Ro25-6981對(duì)成年腦缺血再灌注大鼠海馬CA1區(qū)神經(jīng)發(fā)生的影響

1、Ro25-6981對(duì)成年腦缺血/再灌注大鼠海馬CA1區(qū)神經(jīng)發(fā)生的影響         10-10-30 16:07:00     編輯：studa20                   作者：王姍姍，胡忠浩，徐鐵軍  【摘要】  目的 探討NMDA受體亞單位2B選擇性

2、拮抗劑Ro25-6981對(duì)成年大鼠短暫性全腦缺血再灌注后海馬CA1區(qū)神經(jīng)發(fā)生的影響。方法 將成年雄性SD大鼠隨機(jī)分為實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組。制作四動(dòng)脈阻斷(4AO)大鼠全腦缺血15 min再灌注模型。實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組大鼠分別于術(shù)前30 min腹腔注射不同劑量Ro25-6981(0.3 mg/kg、0.6 mg/kg)、生理鹽水。免疫組織化學(xué)技術(shù)顯示再灌注第1、3、7天各組大鼠海馬CA1區(qū)BrdU陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)。結(jié)果 對(duì)照組大鼠BrdU陽(yáng)性細(xì)胞在再灌注3 d增殖達(dá)高峰，隨后下降。 再灌注1、3、7天，實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組相比BrdU陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)均明顯減少(P<0.01)。結(jié)論 一定條件下，Ro25-6981可抑

3、制缺血再灌注誘導(dǎo)的海馬CA1區(qū)的短暫性神經(jīng)發(fā)生。 【關(guān)鍵詞】  腦缺血/再灌注;NMDA受體拮抗劑;神經(jīng)發(fā)生;大鼠Abstract: Objective To investigate the effect of the selective antagonist Ro25-6981 of NMDA receptor subunit 2B (NR2B) on the neural recovery in adult rat hippocampus after transient forebrain ischemia/reperfusion (I/R). Methods The male

4、SD rats were randomized into three groups: the experiment groups (and ) and the control group. The rats in the experiment groups and the control group were subjected to 15 min of 4-artery occlusion (4AO) to establish the animal model of rat brain ischemia (15 min) and reperfusion. The rats in the ex

5、periment groups were intraperitoneally administered with Ro25-6981 at doses of 0.3 mg/kg and 0.6 mg/kg, respectively, while the same volume of NS was injected into the rats in the control group. Immunohistochemistry was employed to demonstrate and to compare the rate of BrdU positive cells in CA1 of

6、 hippocampus in different groups at 1 d, 3 d and 7 d. Results The control group: BrdU positive cells peaked at I/R 3 d and decreased until I/R 7 d in the CA1 region. The experiment groups: The numbers of BrdU-positive cells significantly decreased as compared to that in the control group. Conclusion

7、 Transient forebrain ischemia/reperfusion could induce neurogenesis in the CA1 region, while this kind of neurogenesis could be inhibited by Ro25-6981.Key words: ischemia/reperfusion; NMDA receptor antagonist; neurogenesis缺血性腦血管病是嚴(yán)重威脅人類健康的常見(jiàn)病和多發(fā)病。目前認(rèn)為，當(dāng)發(fā)生缺血缺氧時(shí)，刺激谷氨酸受體，尤其是引起NMDAR過(guò)度興奮，導(dǎo)致神經(jīng)細(xì)胞Ca2+超載而致?lián)p傷

8、1。于是人們?cè)噲D使用NMDAR拮抗劑緩解腦缺血引起的神經(jīng)細(xì)胞死亡。有研究表明NMDAR拮抗劑MK-801可刺激正常的成年大腦神經(jīng)發(fā)生2-3。注射MK-801雖然可以防止短暫性局腦缺血后海馬CA1區(qū)神經(jīng)元的死亡，但同時(shí)也阻止了海馬齒狀回中缺血誘導(dǎo)的神經(jīng)發(fā)生4。此外，NMDAR不僅在病理過(guò)程中起作用，也可能參與了眾多的生理功能，使用NMDA受體拮抗劑會(huì)對(duì)其正常生理活動(dòng)干擾過(guò)大。因此選擇具有受體亞基選擇性的拮抗劑，能夠在較小劑量下產(chǎn)生定位靶向作用，減少副作用，提高安全性。海馬CA1區(qū)在腦缺血時(shí)的相對(duì)易損性使其成為研究缺血性腦損傷的理想對(duì)象。本課題組以往實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，NR2B蛋白質(zhì)和mRNA在正常大鼠海馬

