藥典三部版通則細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法

1、1143 細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法本法系利用鱟試劑來(lái)檢測(cè)或量化由革蘭陰性菌產(chǎn)生的細(xì)菌內(nèi)毒素，以判斷供試品中細(xì)菌 內(nèi)毒素的限量是否符合規(guī)定的一種方法。細(xì)菌內(nèi)毒素檢查包括兩種方法，即凝膠法和光度測(cè)定法，后者包括濁度法和顯色基質(zhì)法。供試品檢測(cè)時(shí)，可使用其中任何一種方法進(jìn)行試驗(yàn)。當(dāng)測(cè)定結(jié)果有爭(zhēng)議時(shí)，除另有規(guī)定外， 以凝膠限度試驗(yàn)結(jié)果為準(zhǔn)。本試驗(yàn)操作過(guò)程應(yīng)防止內(nèi)毒素的污染。細(xì)菌內(nèi)毒素的量用內(nèi)毒素單位（EU）表示，1EU與1個(gè)內(nèi)毒素國(guó)際單位（IU）相當(dāng)。細(xì)菌內(nèi)毒素國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)品系自大腸埃希菌提取精制而成，用于標(biāo)定、復(fù)核、仲裁鱟試劑靈敏度、標(biāo)定細(xì)菌內(nèi)毒素工作標(biāo)準(zhǔn)品的效價(jià)，干擾試驗(yàn)及檢查法中編號(hào)B和C溶液的制備、凝 膠法

2、中鱟試劑靈敏度復(fù)核試驗(yàn)、光度測(cè)定法中標(biāo)準(zhǔn)曲線可靠性試驗(yàn)。細(xì)菌內(nèi)毒素工作標(biāo)準(zhǔn)品系以細(xì)菌內(nèi)毒素國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)品為基準(zhǔn)標(biāo)定其效價(jià)，用于干擾試驗(yàn)及 檢查法中編號(hào)B和C溶液的制備、凝膠法中鱟試劑靈敏度復(fù)核試驗(yàn)、光度測(cè)定法中標(biāo)準(zhǔn)曲線 可靠性試驗(yàn)。細(xì)菌內(nèi)毒素檢查用水應(yīng)符合滅菌注射用水標(biāo)準(zhǔn)，其內(nèi)毒素含量小于0.015EU/ml （用于凝膠法）或0.005EU/ml （用于光度測(cè)定法），且對(duì)內(nèi)毒素試驗(yàn)無(wú)干擾作用。試驗(yàn)所用的器皿需經(jīng)處理，以去除可能存在的外源性內(nèi)毒素。耐熱器皿常用干熱滅菌法（250C、30分鐘以上）去除，也可采用其他確證不干擾細(xì)菌內(nèi)毒素檢查的適宜方法。若使 用塑料器皿，如微孔板和與微量加樣器配套的吸頭等

3、，應(yīng)選用標(biāo)明無(wú)內(nèi)毒素并且對(duì)試驗(yàn)無(wú)干 擾的器具。供試品溶液的制備 某些供試品需進(jìn)行復(fù)溶、稀釋或在水性溶液中浸提制成供試品溶液。必要時(shí)，可調(diào)節(jié)被測(cè)溶液（或其稀釋液）的 pH值，一般供試品溶液和鱟試劑混合后溶液的pH值在6.08.0的范圍內(nèi)為宜，可使用適宜的酸、堿溶液或緩沖溶液調(diào)節(jié)pH值。酸或堿溶液須用細(xì)菌內(nèi)毒素檢查用水在已去除內(nèi)毒素的容器中配制。緩沖液必須經(jīng)過(guò)驗(yàn)證不含內(nèi)毒素 和干擾因子。內(nèi)毒素限值的確定 藥品、生物制品的細(xì)菌內(nèi)毒素限值（L ）一般按以下公式確定:L=K/M式中 L為供試品的細(xì)菌內(nèi)毒素限值，一般以 EU/ml、EU/mg或EU/U （活性單位）表示;K為人每千克體重每小時(shí)最大可接受的

