激光掃描共聚焦顯微鏡中熒光強度的測定條件研究.

1、激光掃描共聚焦顯微鏡中熒光強度的測定條件研究05-12-18 15:01:00 作者：YuNan she n編輯：studa9 ngnsA】【摘要】 目的本文對應(yīng)用激光掃描共聚焦顯微鏡進行熒光強度的測定條件做了詳細(xì)的分析。方法 選擇和設(shè)置激光掃描共聚焦顯微鏡的各參數(shù)，對 用間接免疫熒光法檢測改性后的材料表面對人牙齦成纖維細(xì)胞分泌細(xì)胞外基質(zhì) 纖粘連蛋白FN和I型膠原的影響進行熒光強度的定量。結(jié)果細(xì)胞在材料表面接種后FN的熒光染色強度在四組材料之間差異無顯著性，說明材料表面化學(xué)成 分的改變對FN的形成沒有明顯影響。但四組材料對I型膠原分泌的影響有差 異。結(jié)論 選擇和設(shè)置適合的激光掃描共聚焦顯微鏡中

2、熒光強度的測定條件，可 以真實有效的反映實驗的結(jié)果。關(guān)鍵詞激光掃描共聚焦顯微鏡熒光強度The research on determ ine con diti on of fluoresce nee inten sity in con focal laser sea nning microscopy【Abstract 】 Objective To explore the conditions under which fluoresce nee inten sity is determ ined in con focal laser sca nning microscopy.Methods The

3、 parameters of con focal laser sca nning microscopy were set and the effects of these modificati ons on the response of the fibro-conglutination albumen and type I collage n of huma n gin gival fibrob- lasts on in direct immuni tyfluoresce neewere observed , and the fluoresce nee inten sity of the e

4、ffects was measured.Re - sults After the cells grafted on the material surface,the fluoresce nee dye inten sity of the fibro-eon gluti nati on albu- menhad no no table differ enee in materials of the four groups, the alterof the chemistry comp onent of the material sur- face had no no tablein flue n

5、ee on the formatio n of the fibro-c on gluti nati on albume n.But the effects of the type I colla- gen were different in materials ofthe four groups.C on clusi on Sett ing appropriate eon diti ons for the determ in ati on of fluoresce nee inten sity in eon focal laser sca nning microscopy is importa

6、nt in the analysis of the true results of experi - men t.Key words eon focal laser sca nning microscopy fluoresce nee inten sity激光掃描共聚焦顯微鏡（ con focal laser sea nning mi - croscopy , CLSM是20世紀(jì)80年代發(fā)展起來的目前世界上最先進的分子細(xì)胞生物學(xué)分析 儀器。它是在熒光顯微鏡基礎(chǔ)上加裝了激光掃描裝置，使用紫外或可見激光激 發(fā)熒光探針，從而得到細(xì)胞或組織內(nèi)部微細(xì)結(jié)構(gòu)的熒光圖像，較傳統(tǒng)顯微鏡有 著不可比擬的優(yōu)越性 1

7、，已廣泛應(yīng)用于分子細(xì)胞生物學(xué)、生理學(xué)、病理學(xué)、免疫學(xué)、藥理學(xué)、遺傳學(xué)等領(lǐng)域，成為這些領(lǐng)域新一代強有力的研究工 具，對生物樣品進行定性、定量、定時和定位研究具有很大的優(yōu)越性。1 材料與方法1.1實驗用樣品 分四組。Ti組:未涂層的對照組；HA組:應(yīng)用離子束輔助沉 積技術(shù)在種植體表面沉積羥基磷灰石 HA涂層;TCP/HA組:應(yīng)用離子束輔助沉積 技術(shù)在種植體表面沉積磷酸三鈣/羥基磷灰石TCP/HA復(fù)合涂層；RGD組:應(yīng)用化 學(xué)方法在純鈦表面共價接枝生物活性肽 RGD（Arg-Gly-Asp ，精氨酸 -甘氨酸-天 門冬氨酸）。樣品規(guī)格:直徑10mm厚2mm勺圓盤形，表面粗糙度 Ra值均為 0.1 卩