9、CA1區(qū)、CA3區(qū)及齒狀回的免疫反應(yīng)強(qiáng)度存在明顯差異，CA1區(qū)最強(qiáng)，CA3區(qū)次之，齒狀回著色較弱。這種基礎(chǔ)性平行高表達(dá)可能是造成海馬CA1區(qū)缺血易損性的原因之一5。那么，NMDA受體亞單位2B(NR2B)選擇性拮抗劑Ro25-6981對(duì)腦缺血/再灌注(I/R)后海馬CA1區(qū)的作用如何呢?本實(shí)驗(yàn)旨在研究其對(duì)腦缺血后海馬CA1區(qū)神經(jīng)發(fā)生的影響。1 材料和方法1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物和分組 成年雄性SD大鼠(徐州醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供)36只，體重(250±25) g，隨機(jī)分為實(shí)驗(yàn)組(n=24)和對(duì)照組(n=12)。實(shí)驗(yàn)組大鼠于術(shù)前30 min腹腔內(nèi)注射不同劑量Ro25-6981(0.3 mg/k

10、g、0.6 mg/kg)，對(duì)照組在術(shù)前30 min注射等容量(5 ml)的生理鹽水。大鼠分別在注射Ro25-6981或生理鹽水后第1天、3天和7天各處死4只。所有大鼠于處死前1天在12 h內(nèi)每4 h腹腔注射BrdU 50 mg/kg，共3次。1.2 前腦缺血/再灌注模型的制備 按照Pulsinelli的四血管阻斷法進(jìn)行：10%水合氯醛(0.350.4 ml/100 g)腹腔注射麻醉，從頸前分離出雙側(cè)頸總動(dòng)脈,并分別套以絲線(不結(jié)扎)，再經(jīng)第1頸椎雙側(cè)橫突翼孔電凝灼斷雙側(cè)椎動(dòng)脈。24 h后，大鼠不予麻醉,直接仰置固定于手術(shù)臺(tái)上，在清醒狀態(tài)下用動(dòng)脈夾同時(shí)夾閉雙側(cè)頸總動(dòng)脈，15 min后松開(kāi)動(dòng)脈夾，

11、確認(rèn)雙側(cè)頸總動(dòng)脈再灌流后關(guān)閉切口。手術(shù)過(guò)程中持續(xù)進(jìn)行肛溫監(jiān)測(cè)，并用白熾燈照射的方法維持大鼠體溫恒定。符合以下條件的大鼠入選缺血再灌注組：動(dòng)脈夾閉60 s內(nèi)，大鼠翻正反射消失;雙側(cè)瞳孔持續(xù)開(kāi)大，輕觸條件下角膜反射消失;肛溫穩(wěn)定在3637范圍內(nèi)。1.3 切片制備 動(dòng)物用10%水合氯醛(0.350.40 ml/100 g)腹腔注射麻醉，經(jīng)心臟升主動(dòng)脈插管，快速灌注80100 ml生理鹽水后，再灌注4%多聚甲醛300 ml，前100 ml快灌，后200 ml慢灌，30 min內(nèi)灌完。灌注后的大鼠斷頭、暴露腦，在立體定位儀上，將鼠腦冠狀位分成前、中、后3段。取含有海馬的中段放入4%多聚甲醛，過(guò)夜固定。腦

12、組織塊自4%多聚甲醛取出后，進(jìn)行梯度乙醇脫水、二甲苯透明、浸蠟、石蠟包埋。然后將腦塊作連續(xù)冠狀切片，片厚6 m，將每只大鼠海馬的全部切片按相同間隔順序分成3套(焦油紫染色1套、免疫組化1套，陰性對(duì)照1套)。1.4 焦油紫染色 脫蠟、復(fù)水;焦油紫染色，6 min;雙蒸水洗，10 s;依次經(jīng)過(guò)乙醇分色，時(shí)間依藍(lán)化程度而定;脫水、透明、封片。1.5 免疫組織化學(xué)反應(yīng) 切片用鉛筆做記號(hào)，按下列步驟進(jìn)行BrdU的免疫組織化學(xué)反應(yīng)。反應(yīng)步驟如下：梯度乙醇脫蠟、復(fù)水，PBS漂洗;3%H2O2處理10 min滅活內(nèi)源性酶，雙蒸水洗;切片于枸櫞酸鈉溶液中微波抗原修復(fù)：高火2 min，低火持續(xù)15 min，自然冷

13、卻，PBS漂洗;加BSA封閉液37孵育箱，1 h;取后甩干，滴加BrdU小鼠單克隆抗體(1500，Sigma公司)，4過(guò)夜，PBS沖洗;37復(fù)溫1 h;冷卻至室溫后，PBS沖洗，甩干后，加生物素化山羊抗小鼠IgG(武漢博士德)，37，30 min;冷卻至室溫后PBS沖洗;滴加試劑SABC(武漢博士德)，37，30 min;冷卻至室溫后，0.01 mol/L PBS沖洗，5 min×4次;DAB顯色，顯色時(shí)間以在顯微鏡下觀察為準(zhǔn)，及時(shí)終止反應(yīng);脫水，透明，封片。陰性對(duì)照切片用0.1% TritonX-100代替一抗孵育，其他反應(yīng)步驟相同。1.6 圖像分析 采用目鏡帶有網(wǎng)格尺(10 mm×10 mm)的顯微鏡(目鏡10×