4、內(nèi)毒素劑量，以EU/ （kg h）表示，注射劑K=5EU/(kg h)，放射性藥品注射劑 K=2.5 EU/(kg h)，鞘內(nèi)用注射劑K=0.2 EU/ (kg h);M為人用每千克體重每小時(shí)的最大供試品劑量，以ml/(kg h)、mg/(kg h)或U/(kg h)表示，人均體重按60kg計(jì)算，人體表面積按1.62 rf計(jì)算。注射時(shí)間若不足1小時(shí),按1小時(shí)計(jì)算。供試品每平方米體表面積劑量乘以0.027即可轉(zhuǎn)換為每千克體重劑 量（M ） o按人用劑量計(jì)算限值時(shí)，如遇特殊情況，可根據(jù)生產(chǎn)和臨床用藥實(shí)際情況做必要調(diào)整, 但需說(shuō)明理由。確定最大有效稀釋倍數(shù)(MVD) 最大有效稀釋倍數(shù)是指在試驗(yàn)中供試

5、品溶液被允許達(dá) 到稀釋的最大倍數(shù)(1-MVD ),在不超過(guò)此稀釋倍數(shù)的濃度下進(jìn)行內(nèi)毒素限值的檢測(cè)。用以 下公式來(lái)確定MVD :MVD=cL/入式中 L為供試品的細(xì)菌內(nèi)毒素限值;c為供試品溶液的濃度，當(dāng)L以EU/mg或EU/U表示時(shí)，c的單位需為mg/ml或U/ml，當(dāng)L以EU/ml表示時(shí)，則c等于1.0ml/ml。如需計(jì)算在MVD時(shí)的供試品濃度，即最小有效稀釋濃度，可使用公式c=X /L入為在凝膠法中鱟試劑的標(biāo)示靈敏度(EU/ml )，或是在光度測(cè)定法中所使用的標(biāo)準(zhǔn)曲 線上最低的內(nèi)毒素濃度。方法1凝膠法凝膠法系通過(guò)鱟試劑與內(nèi)毒素產(chǎn)生凝集反應(yīng)的原理進(jìn)行限度檢測(cè)或半定量檢測(cè)內(nèi)毒素的 方法。鱟試劑靈

6、敏度復(fù)核試驗(yàn) 在本檢查法規(guī)定的條件下，使鱟試劑產(chǎn)生凝集的內(nèi)毒素的最低 濃度即為鱟試劑的標(biāo)示靈敏度，用 EU/ml標(biāo)示。當(dāng)使用新批號(hào)的鱟試劑或試驗(yàn)條件發(fā)生了任 何可能影響檢驗(yàn)結(jié)果的改變時(shí)，應(yīng)進(jìn)行鱟試劑靈敏度復(fù)核試驗(yàn)。根據(jù)鱟試劑靈敏度的標(biāo)示值(R，將細(xì)菌內(nèi)毒素國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)品或細(xì)菌內(nèi)毒素工作標(biāo)準(zhǔn)品用細(xì)菌內(nèi)毒素檢查用水溶解，在旋渦混合器上混勻15分鐘，然后制成2A、入0.5入和0.25 )四個(gè)濃度的內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)溶液，每稀釋一步均應(yīng)在旋渦混合器上混勻30秒。取分裝有0.1ml鱟試劑溶液的10mrK 75mm試管或復(fù)溶后的0.1ml/支規(guī)格的鱟試劑原安瓿18支。其中16管分別加入0.1ml不同濃度的內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)溶