8、 m1.2實驗步驟（1）接種到材料表面的細(xì)胞分別培養(yǎng) 3、24和48h后，PBS 輕輕沖洗3次。（2） 4%畐爾馬林固定10min, PBS沖中洗。（3） 0.1% （V/V） Triton X-100 滲透5min, PBS沖中洗。（4） 1%勺羊血清阻斷20min°（5）分別 用下列抗體37C孵育1h:兔抗人FN多克隆抗體（1:30稀釋，Sigma）;兔 抗人I型膠原多克隆抗體（1:30稀釋，Sigma）, PBS沖洗3次。對照組一抗用 無熒光的兔血清。（6）用TRITC標(biāo)記的羊抗兔IgG （1:30稀釋，Sigma） 37C 孵育1h，PBS沖洗3次。（7）激光掃描共聚焦顯微鏡

9、（Leica TCS-NT， Germany取圖，每個試樣隨機選擇30個細(xì)胞測量細(xì)胞熒光強度。取圖條件： 激發(fā)光波長:567nm,掃描方式：xyz，物鏡:40倍干鏡（NA為0.75 ），激 光功率：（20土 2） mw掃描強度：50%,光電倍增管的增益（PMT :852， 探測針孔 :2.02 ，掃描次數(shù) :4。1.3統(tǒng)計學(xué)方法 實驗結(jié)果用SPSS10.0for Windows軟件包處理，單因素方 差統(tǒng)計分析， P<0.05 時具有統(tǒng)計學(xué)差異。2 結(jié)果2.1細(xì)胞外基質(zhì)FN的形成 四種材料表面細(xì)胞的胞漿內(nèi)都可見到紅色的FN熒光染色。在細(xì)胞核的周圍染色較深，有較強的熒光強度，細(xì)胞胞漿的四周熒

10、 光強度逐漸降低。說明FN產(chǎn)生的部位位于細(xì)胞漿內(nèi)，其形成量在核周較多，而 胞漿的外圍逐漸減少。定量對比四種材料表面細(xì)胞FN的生成量，顯示在檢測的各個階段差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）（見表1）。表1材料表面細(xì)胞FN生成量的熒光強度比較 （略）注:所有結(jié)果組間比較， P>0.052.2 I型膠原的形成在細(xì)胞接種后3h,鈦和RGD表面的細(xì)胞幾乎沒有I型 膠原的分泌；TCP/HA表面可見紅色較強的I型膠原熒光染色區(qū)，分布在細(xì)胞的 胞漿內(nèi)，細(xì)胞核無染色；HA材料表面也可見紅色熒光陽性染色區(qū)，但沒有 TCP/HA的染色重。熒光強度比較結(jié)果顯示，HA和TCP/HA組的熒光強度比Ti和 RGD

11、&的大，差異有統(tǒng)計學(xué)意義;TCP/HA比HA表面的熒光強度大，差異有統(tǒng)計 學(xué)意義（Pv0.05） ;Ti和RG組之間比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）。細(xì)胞 培養(yǎng)至24h,可見四種材料表面都有紅色的I型膠原陽性染色，分布在細(xì)胞核 周圍的胞漿內(nèi)。定量比較四組間的細(xì)胞分泌 I 型膠原的熒光強度，顯示 TCP/HA 組比 Ti 組高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（ P<0.05） ，其他各組間差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）。隨著培養(yǎng)時間的延長，各組材料表面細(xì)胞分泌的I型膠原含量逐漸增加，至48h,各種材料之間I型膠原的熒光染色強度差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）。見表 2。表

12、2三組材料表面細(xì)胞I型膠原生成量的熒光強度比較（略）注：v為同Ti組相比，P<0.05, vv為同Ti組相比，P<0.01; 為同HA組相比， P<0.05; #為與 RG相比，P<0.013 討論3.1 激光掃描共聚焦顯微鏡的原理及功能 激光掃描共聚焦顯微鏡利用激光 掃描束經(jīng)照明針孔形成點光源，對標(biāo)本內(nèi)焦平面上的每一點掃描，標(biāo)本上的被 照射點，在探測針孔處成像，由探測針孔后的光電倍增管（PMT逐點或逐線接收，迅速在計算機監(jiān)視器屏幕上形成熒光圖像，照明針孔與探測針孔相對于物 鏡焦平面是共軛的。焦平面的點同時聚焦于照明針孔和探測針孔，焦平面以外 的點不會在探測針孔處成像，

