臨床醫(yī)學檢驗主管技師考試輔導86

1、最新修正版第十四章 免疫細胞的分離及其表面標志檢測技術(shù)第一節(jié)免疫細胞的分離第二節(jié)淋巴細胞標志及亞群分類第三節(jié)其他的免疫細胞第四節(jié) 免疫細胞表面標志的檢測及應(yīng)用第一節(jié)免疫細胞的分離一、外周血單個核細胞的分離將2份6%聚蔗糖蒸餾水溶液與 1份34%乏影葡胺生理鹽水溶液混合，其比重為1.077 ± 0.002，可作為常規(guī)的淋巴細胞分離液，即Ficoll 分離液。'申單次密度梯度離心分離法，其分布由上到下依次為：的血漿層、單個核細胞層、粒細胞層和紅細胞層。稀釋二、淋巴細胞的分離純淋巴細胞群的采集是利用單核細胞在37C和CaT存在時，能主動黏附在玻璃、塑料、尼龍毛、棉花纖維或葡聚糖凝膠

2、的特性，從單個核細胞懸液中除去單核細胞，從而獲得純淋巴細胞群。1. 黏附貼壁法2. 吸附柱過濾法3. 磁鐵吸引法4. P ercoll 分離液法三、T細胞和B細胞的分離1. E花環(huán)沉降法2. 尼龍毛柱分離法四、T細胞亞群的分離1. 親和板結(jié)合分離法2. 磁性微球分離法3. 熒光激活細胞分離儀分離法五、分離細胞的保存1. 短期保存技術(shù)將分離的細胞用適量含 短期保存可置于 4C保存。2. 長期保存技術(shù)液氮深低溫（-196 C）10%- 20%滅活小牛血清的Hanks、Tc-199、RPMI1640或其他培養(yǎng)液稀釋重懸。環(huán)境保存細胞，加入二甲亞砜作為保護劑。六、分離細胞的活力測定活力測定最簡便常用的

3、為臺盼藍染色法。這種染料不能透過活細胞正常完整的細胞膜，故活細胞不著色，但死亡細胞的細胞膜通透性增加，可使染料通過細胞膜進入細胞內(nèi)，使死細胞著色呈藍色，通過死亡細胞與活細胞的百分比可反映細胞活力。七、不同細胞分離方法的綜合評價早期的免疫細胞分離技術(shù)主要是根據(jù)不同免疫細胞的物理屬性（如比重不同）和生物學屬性（如黏附 力不同）進行分離，用目前的標準看，其分離的靈敏度或分辨率都不高。作為一種傳統(tǒng)的分離手段其分離 效果已被認可，如用單個核細胞進行的某些實驗，一般被認為可以代表淋巴細胞，無特別需要一般并不采 用分離純化淋巴細胞的替代技術(shù)。作為富集某一類細胞的手段，傳統(tǒng)的方法仍不失為簡便和行之有效的技 術(shù)

4、，而且傳統(tǒng)，如 P ercoll連續(xù)密度離心法仍可得到非常理想的細胞分離效果，但P ercoll法分離流程長,手續(xù)繁多，若無特殊需要很少采用。傳統(tǒng)的細胞分離技術(shù)主要采用離心法，利用密度梯度原理進行分離，時間長、效果差。近期發(fā)展起來 的細胞分離技術(shù)大多是基于利用細胞表面標志（抗原或受體）進行細胞分離，較早出現(xiàn)的技術(shù)以細胞親和 層析為代表。隨后出現(xiàn)細胞固相包被技術(shù)，細胞淘洗技術(shù)，同時還有流式細胞儀分離技術(shù)，磁性微球分離 法。這些技術(shù)的出現(xiàn)使細胞分離技術(shù)產(chǎn)生了實質(zhì)性的進步。目前這類技術(shù)主要用于科研，在常規(guī)臨床實驗 室中并未廣泛應(yīng)用。另外這類技術(shù)所依賴的設(shè)備和試劑價格昂貴，目前尚不能完全替代經(jīng)典的細胞