7、液，每一個(gè)內(nèi)毒素濃度平行做4管；另外2管加入0.1ml 細(xì)菌內(nèi)毒素檢查用水作為陰性對(duì)照。將試管中溶液輕輕混勻后，封閉管口，垂直放入37C±C 的恒溫器中，保溫60分鐘±分鐘。將試管從恒溫器中輕輕取出，緩緩倒轉(zhuǎn)180。，若管內(nèi)形成凝膠，并且凝膠不變形、不從 管壁滑脫者為陽(yáng)性；未形成凝膠或形成的凝膠不堅(jiān)實(shí)、變形并從管壁滑脫者為陰性。保溫和 拿取試管過(guò)程中應(yīng)避免收到振動(dòng)，造成假陰性結(jié)果。當(dāng)最大濃度2入管均為陽(yáng)性，最低濃度0.25 /管均為陰性，陰性對(duì)照管為陰性，試驗(yàn)方為 有效。按下式計(jì)算反應(yīng)終點(diǎn)濃度的幾何平均值，即為鱟試劑靈敏度的測(cè)定值（入 c=antilg（刀 X/n）式中 X

8、為反應(yīng)終點(diǎn)濃度的對(duì)數(shù)值（Ig）。反應(yīng)終點(diǎn)濃度是指系列遞減的內(nèi)毒素濃度中最后一個(gè)呈陽(yáng)性結(jié)果的濃度；n為每個(gè)濃度的平行管數(shù)。當(dāng)入在0.52入（包括0.5 :和2R時(shí)，方可用于細(xì)菌內(nèi)毒素檢查，并以標(biāo)示靈敏度入為該批鱟試劑的靈敏度。干擾試驗(yàn) 按表1制備溶液A、B、C和D,使用的供試品溶液應(yīng)為未檢驗(yàn)出內(nèi)毒素且不 超過(guò)最大有效稀釋倍數(shù)（MVD ）的溶液，按鱟試劑靈敏度復(fù)核試驗(yàn)項(xiàng)下操作。表1凝膠法干擾試驗(yàn)溶液的制備編號(hào)內(nèi)毒素濃度/被加入內(nèi)毒素的溶液稀釋用液稀釋倍數(shù)所含內(nèi)毒素的濃度平行管數(shù)A無(wú)/供試品溶液一一一2B2入供試品溶液供試品溶液12入421入440.5入480.25 入4C2入檢查用水檢查用水12入

9、221入240.5入280.25 入2D無(wú)/檢查用水一一一2注：A為供試品溶液；B為干擾試驗(yàn)系列；C為鱟試劑標(biāo)示靈敏度的對(duì)照系列；D為陰性對(duì)照。只有當(dāng)溶液A和陰性對(duì)照溶液D的所有平行管都為陰性，并且系列溶液C的結(jié)果符合鱟試劑靈敏度復(fù)核試驗(yàn)要求時(shí)，試驗(yàn)方為有效。當(dāng)系列濃度B的結(jié)果符合鱟試劑靈敏度復(fù)核試驗(yàn)要求時(shí)，認(rèn)為供試品在該濃度下無(wú)干擾作用。其他情況則認(rèn)為供試品在該濃度下存在干擾作用。若供試品溶液在小于 MVD的稀釋倍數(shù)下對(duì)試驗(yàn)有干擾，應(yīng)將供試品溶液進(jìn)行不超過(guò)MVD的進(jìn)一步稀釋?zhuān)僦貜?fù)干擾試驗(yàn)?？赏ㄟ^(guò)對(duì)供試品進(jìn)行更大倍數(shù)的稀釋或通過(guò)其他適宜的方法（如過(guò)濾、中和、透析或加 熱處理等）排除干擾。為確

