 胞 學(xué) 上 , 克 隆 是 指 由 同 一 個 祖 細(xì) 胞(progenitor cell)分裂而來的具有同一遺傳背)分裂而來的具有同一遺傳背景的子細(xì)胞群體。景的子細(xì)胞群體。 分子生物學(xué)上, 把將外源分子生物學(xué)上, 把將外源 DNA 插入具有自主復(fù)插入具有自主復(fù)制能力的載體制能力的載體 DNA 中, 使之得以自主復(fù)制和永中, 使之得以自主復(fù)制和永久保存的過程叫做分子克隆。久保存的過程叫做分子克隆。 文文庫庫篩篩選選與與基基因因豐豐度度有有關(guān)關(guān)。 高高豐豐度度基基因因,如如蠶蠶絲絲心心蛋蛋白白
39、,卵卵清清蛋蛋白白 等等 在在 某某 些些 特特 定定 組組 織織 中中 可可 占占 細(xì)細(xì) 胞胞 總總mRNA 量量的的 50-90%,非非常常容容易易被被分分離離。 低低豐豐度度基基因因,一一般般在在細(xì)細(xì)胞胞中中只只有有 10-20個個拷拷貝貝,哺哺乳乳動動物物細(xì)細(xì)胞胞中中可可含含 10,000 到到40,000 種種不不同同的的 mRNA,如如果果要要達(dá)達(dá)到到99% 的的 期期 望望 值值 , 大大 約約 需需 要要 篩篩 選選150,000-170,000 個個克克隆隆子子。 一一般般情情況況下下,每每微微克克 cDNA 可可產(chǎn)產(chǎn)生生10 萬萬-60 萬萬個個克克隆隆子子。 差式雜交或扣
40、差式雜交或扣除雜交克隆技術(shù)除雜交克隆技術(shù) cRNA 差式顯示法差式顯示法 除了極少數(shù)特例除了極少數(shù)特例(如組如組蛋白基因蛋白基因)之外,幾乎所有之外,幾乎所有的真核基因的真核基因mRNA分子的分子的3-末端,都帶有一段多聚末端,都帶有一段多聚的腺苷酸結(jié)構(gòu),即通常所的腺苷酸結(jié)構(gòu),即通常所說的說的 poly(A)尾巴。尾巴。 P.Liang等人設(shè)計合成了全部等人設(shè)計合成了全部12種種不同的引物,用以反轉(zhuǎn)錄不同的引物,用以反轉(zhuǎn)錄mRNA,合成第一鏈合成第一鏈cDNA。這種引物通常。這種引物通常叫作叫作3-端錨定脫氧核苷酸引物,端錨定脫氧核苷酸引物,并用并用5-T11MN或或5-T12MN通式通式表示
41、。其中表示。其中M為除了為除了T以外的任何以外的任何一種核苷酸即一種核苷酸即A、G或或C,而,而N那么為任何一種核苷酸即那么為任何一種核苷酸即A、G、C或或T,故,故MN共有共有12種不種不同的陳列組合方式。同的陳列組合方式。 DDRT-PCR 的的主主要要步步驟驟: .從從不不同同發(fā)發(fā)育育階階段段或或不不同同基基因因型型的的細(xì)細(xì)胞胞群群體體中中分分離離 mRNA,并并以以 3錨錨定定引引物物作作為為反反轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)錄錄的的引引物物, 合合成成第第一一鍵鍵 cDNA; .用用 5隨隨機(jī)機(jī)引引物物和和某某個個 3端端錨錨定定引引 物物對對擴(kuò)擴(kuò)增增第第一一鏈鏈(摻摻入入 32p-dNTP); .用用 DN
42、A 變變性性測測序序膠膠分分離離擴(kuò)擴(kuò)增增產(chǎn)產(chǎn)物物,X 光光片片曝曝光光后后檢檢測測差差別別條條帶帶; .回收特異性差別條帶;回收特異性差別條帶; . .用同一引物對擴(kuò)增已回用同一引物對擴(kuò)增已回收的收的 DNADNA 條帶;條帶; . .用用 Northern,Southern及測序法分析所得的條帶;及測序法分析所得的條帶; . .以該以該 DNA 片段做探針,片段做探針,篩選全長篩選全長 cDNA 或核基因?;蚝嘶颉?c cD DN NA A差差式式分分析析法法( (R Re ep pr re es se en nt ta at ti io on na al l d di if ff fe