5、分離技 術(shù)。第二節(jié)淋巴細胞標志及亞群分類一、T細胞表面標志及其亞群所有的T細胞均有共同的標志性抗原，一般認為是CD3Cd3 Cd4CD8輔助性T細胞（Th）CD3CD4CD8細胞毒性 T細胞（Tc或CTL）Cd4 CD25 調(diào)節(jié)性T細胞（Tr或Treg ）CD2表達于全部人 T細胞和NK細胞表面，因其能與綿羊紅細胞（SRBC結(jié)合，又稱為綿羊紅細胞受體。CD3是一種多鏈的糖蛋白，表達于全部T細胞表面，是T細胞的表面標志，是 TCR-CD3復(fù)合物的重要組成部分。CD4/ CD8 CD4和 CD8分子分別表達于外周血不同的T細胞亞群表面，是區(qū)分 T細胞亞群的重要標志。表達CD4的主要是輔助性 T細胞

6、，表達CD8的主要是細胞毒性 T細胞。其他表面標志：致有絲分裂受體、 病毒受體。（一）輔助性T細胞輔助性T細胞的典型表面標志是 Cd3 Cd4CD8。已證明不同的輔助性 T細胞株所產(chǎn)生的細胞因子不盡 相同，因而認為體內(nèi)至少存在兩種輔助性T細胞（Th1, Th2）。研究表明，Th1主要分泌IL-2、IFN- 丫或TNF-3等細胞因子輔助細胞免疫或參與遲發(fā)型超敏反應(yīng)，本身具有明顯的細胞毒作用；Th2主要分泌IL-4、IL-5、IL-6或IL-10等細胞因子輔助體液免疫，參與速發(fā)型超敏反應(yīng)，但本身不具有明顯的細胞毒作用。（二）細胞毒性T細胞細胞毒性T細胞的典型表面標志是 Cd3 CD4 Cd8。與輔

7、助性T細胞類似，細胞毒性 T細胞也可以分泌 細胞因子，而且不同的細胞株所產(chǎn)生的細胞因子也不盡相同，分泌細胞因子的特征與Th1和Th2十分相似，遂將細胞毒性T細胞再細分為 Tc1與Tc2, Tc1與Tc2都有典型的細胞毒性效應(yīng)。（三）調(diào)節(jié)性T細胞目前認為調(diào)節(jié)性 T細胞主要包括兩個亞群，一種是CD4CD25調(diào)節(jié)性T細胞；另一種為 CD8調(diào)節(jié)性T細胞，其主要包括 CD8CD28調(diào)節(jié)性T細胞和CD8 Qa-1限制性的調(diào)節(jié)性 T細胞。二、B細胞表面標志B細胞表面的膜免疫球蛋白（ Smig）、Fc受體、補體受體、EB病毒受體和小鼠紅細胞受體是B細胞的重要表面標志。膜免疫球蛋白（mig）又稱為BCR表達于所

8、有成熟的 B細胞和大多數(shù) B細胞瘤的細胞表面，屬于免疫 球蛋白超家族原型，是 B纟田胞最具特性的表面標志。mIg的主要作用是結(jié)合特異性抗原，故又稱為抗原受體。成熟B細胞的mig主要為mIgM和mIgDbB細胞及其亞群的檢測是研究自身免疫性疾病及疾病中免疫調(diào)節(jié)紊亂的重要指標。三、NK細胞表面標志人類NK細胞表面標志： CD16 CD56CD16分子又稱為低親和性IgG Fc受體，當IgG類抗體與靶細胞表面相應(yīng)抗原表位特異性結(jié)合后，可通 過其Fc段與NK細胞表面FcRin結(jié)合，行使針對靶細胞的定向非特異性殺傷作用，也即NK細胞的抗體依賴性細胞介導的細胞毒作用（ADCC。第三節(jié)其他的免疫細胞其他的免

