急性白血病細胞與正常白細胞差異蛋白質組分析(1)

1、    急性白血病細胞與正常白細胞差異蛋白質組分析(1)    】 本研究利用蛋白質組學方法將急性白血病(acute leukemia，AL)細胞與正常白細胞進行差異蛋白質組分析，為AL的分子診斷和白血病發(fā)生的分子機制研究奠定基礎。利用二維凝膠電泳將40例AL患者的AL細胞和20例正常自愿者淋巴細胞、粒細胞的蛋白質進行分離，利用MALDI-TOF-MS生物質譜和電噴霧串聯(lián)質譜(ESI-MS/MS) 對差異表達的蛋白質進行鑒定分析。結果表明： 在AL細胞與正常細胞的差異表達蛋白質中，一些與腫瘤的惡性轉化（如Op18和

2、NM23-H1）、細胞增殖（如PCNA）、抑制凋亡（如腫瘤壞死因子抑制蛋白）等相關的蛋白在AL細胞中高表達，而一些與正常白細胞分化和生理功能相關的蛋白質在AL細胞中低表達。結論： AL的發(fā)生涉及到眾多的細胞事件，一些與惡性轉化，細胞增殖和抑制凋亡等相關的蛋白在AL細胞中高表達，蛋白質組學分析為急性白血病發(fā)病的分子機理的解析提供了一個新的手段。 【關鍵詞】 淋巴細胞Analysis of the Different Proteomes between the Acute Leukemia Cells and Normal White Blood CellsAbstract This study

3、was aimed to analyze the different proteomes between human acute leukemia (AL) cells and normal white blood cells by proteomic technology in order to lay the basis for diagnosing AL and understanding the mechanism of leukemogenesis. The proteins from AL cells of 40 AL patients identified by FAB clas

4、sification and proteins from normal lymphocytes and granulocytes of 20 normal volunteers were separated by two-dimensional electrophoresis (2-DE)，and the differentially expressed proteins between the two groups were identified by both matrix assisted laser desorption/ionization-time of flight-mass s

5、pectrometry(MALDI-TOF-MS) and electronspray ionization(ESI)-MS/MS.The results showed that among the differentially expressed proteins between AL cells and normal lymphocytes and granulocytes，some proteins involved in the process of malignant transformation (such as Op18，NM23-H1)，cell proliferation (

6、such as PCNA) and apoptosis inhibition (such as tumor necrosis factor inhibitor protein) were found to be up regulated in AL cells.However，some proteins involved in differentiation and physiological functions of normal cells were down regulated in AL cells.It is concluded that there are many events

7、involved in the process of leukemogenesis，expression of some proteins relating to the malignant transformation，cell proliferation and apoptosis inhibition are up-regulated in AL cells. The proteome analysis may provide a new approach to explaining the molecular mechanism underlying the pathogenesis

8、of AL.Key words acute leukemia; lymphocyte; granulocyte    急性白血?。╝cute leukemia，AL）發(fā)生發(fā)展過程中涉及到眾多基因和表型變化，為了實現(xiàn)對AL的準確診斷和特異性治療，研究者們一直致力于AL的分子特征的研究。蛋白質組學技術是以整體蛋白質作為研究對象，它為尋找AL的分子特征提供了一個全新的手段。本研究將AL細胞與正常淋巴細胞和中性粒細胞蛋白質組特征進行比較分析，以了解白血病發(fā)病機制和其生物學特征的分子基礎。      &#

9、160; 材料和方法主試劑和儀器硝酸銀、二硫蘇糖醇（dithiothreitol，DTT）、碘乙酰胺、過硫酸胺（APS）、TEMED均為Sigma公司產品、IPG干膠條（ImmobilineTM DryStrip，pH3-10，18 cm）、IPG緩沖液（IPG buffer，pH 3-10）購于Amersham Pharmacia，三氟乙酸購自Fluka公司，乙腈購自Fisher公司，經修飾的測序級胰酶、蛋白酶抑制劑的混合片（cocktail tablets）購自Roche診斷公司。固相pH梯度等電聚焦儀（IPGphor IEF System）為Amersham Pharmacia