10、保所選擇的處理方法能有效地排除干擾且不會(huì)使內(nèi)毒素失去活性, 要使用預(yù)先添加了標(biāo)準(zhǔn)內(nèi)毒素再經(jīng)過(guò)處理的供試品溶液進(jìn)行干擾試驗(yàn)。當(dāng)進(jìn)行新藥的內(nèi)毒素檢查試驗(yàn)前，或無(wú)內(nèi)毒素檢查項(xiàng)的品種建立內(nèi)毒素檢查法時(shí)，須進(jìn) 行干擾試驗(yàn)。當(dāng)鱟試劑、供試品的處方、生產(chǎn)工藝改變或試驗(yàn)環(huán)境中發(fā)生了任何有可能影響試驗(yàn)結(jié)果 的變化時(shí)，須重新進(jìn)行干擾試驗(yàn)。檢查法凝膠限度試驗(yàn)按表2制備溶液A、B、C和D。使用稀釋倍數(shù)不超過(guò)MVD并且已經(jīng)排除干擾的供試品 溶液來(lái)制備溶液A和B。按鱟試劑靈敏度復(fù)核試驗(yàn)項(xiàng)下操作。表2凝膠限度試驗(yàn)溶液的制備編號(hào)內(nèi)毒素濃度/配制內(nèi)毒素的溶液平行管數(shù)A無(wú)/供試品溶液2B2入供試品溶液2C2 "檢查用水

11、2D無(wú)/檢查用水2注：A為供試品溶液；B為供試品陽(yáng)性對(duì)照；C為陽(yáng)性對(duì)照；D為陰性對(duì)照。結(jié)果判斷 保溫60分鐘分鐘后觀察結(jié)果。若陰性對(duì)照溶液 D的平行管均為陰性，供 試品陽(yáng)性對(duì)照溶液B的平行管均為陽(yáng)性，陽(yáng)性對(duì)照溶液 C的平行管均為陽(yáng)性，試驗(yàn)有效。若溶液A的兩個(gè)平行管均為陰性，判定供試品符合規(guī)定。若溶液A的兩個(gè)平行管均為陽(yáng) 性，判定供試品不符合規(guī)定。若溶液 A的兩個(gè)平行管中的一管為陽(yáng)性，另一管為陰性，需進(jìn) 行復(fù)試。復(fù)試時(shí)溶液A需做4支平行管，若所有平行管均為陰性，判定供試品符合規(guī)定，否 則判定供試品不符合規(guī)定。若供試品的稀釋倍數(shù)小于 MVD而溶液A出現(xiàn)不符合規(guī)定時(shí)，需將供試品稀釋至 MVD 重新實(shí)

12、驗(yàn)，再對(duì)結(jié)果進(jìn)行判斷。凝膠半定量試驗(yàn)本方法系通過(guò)確定反應(yīng)終點(diǎn)濃度來(lái)量化供試品中內(nèi)毒素的含量。按表3制備溶液A、B、C和D。按鱟試劑靈敏度復(fù)核試驗(yàn)項(xiàng)下操作。結(jié)果判斷若陰性對(duì)照溶液D的平行管均為陰性，供試品陽(yáng)性對(duì)照溶液B的平行管均為陽(yáng)性，系列溶液C的反應(yīng)終點(diǎn)濃度的幾何平均值在 0.52入試驗(yàn)有效。系列溶液A中每一系列的終點(diǎn)稀釋倍數(shù)乘以 入為每個(gè)系列的反應(yīng)終點(diǎn)濃度。如果檢驗(yàn) 的是經(jīng)稀釋的供試品，則將終點(diǎn)濃度乘以供試品進(jìn)行半定量試驗(yàn)的初始稀釋倍數(shù)，即得到每 一系列內(nèi)毒素濃度C。若每一系列內(nèi)毒素濃度均小于規(guī)定的限值，判定供試品符合規(guī)定。每一系列內(nèi)毒素濃度的幾何平均值即為供試品溶液的內(nèi)毒素濃度 按公式CE