43、er re en nc ce e a an na al ly ys si is s) ) R RD DA A 法法充充分分發(fā)發(fā)揮揮了了 P PC CR R 以以指指數(shù)數(shù)形形式式擴(kuò)擴(kuò)增增雙雙鏈鏈 D DN NA A 模模板板的的特特性性,通通過過降降低低 c cD DN NA A 群群體體復(fù)復(fù)雜雜性性和和更更換換 c cD DN NA A 兩兩端端接接頭頭等等方方法法, 特特異異擴(kuò)擴(kuò)增增了了目目的的基基因因片片段段。 由于實(shí)驗(yàn)對象由于實(shí)驗(yàn)對象TesterTester和和供試探針供試探針DriverDriver在接受在接受差式分析前均經(jīng)一個差式分析前均經(jīng)一個4 4堿基切堿基切割酶處置,構(gòu)成平均長度
44、割酶處置,構(gòu)成平均長度256bp256bp的代表群的代表群representationrepresentation保證絕保證絕大部分遺傳信息能被擴(kuò)增。大部分遺傳信息能被擴(kuò)增。 每次每次 T減減 D反應(yīng)后僅反應(yīng)后僅設(shè)置設(shè)置 72復(fù)性與延伸,復(fù)性與延伸,94復(fù)性這兩個參數(shù)共復(fù)性這兩個參數(shù)共20 個個 PCR 循環(huán),循環(huán),PCR產(chǎn)物的特異性和所得探產(chǎn)物的特異性和所得探針的純度非常高。針的純度非常高。 mRNAcDNA4 堿基內(nèi) 切 酶消化加 12/14堿基接 頭分 開12堿基 短鏈PCR填充材 料實(shí) 驗(yàn) 材料去 除 原有 接 頭 , 連 上新 接 頭去 除原有 接 頭1:100混合 , 變性 , 雜
45、 交線性 擴(kuò) 增指數(shù)擴(kuò) 增無擴(kuò) 增1 差異 產(chǎn) 物 酵母雙雜交體系酵母雙雜交體系 Two-hybrid system 也叫也叫interaction trap(相互作用(相互作用陷井) ,是陷井) ,是 90 年代初發(fā)展起年代初發(fā)展起來的分離基因的新方法,可來的分離基因的新方法,可用于分離能與已知靶蛋白質(zhì)用于分離能與已知靶蛋白質(zhì)(target protein)相互作用)相互作用的基因。的基因。 基本原理:基本原理: 真核生物的轉(zhuǎn)錄因子大多是由真核生物的轉(zhuǎn)錄因子大多是由兩個結(jié)構(gòu)上分開、功能上獨(dú)立的結(jié)兩個結(jié)構(gòu)上分開、功能上獨(dú)立的結(jié)構(gòu)域組成的。如構(gòu)域組成的。如 GAL4 的的 N 端端1-147aa
46、 是是 DNA 結(jié)合域(結(jié)合域(BD) ,其) ,其C 端端 768-881aa 是 轉(zhuǎn) 錄激活域是 轉(zhuǎn) 錄激活域(AD) 。一般情況下,) 。一般情況下,AD 能與能與GAL4 效應(yīng)基因啟動子上游的特定效應(yīng)基因啟動子上游的特定DNA 區(qū)段 (區(qū)段 (UAS) 相結(jié)合, 而此時,) 相結(jié)合, 而此時,AD 則推動了轉(zhuǎn)錄起始。則推動了轉(zhuǎn)錄起始。 若用基因工程的方法, 將若用基因工程的方法, 將GAL4 ADGAL4 AD 和和 BDBD 分別克隆到分別克隆到不同的載體上,導(dǎo)入同一不同的載體上,導(dǎo)入同一細(xì)胞株中表達(dá),效應(yīng)基因細(xì)胞株中表達(dá),效應(yīng)基因無法被激活無法被激活, ,但可把來自但可把來自不同轉(zhuǎn)錄因子的不同轉(zhuǎn)錄因子的 ADAD 或或 BDBD區(qū)域連成一個功能基因。區(qū)域連成一個功能基因。 主主要要實(shí)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)過過程程: a. 選選擇擇缺缺失失 GAL4編編碼碼基基因因的的酵酵母母寄寄主主菌菌
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