10、公司產品。垂直板蛋白電泳儀（PROTEAN xi Cell）為Bio-Rad公司產品。凝膠圖像掃描儀（ImageScanner）為Amersham Pharmacia公司產品。MALDI-TOF-MS為Bruker公司的Reflex III型質譜儀，加速電壓為20 kV，為反射式正離子檢測方式。電噴霧串聯(lián)質譜（ESI-MS/MS）為英國Micromass公司的正交加速電噴霧串聯(lián)質譜儀Q-TOF2，配備有毛細管液相色譜和納升噴霧源，所有測定均在正離子模式下進行。標本來源標本來源于吉林大學第一醫(yī)院血液腫瘤科40例依FAB分型方案初診為AL、未經化療的患者的骨髓細胞（5例M1型，3例M2型，5例M3

11、型，6例M4型和6例M5型AL患者，15例急性淋巴細胞白血病患者），年齡17-60 歲(中位年齡42 歲)。正常標本為20例健康志愿者外周血單個核細胞。樣品制備利用淋巴細胞分離液(相對密度1.077)梯度離心分離白血病患者骨髓細胞，取單個核細胞層，即為AL細胞。抽取健康自愿者抗凝外周血20 ml，Percoll梯度離心（具體操作見產品說明書，Amersham Pharmacia），產生3條細胞帶，其中最上層的帶1為淋巴細胞、帶2為中性粒細胞。顯微鏡下計數(shù)和觀察細胞形態(tài)（僅選用白血病細胞占骨髓單個核細胞90%以上的標本和正常淋巴細胞和粒細胞占90%以上的標本進行后續(xù)分析）。每5×107

12、個細胞加裂解液500 l（8 mol/L尿素，4% CHAPS，40 mmol/L Tris base，1×混合蛋白酶抑制劑），混勻后用液氮反復凍融2次。再加入20 g/ml DNase I和5 g/ml RNase A，冰浴20分鐘，4，10 000×g，離心30分鐘，取上清，Bradford法定量后將蛋白分裝，-70保存?zhèn)溆?。雙向凝膠電泳用雙向凝膠電泳（2-DE）1方法進行細胞蛋白質的分離，利用銀染2和考馬斯亮藍染色方法進行電泳凝膠染色。凝膠圖像采集與分析染色后的雙向電泳凝膠用凝膠圖象掃描儀（Amersham Pharmacia Biotech）掃描。數(shù)字化圖像文件采用

13、Nonlinear Dynamics公司的二維電泳處理軟件（ImageMasterTM 2D Elite 3.01）分析，獲得每個蛋白點的分子量（Mr）、等電點（pI）及相對含量。Table. Differentially expressed proteins between AL and normal white blood cells identified by MALDI-TOF-MS            作者：崔久嵬，王冠軍，李薇，王杰，張學敏【摘】本研究利用蛋白質

14、組學方法將急性白血病(acute leukemia，AL)細胞         本篇論文是由3COME文檔頻道的網友為您在網絡上收集整理餅投稿至本站的，論文版權屬原作者，請不用于商業(yè)用途或者抄襲，僅供參考學習之用，否者后果自負，如果此文侵犯您的合法權益，請聯(lián)系我們。差異表達蛋白點的質譜鑒定在建立差異蛋白質表達譜之后，我們加大雙向電泳中的蛋白上樣量（0.5-1 mg），用考馬斯亮藍染色方法進行染色，找到對應的差異點，切出蛋白點后進行脫色，膠內胰酶酶切和肽段提取3，然后用MALDI-TOF/MS進行肽質量指紋譜（PMF