13、=antilg （刀c/2 。若試驗(yàn)中供試品溶液 的所有平行管均為陰性，應(yīng)記為內(nèi)毒素濃度小于入（如果檢驗(yàn)的是稀釋過(guò)的供試品，則記為 小于入乘以供試品進(jìn)行半定量試驗(yàn)的初始稀釋倍數(shù)）若任何系列內(nèi)毒素濃度不小于規(guī)定的限值時(shí)，則判定供試品不符合規(guī)定。當(dāng)供試品溶液的所有平行管均為陽(yáng)性，可記為內(nèi)毒素的濃度大于或等于最大的稀釋倍數(shù)乘以表3 凝膠半定量試驗(yàn)溶液的制備編號(hào)內(nèi)毒素濃度/被加入 內(nèi)毒素的溶液稀釋用液稀釋倍數(shù)所含內(nèi)毒素的濃 度平行管數(shù)A無(wú)/供試品溶液檢查用水1一22一24一28一2B2入供試品溶液12入2C2入檢查用水檢查用水12入221入240.5280.25 入2D無(wú)/檢查用水一一一2注：A為不超

14、過(guò)MVD并且通過(guò)干擾試驗(yàn)的供試品溶液。從通過(guò)干擾試驗(yàn)的稀釋倍數(shù)開(kāi)始用檢查用水稀釋至1倍、2倍、4倍和8倍，最后的稀釋倍數(shù)不得超過(guò)MVD。B為2入濃度標(biāo)準(zhǔn)內(nèi)毒素的溶液 A （供試品陽(yáng)性對(duì)照）。C為鱟試劑標(biāo)示靈敏度的對(duì)照系列。D為陰性對(duì)照。方法2光度測(cè)定法光度測(cè)定法分為濁度法和顯色基質(zhì)法。濁度法系利用檢測(cè)鱟試劑與內(nèi)毒素反應(yīng)過(guò)程中的濁度變化而測(cè)定內(nèi)毒素含量的方法。根據(jù)檢測(cè)原理，可分為終點(diǎn)濁度法和動(dòng)態(tài)濁度法。終點(diǎn)濁度法是依據(jù)反應(yīng)混合物中的內(nèi)毒素濃 度和其在孵育終止時(shí)的濁度（吸光度或透光率）之間存在的量化關(guān)系來(lái)測(cè)定內(nèi)毒素含量的方 法。動(dòng)態(tài)濁度法是檢測(cè)反應(yīng)混合物的濁度到達(dá)某一預(yù)先設(shè)定的吸光度或透光率所需的

15、反應(yīng)時(shí)間，或是檢測(cè)濁度增加速度的方法。顯色基質(zhì)法系利用檢測(cè)鱟試劑與內(nèi)毒素反應(yīng)過(guò)程中產(chǎn)生的凝固酶使特定底物釋放出呈色團(tuán)的多少而測(cè)定內(nèi)毒素含量的方法。根據(jù)檢測(cè)原理，分為終點(diǎn)顯色法和動(dòng)態(tài)顯色法。終點(diǎn)顯色法是依據(jù)反應(yīng)混合物中內(nèi)毒素濃度和其在孵育終止時(shí)釋放出的呈色團(tuán)的量之間存在的量化關(guān)系來(lái)測(cè)定內(nèi)毒素含量的方法。動(dòng)態(tài)顯色法是檢測(cè)反應(yīng)混合物的吸光度或透光率達(dá)到某一預(yù)先設(shè)定的檢測(cè)值所需要的反應(yīng)時(shí)間，或檢測(cè)值增加速度的方法。光度測(cè)定試驗(yàn)需在特定的儀器中進(jìn)行，溫度一般為37C ± C。供試品和鱟試劑的加樣量、供試品和鱟試劑的比例以及保溫時(shí)間等，參照所用儀器和試劑的有關(guān)說(shuō)明進(jìn)行。為保證濁度和顯色試驗(yàn)的有效