13、這樣得到的共聚焦圖像是標(biāo)本的光學(xué)橫斷面，克 服了普通熒光顯微鏡圖像模糊的缺點。另外在顯微鏡的載物臺上加一個微量步 進馬達，可使載物臺沿著 Z 軸上下移動，將樣品各個層面移到照明針孔和探測 針孔的共焦面上，樣品的不同層面的圖像都能清楚地顯示，成為連續(xù)的光切圖 像，實現(xiàn)了“光學(xué)切片”（ Optical sectioning ）的目的。激光掃描共焦顯微 鏡的功能主要分為兩大類，即圖像靜態(tài)采集和動態(tài)掃描。其中圖像靜態(tài)采集又 可分為多熒光探針標(biāo)記樣品的圖像采集，無損傷連續(xù)光學(xué)切片圖像的采集，即“細(xì)胞CT',三維圖像重建，熒光強度定量分析。圖像的動態(tài)掃描功能可分為 xyt 、xyzt 和 xt 掃

14、描，即觀察細(xì)胞內(nèi)離子動態(tài)變化，熒光漂白恢復(fù)（ FRAP）， 熒光能量共振轉(zhuǎn)移（FRER等。其中熒光強度的定量是一項非常重要的功能。3.2 熒光強度的定量在生物醫(yī)學(xué)中的作用 由于多數(shù)熒光探針對被標(biāo)記物的標(biāo)記 均為特異性標(biāo)記，即熒光探針的亮度即熒光強度可以反映被標(biāo)記物相對含量的 多少。因此利用這一功能可以對 單個細(xì)胞或細(xì)胞群的溶酶體、線粒體、 DNA、 RNAffi受體分子含量、成份進行定量測定。還可測定諸如膜電位和配體結(jié)合等 生化反應(yīng)程度。此外，還適用于高靈敏度快速的免疫熒光測定，這種定量可以 準(zhǔn)確監(jiān)測抗原表達，細(xì)胞結(jié)合和殺傷及定量的形態(tài)特性，以揭示諸如腫瘤相關(guān) 抗原表達的定量信息。由于熒光強度

15、的定量在生物醫(yī)學(xué)中起著如此重要的作 用，因此對進行熒光強度定量的樣品測試就有非常嚴(yán)格的要求。進行熒光強度 定量的樣品測試條件如下。3.3 對樣品制備的要求 一個好的開端是成功的一半，樣品制備的好壞更是 熒光定量的關(guān)鍵之一。對要求進行熒光強度定量的樣品，如來源為組織，應(yīng)采 用冰凍切片，可以減少非特異性的熒光信號。如來源為培養(yǎng)的細(xì)胞，為了不將 細(xì)胞壓扁，蓋玻片與載片之間用甘油與 PBS昆合液（9:1 ）封片。甘油還具有抗 熒光淬滅的作用。為防止儀器在設(shè)定取圖條件時對樣品產(chǎn)生的熒光淬滅發(fā)生， 在樣本制備時，最好做好各樣品的平行樣。3.4 儀器各參數(shù)的選擇及要求 進行熒光強度定量的樣品，在圖像獲取時，

16、 要求各樣品的取圖參數(shù)值保持一致。具體相關(guān)參數(shù)如下。3.4.1 物鏡（ Objective ） 物鏡是成像質(zhì)量關(guān)鍵要素之一。熒光進入物鏡 的通透量的多少與物鏡的光透射率有關(guān)，而物鏡的光透射率與數(shù)值孔徑（ NA） 的 4 次方成正比，與物鏡的放大倍數(shù)的平方成反比，因此應(yīng)盡量選擇高數(shù)值孔 徑的物鏡，即通常應(yīng)選擇油鏡或水鏡。3.4.2 激光功率（ Laser Pwr ） 表示激光器的輸出功率，通常激光功率越 大，圖像的信噪比越好，但樣品熒光越容易被淬滅，所以激光功率通常要盡可 能的小。3.4.3 激光掃描程度（ Scan Str ） 設(shè)置用來掃描樣品的激光強度占激光器 輸出功率的百分比，其大小選擇應(yīng)