15、）分析4。進一步用電噴霧串聯(lián)質譜(ESI-MS/MS)5對部分肽段測序后進行檢索以確定MALDI-TOF/MS分析結果。檢索結果的可靠性用肽段匹配率、得分值（score）和匹配肽段在對應蛋白內的序列覆蓋率進行評價。差異點的標示鑒定出來的差異蛋白點標示在相應的分析膠上（銀染2-DE圖），在AL細胞與正常白細胞差異表達的蛋白點標記為N。各差異點的順序號為本工作發(fā)現(xiàn)的先后順序。統(tǒng)計學分析用Newman-Keuls方法檢驗差異蛋白點相對含量的差別是否有統(tǒng)計學意義。結 果2-DE圖譜的分析本研究的AL患者的骨髓標本經密度梯度離心，白血病細胞占單個核細胞的90%以上，正常淋巴細胞和中性粒細胞占90%以上。

16、經ImageMaster 2-D Elite 3.0軟件及手工分析，每塊2-DE膠可分離近1 400左右個蛋白點，同一份標本平行電泳的匹配率在95%以上，并且各蛋白點的強度變化無顯著性差異。圖1A-B所示分別為正常淋巴細胞的2-DE圖譜（圖1A所標識的蛋白點為AL細胞與正常淋巴細胞和中性粒細胞相比，在AL細胞中低表達的部分蛋白點）和ALL細胞2-DE圖譜（圖1B所標識的蛋白點為在AL細胞中與正常淋巴細胞和中性粒細胞相比高表達的部分蛋白點），圖1C-D為相應差異點在2-DE圖譜上的局部放大圖。        差異表達

17、點的質譜鑒定在建立各型AL細胞2-DE圖譜后，將在AL各型中均存在的區(qū)別于正常白細胞的蛋白點定義為差異表達點，我們加大雙向電泳中的蛋白上樣量（1 mg），用考馬斯亮藍染色方法進行染色，找到對應的差異點，切出蛋白點后進行脫色、膠內胰酶酶切和肽段提取，然后用MALDI-TOF/MS進行肽質量指紋譜（PMF）分析；進一步用電噴霧串聯(lián)質譜(ESI-MS/MS)對部分肽段測序后進行檢索。鑒定結果表明，大多數(shù)蛋白點的出峰情況較好，用電噴霧串聯(lián)質譜測出部分肽段序列進行數(shù)據庫查詢的結果進一步證實了PMF檢索得到的結果。本研究蛋白點質譜鑒定的詳細列表見附表。其中實驗等電點和分子量是根據蛋白點在雙向電泳膠上的位置

18、，用圖像分析軟件分析后得到。圖2A-B為ESI-MS/MS對N-11蛋白點進行鑒定的PMF和序列分析的結果。    AL和正常白細胞的差異表達蛋白AL和正常白細胞的差異表達蛋白，是各型AL細胞都表現(xiàn)出與正常白細胞有差異的點，并不包括在AL各亞型中特異表達點。對41個AL和正常白細胞間的差異表達蛋白點進行了鑒定，結果顯示41個差異表達的蛋白點對應31個不同蛋白，具體鑒定結果如附表所示。其中在AL細胞中高表達的蛋白，如NM23-H1、癌蛋白18（oncoprotein 18，OP18），（如圖1C所示，其蛋白點的強度為正常白細胞的8-12倍）、增殖細胞核抗原

19、（PCNA）（如圖1C所示，其蛋白點的強度為正常白細胞的12-20倍）、細胞凋亡抑制因子（其蛋白點的強度為正常白細胞的6-8倍）、腫瘤壞死因子抑制蛋白（tumor necrosis factor inhibitor protein，TIP）（如圖1D所示，其蛋白點的強度為正常白細胞的6-8倍）。與正常粒細胞和淋巴細胞相比，調節(jié)性肌動蛋白輕鏈-2（MLC-2）、調節(jié)性肌動蛋白輕鏈-3（MLC-3）(正常白細胞其蛋白點的強度為AL細胞的8-11倍)和髓系相關蛋白-8 (Mrp8) 和Mrp 14 (正常白細胞的其蛋白點的強度為AL細胞的14-20倍)在AL細胞中低表達。討 論蛋白質是生理、病理過程