16、性，應(yīng)預(yù)先進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)曲線的可靠性試驗(yàn)以及供試品的干擾試驗(yàn)。標(biāo)準(zhǔn)曲線的可靠性試驗(yàn)當(dāng)使用新批號(hào)的鱟試劑或試驗(yàn)條件有任何可能會(huì)影響檢驗(yàn)結(jié)果的改變時(shí)，需進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)曲線的可靠性試驗(yàn)。用標(biāo)準(zhǔn)內(nèi)毒素制成溶液，制成至少 3個(gè)濃度的稀釋液（相鄰濃度間稀釋倍數(shù)不得大于10倍），最低濃度不得低于所用鱟試劑的標(biāo)示檢測(cè)限。每一稀釋步驟的混勻時(shí)間同凝膠法，每濃度至少做3支平行管。同時(shí)要求做2支陰性對(duì)照，當(dāng)陰性對(duì)照的吸光度或透光率小于標(biāo)準(zhǔn)曲線最低點(diǎn)的檢測(cè)值或反應(yīng)時(shí)間大于標(biāo)準(zhǔn)曲線最低點(diǎn)的反應(yīng)時(shí)間，將全部數(shù)據(jù)進(jìn)行線性回歸分析。根據(jù)線性回歸分析，標(biāo)準(zhǔn)曲線的相關(guān)系數(shù)（r）的絕對(duì)值應(yīng)大于或等于0.980,試驗(yàn)方為有效。否則須重新試驗(yàn)。干

17、擾試驗(yàn) 選擇標(biāo)準(zhǔn)曲線中點(diǎn)或一個(gè)靠近中點(diǎn)的內(nèi)毒素濃度（設(shè)為?m），作為供試品干擾試驗(yàn)中添加的內(nèi)毒素濃度。按表 4制備溶液A、B、C和D。表4光度測(cè)定法干擾試驗(yàn)溶液的制備編號(hào)內(nèi)毒素濃度被加入內(nèi)毒素的溶液平行管數(shù)A無(wú)供試品溶液至少2B標(biāo)準(zhǔn)曲線的中點(diǎn)（或附近 點(diǎn)）的濃度（設(shè)為石）供試品溶液至少2C至少3個(gè)濃度（最低一點(diǎn) 設(shè)定為X）檢查用水每一濃度至少2D無(wú)檢查用水至少2注：A為稀釋倍數(shù)不超過(guò) MVD的供試品溶液。B為加入了標(biāo)準(zhǔn)曲線中點(diǎn)或靠近中點(diǎn)的一個(gè)已知內(nèi)毒素濃度的,且與溶液A有相同稀釋倍數(shù)的供試品溶液。C為如“標(biāo)準(zhǔn)曲線的可靠性試驗(yàn)”項(xiàng)下描述的，用于制備標(biāo)準(zhǔn)曲線的標(biāo)準(zhǔn)內(nèi)毒素溶液。D為陰性對(duì)照。按所得線性回歸方程分別計(jì)算出供試品溶液和含標(biāo)準(zhǔn)內(nèi)毒素的供試品溶液的內(nèi)毒素含量 ct和cs,再按下式計(jì)算該試驗(yàn)條件下的回收率(R)。R=(cs-ct)/ mxioo%當(dāng)內(nèi)毒素的回收率在50%200%，則認(rèn)為在此試驗(yàn)條件下供試品溶液不存在干擾作用。 當(dāng)內(nèi)毒素的回收率不在指定的范圍內(nèi)， 須按“凝膠法干擾試驗(yàn)”中的方法去除干擾因素,并重復(fù)干擾試驗(yàn)來(lái)驗(yàn)證處理的有效性。當(dāng)鱟試劑、供試品的來(lái)源、處方、生產(chǎn)工藝改變或試驗(yàn)環(huán)境中發(fā)生了任何有可能影響試 驗(yàn)結(jié)果的變化時(shí)，須重新進(jìn)行干擾試驗(yàn)。檢查法按“光度測(cè)定法的干擾試驗(yàn)”中的操作步驟進(jìn)行檢測(cè)。使用系列溶液