17、綜合考慮激光輸出功率、熒光染料的發(fā)光效 率、樣品中熒光染料的濃度、熒光染料的光漂白率決定。除此之外，還應(yīng)考慮 PMT電壓，掃描步長，掃描點數(shù)。對于發(fā)光效率高，樣品熒光染料濃度高，熒 光漂白率低的樣品，可選擇較高的掃描激光強度。3.4.4 探測針孔（ Pinhole ） 探測針孔越大，進入光檢測器的信號（發(fā)射 熒光）越多，信噪比越好，但樣品的成像厚度也越厚。如果要進行被標(biāo)記物的 精細(xì)定位，探測針孔應(yīng)盡可能的小。通常探測針孔設(shè)置為 1Airy 單位（ Airy 盤 是指點狀光源衍射的圖案的中央光斑），探測針孔數(shù)值 <1 時，分辨率較好，探 測針孔數(shù)值 >1 時，信噪比較好。但當(dāng)熒光信號

18、非常弱時，可適當(dāng)增大探測針 孔。要想提高圖像質(zhì)量，還可以同時增加取圖的重復(fù)掃描次數(shù)。345光電倍增管（PMT 設(shè)定加在PMT上的電壓。PMTh加不用的電壓 將使檢測器的靈敏度不同，電壓越高，則光信號轉(zhuǎn)換成的電信號越強，如熒光 強度較低，則選擇較大的電壓。反之，選擇較小的電壓。3.4.6 掃描速度（ Scan speed） 掃描速度越慢，圖像信噪比越好，但也越 容易發(fā)生光漂白，通常選擇儀器的標(biāo)準(zhǔn)掃描速度即可。3.4.7 重復(fù)掃描次數(shù)（ Average） 激光在樣品一掃描點的重復(fù)照射次數(shù)。 在樣品的某一掃描點，通過聲光控制器控制激光多次照射掃描點，取多次照射 的平均熒光強度。多次照射同一掃描點可極

19、大的減少躁聲，提高信噪比。因而 可以測量熒光暗淡模糊的樣品，有效地提高熒光圖像的質(zhì)量。由于匯聚光斑的 直徑很小，樣品中其它點受到極少的光照射，因而減少了對非掃描點光漂白和 光損傷。但多次掃描同一點，可能會對該掃描點帶來一定的熒光漂白效應(yīng)和光 損傷。而且要花費更多的時間。因而可根據(jù)不同的熒光染料及檢測量變化的快 慢加以選擇。3.5 熒光強度的定量的影響 應(yīng)用激光掃描共聚焦顯微鏡對用間接免疫熒光 法檢測改性后的材料表面對人牙齦成纖維細(xì)胞分泌細(xì)胞外基質(zhì)纖粘連蛋白FN和I 型膠原的影響進行熒光強度的定量 : 牙齦成纖維細(xì)胞在材料表面的鋪展和附著 過程需要細(xì)胞外基質(zhì)的參與，其中包括纖粘連蛋白FN和I型膠

20、原的形成和分泌。細(xì)胞首先通過與材料表面吸附的細(xì)胞外基質(zhì)的相互作用粘附在材料表面。 材料表面的性質(zhì)對細(xì)胞外基質(zhì)的分布和沉積有影響2 。細(xì)胞粘附在材料表面后又通過材料的刺激分泌細(xì)胞外基質(zhì)，促進細(xì)胞的進一步粘附。纖粘連蛋 白FN和I型膠原是成纖維細(xì)胞分泌的兩種主要細(xì)胞外基質(zhì)蛋白。纖粘連蛋白是 一個具有粘附功能的糖蛋白，可以結(jié)合細(xì)胞表面的受體和其他的 細(xì)胞外基質(zhì)， 如膠原。纖粘連蛋白和細(xì)胞之間的相互作用能促進細(xì)胞的粘附、鋪展和遷移。 I 型膠原是人體內(nèi)最多的蛋白成分，也是組成結(jié)締組織的主要結(jié)構(gòu)蛋白。膠原能 控制細(xì)胞的形態(tài)、細(xì)胞分化和其它生物學(xué)功能3 。 I 型膠原和纖粘連蛋白之間的特定反應(yīng)對結(jié)締組織結(jié)構(gòu)的形成和維持具有重要作用。