9、疫細胞包括髓系細胞，如單核-巨噬細胞以及中性粒細胞等，特別是抗原提呈細胞尤為重要?？乖岢始毎ˋPC指能攝取、加工、處理抗原，并將抗原提呈給抗原特異性淋巴細胞的一類免疫細 胞。抗原提呈細胞可分為兩類： “專職”抗原提呈細胞，包括巨噬細胞、樹突狀細胞和B細胞，它們均可表達 MHC衛(wèi)類分子。 “非專職”抗原提呈細胞，包括內(nèi)皮細胞、上皮細胞和激活T細胞等，它們在某些因素刺激下可表達MHC-n類分子，并具有抗原提呈功能。所有表達MHC-I類分子并具有提呈內(nèi)源性抗原能力的細胞，廣義上也屬于抗原提呈細胞。一、單核-吞噬細胞系統(tǒng)單核-吞噬細胞系統(tǒng)（MPS包括骨髓內(nèi)的前單核細胞、外周血中的單核細胞和組織內(nèi)的

10、巨噬細胞。 單核-吞噬細胞的典型的表面標志是 CD14二、樹突狀細胞髓系和淋巴系。Th1的DC（ DC1和誘導分化 Th2樹突狀細胞（DC是一大類專職抗原提呈細胞，其主要有兩種來源，即 DC是形態(tài)、表型和功能高度異質(zhì)的細胞。根據(jù)刺激T細胞增殖能力的不同，它們被分為成熟和不成熟的DC根據(jù)誘導T細胞分化為不同效應(yīng) T細胞的功能，將它們分為誘導分化 的 DC（DC2 。根據(jù)明顯的譜系和細胞表型的不同，分為髓系DC和淋巴DC人成熟DC的主要特征表面標志為 CD1a CD11C和CD83第四節(jié)免疫細胞表面標志的檢測及應(yīng)用一、免疫細胞表面標志的檢測方法（一）抗體致敏細胞花環(huán)法（二）免疫細胞化學法通常以酶作

11、為抗體標志物，采用細胞酶免疫組織化學技術(shù)完成（詳見第十三章），并常采用生物素-鏈霉親和素放大系統(tǒng)提高靈敏度。該類方法可用普通顯微鏡觀察，凡著色的細胞即為相應(yīng) CD抗原陽性的細胞，計算陽性細胞占總計數(shù)細胞的百分率進行定量分析。本法簡便易行，不需特殊儀器，一般實驗室均可采用。（三）免疫熒光法本法是將分離得到的外周血單個核細胞與相應(yīng)的以熒光素標記的CD單克隆抗體作用（直接法），或與抗相應(yīng)CD單克隆抗體作用后，洗去游離的抗體，再加入熒光素標記的抗小鼠IgG抗血清，經(jīng)溫育結(jié)合后，洗去多余的標記抗體（間接法），制片后用熒光顯微鏡觀察結(jié)果，計算陽性細胞占總計數(shù)細胞的百分率。（四）流式細胞分析法目前免疫細胞的

12、檢測主要采用流式細胞術(shù)，結(jié)果客觀準確，重復(fù)性好。二、淋巴細胞表面標志檢測的臨床意義淋巴細胞表面標志檢測是評價免疫功能的重要指標。由于淋巴細胞，特別是T淋巴細胞在執(zhí)行免疫功能方面發(fā)揮多種作用，故有必要對各類淋巴細胞（淋巴細胞亞群）進行分析。這中間主要是通過表面標志 識別進行計數(shù)。在評價免疫功能時經(jīng)常采用CD4/ CD8比值。如CD4是HIV受體，HIV感染時CD4/CD8比值明顯降低。但CD4陽性細胞包括了很多功能性細胞，如TH Tr等，CD8陽性細胞也是如此，所以單用CD4/ CD8比值反映免疫功能顯然不夠準確。除AIDS患者外，實際觀察 CD4/ CD8比值與患者的免疫功能及臨床癥狀的關(guān)系及意義有限。對CD4和CD8T細胞的測定，有助于免疫缺陷疾病、自身免疫性疾病和移植排斥反應(yīng)的監(jiān)測。CD4/CD8升高常見于自身免疫性疾病；而CD4/ CD8降低常見于病毒感染、惡性腫瘤和再生障礙性貧血等。在使用淋巴細胞計數(shù)資料時應(yīng)特別注意淋巴細胞計數(shù)所采用的方法，因為不同的方法所得到的結(jié)果差 別很大，特別是目前對淋巴細胞檢測方面尚無高水平的質(zhì)控以及質(zhì)控標準，所以不同實驗室的檢測結(jié)果可 比性差。標本處理方法不同、實驗條