20、的直接執(zhí)行者，不同的疾病過程、不同的治療反應、不同的預后必然由蛋白質或蛋白質間相互關系的改變所導致，當mRNA豐度與蛋白質含量不成正相關或牽涉到蛋白質修飾等問題時，直接對白血病細胞蛋白質進行研究無疑是揭示細胞生命本質特征的更重方案。以前對AL細胞蛋白質分子特點的研究取得了一定進展，但主集中在對個別或少數(shù)蛋白質的作用進行探討，而白血病發(fā)生涉及了眾多的細胞事件，因此有必用更高通量的方法，全面地分析AL細胞的蛋白質表達特點。    本研究應用2-DE和質譜技術等蛋白質組學研究方法對AL 和正常白細胞蛋白質組特征進行分析，以尋找二者蛋白質差異表達譜。雖然將白血病

21、細胞與其分化同階段的相應的正常細胞相比較更有利于找到與AL發(fā)生相關的關鍵蛋白質，但由于目前技術的限制很難獲得分化為同一階段的純度（90%）較高的正常白細胞。本研究將AL細胞（由于M6、M7型AL少見，不包括在本研究中）和相應正常的成熟淋巴細胞和中性粒細胞蛋白質組進行比較分析（其差異蛋白涉及到分化相關蛋白和白血病發(fā)生相關的蛋白），對AL診斷和發(fā)病機制研究具有重的臨床意義。    在AL和正常白細胞差異表達的蛋白中，有一些與腫瘤的惡性轉化和細胞異常增殖有關的蛋白在AL細胞中高表達。例如，OP18(oncoprotein 18)在細胞生長調節(jié)通路調控中起重作用

22、，利用反義核苷酸技術阻止OP18的表達，可使細胞增殖能力下降6。本研究顯示OP18是各型AL細胞胞漿的主組成成份。PCNA在調節(jié)DNA復制與細胞增殖過程中起重作用，其表達強度可以反映細胞增殖活性 7和腫瘤細胞的生長速度，PCNA 在AL細胞中較正常細胞中明顯高表達（N-1點），提示AL細胞較正常細胞具有高的增殖特性。TNF可使細胞發(fā)生壞死和凋亡，而TIP能夠使細胞免于由TNF所誘導的凋亡8，本實驗顯示TIP在AL中表達明顯高于正常細胞（N-8點），提示其與AL細胞的免疫逃逸有關。在實體瘤NM23（N-11點）蛋白具有抑制腫瘤轉移的作用，而在造血系統(tǒng)，NM23在低分化的細胞中表達量高于相對分化細

23、胞，本實驗顯示在AL細胞中較正常細胞高表達，與文獻報道一致9。    一些蛋白在2-DE上的位置與理論pI和Mr不符，或在2-D膠上表現(xiàn)出不同的蛋白點經鑒定為同一蛋白質，這與蛋白質的翻譯后修飾有關，如蛋白酶降解、糖基化和磷酸化。    我們應用蛋白質組學的方法對AL細胞和正常白細胞進行了差異蛋白質組的研究，研究顯示AL細胞蛋白質表達譜與其臨床表現(xiàn)及其形態(tài)特點呈現(xiàn)明顯的相關性，雖然獲得更全面的AL蛋白質表達特征，需大量的工作，但本研究結果表明，蛋白質組學方法為AL細胞分子特征的研究提供了一種新的有效研究手段，通過本研

24、究的擴展有助于發(fā)現(xiàn)與白血病發(fā)生及進展相關分子機制。            作者：崔久嵬，王冠軍，李薇，王杰，張學敏【摘】本研究利用蛋白質組學方法將急性白血病(acute leukemia，AL)細胞         本篇論文是由3COME文檔頻道的網友為您在網絡上收集整理餅投稿至本站的，論文版權屬原作者，請不用于商業(yè)用途或者抄襲，僅供參考學習之用，否者后果自負，如果此文侵犯您的合法權益，請聯(lián)系我們

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