神經(jīng)干細(xì)胞增殖和分化實(shí)驗(yàn)

1、神經(jīng)干細(xì)胞增殖和分化實(shí)驗(yàn) 神經(jīng)細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)是神經(jīng)藥理學(xué)領(lǐng)域的一項(xiàng)重要技術(shù)，是開(kāi)發(fā)和討論神經(jīng)系統(tǒng)藥物的重要手段。與其他細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)相比，技術(shù)難度大，要求條件高。盡管各個(gè)試驗(yàn)室所用條件和辦法不盡相同，但培養(yǎng)時(shí)均應(yīng)注重：防止微生物的污染，保持ph相對(duì)穩(wěn)定，盡量縮短操作時(shí)光，選用優(yōu)質(zhì)血清和挑選合適的生長(zhǎng)、分化條件等措施提高神經(jīng)細(xì)胞的存活率。原代神經(jīng)細(xì)胞培養(yǎng)主要包括神經(jīng)元及神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞培養(yǎng)。神經(jīng)元培養(yǎng)對(duì)養(yǎng)分條件的要求較高，培養(yǎng)基已經(jīng)商業(yè)化可挺直購(gòu)得，在選用血清問(wèn)題上推舉用法公認(rèn)、質(zhì)量較為穩(wěn)定的優(yōu)質(zhì)胎牛血清，有利于神經(jīng)元的存活。 神經(jīng)干細(xì)胞增殖和分化試驗(yàn) 【原理和目的】 神經(jīng)干細(xì)胞（neural stem

2、 cell, nsc）是指具有分化為神經(jīng)元、星形角質(zhì)細(xì)胞和少突膠質(zhì)細(xì)胞潛能，并具有自我更新能力的一類細(xì)胞。近年來(lái)神經(jīng)干細(xì)胞已成為神經(jīng)生物學(xué)，神經(jīng)藥理學(xué)的討論熱點(diǎn)之一。這類細(xì)胞可以自我增殖、分化、遷移，形成成熟的神經(jīng)元或神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞，即存在神經(jīng)元再生現(xiàn)象，而新生的神經(jīng)元和神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞對(duì)于維持大腦正常的生理功能至關(guān)重要。近年來(lái)的討論證明，多種神經(jīng)系統(tǒng)疾患包括腦損傷、神經(jīng)退行性疾病、抑郁癥等的發(fā)生均與神經(jīng)元再生疏遠(yuǎn)相關(guān)。促進(jìn)神經(jīng)元再生可能是多種神經(jīng)系統(tǒng)藥物（腦庇護(hù)藥，抗抑郁劑等）共同的作用機(jī)制之一。 哺乳動(dòng)物胚胎期，神經(jīng)干細(xì)胞主要分布在大腦皮質(zhì)、紋狀體、海馬、室管膜下層（subven-tricula

3、r zone, svz）和中腦等區(qū)域；成年后，主要局限在室管膜下層和海馬齒狀回顆粒下層區(qū)域（subgranular zone, sgz )。目前體外神經(jīng)干細(xì)胞的分別辦法主要從胚胎或成年動(dòng)物的腦中取材，將所取的腦區(qū)組織舉行解離簇?fù)?，形成幾個(gè)至幾千個(gè)細(xì)胞組成的小圓團(tuán)塊組織（神經(jīng)球），最后將細(xì)胞裸露于含有高濃度的促細(xì)胞分裂劑如堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子或表皮生長(zhǎng)因子中，增殖至一定數(shù)量后，加入適量的待測(cè)藥物孵育，可采納 mtt法，cck-8法，3h-tdr摻入法等考察藥物對(duì)神經(jīng)干細(xì)胞增殖的影響。撤除神經(jīng)干細(xì)胞培養(yǎng)基中的表皮生長(zhǎng)因子和堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子并同時(shí)加入10的胎牛血清，可誘導(dǎo)神經(jīng)干細(xì)胞分化為神經(jīng)

4、元或神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞，分化過(guò)程中加入待測(cè)藥物，采納免疫細(xì)胞化學(xué)法檢測(cè)藥物對(duì)神經(jīng)干細(xì)胞分化的影響。通過(guò)考察藥物對(duì)神經(jīng)干細(xì)胞增殖和分化的影響，初步篩選其對(duì)神經(jīng)系統(tǒng)作用或探討其作用機(jī)制。 目前神經(jīng)干細(xì)胞分別辦法有3種：免疫磁珠細(xì)胞分選法：利用神經(jīng)干細(xì)胞表面抗原特異性，在磁場(chǎng)作用下使能與表面具有特異性抗體的磁珠結(jié)合的神經(jīng)干細(xì)胞分別出來(lái)，從而使神經(jīng)干細(xì)胞得到分別純化；此法具有便捷、分別純度高和分別容量大等優(yōu)點(diǎn)，是目前較為推崇的神經(jīng)干細(xì)胞分別辦法；反復(fù)傳代法：取新生動(dòng)物或適當(dāng)周齡動(dòng)物的胚胎大腦或腦區(qū)，機(jī)械分別制作單細(xì)胞懸液，在含有多種神經(jīng)因子的無(wú)血清培養(yǎng)基中培養(yǎng)，經(jīng)過(guò)長(zhǎng)久反復(fù)傳代可獲得純化的神經(jīng)干細(xì)胞；此法操

5、作步驟多、耗時(shí)，但所需設(shè)備容易，便于開(kāi)展，目前仍為常規(guī)的神經(jīng)干細(xì)胞分別辦法；流式細(xì)胞檢測(cè)法：應(yīng)用流式細(xì)胞技術(shù)分選出具有cd33+/cd34+/cd45-細(xì)胞表面抗原的神經(jīng)干細(xì)胞；此法所需設(shè)備昂貴，技術(shù)要求較高，而獲得的神經(jīng)干細(xì)胞純度不高。本節(jié)中以新生大鼠反復(fù)傳代法為例介紹神經(jīng)干細(xì)胞的分別、培養(yǎng)、鑒定和分化及其在藥物討論中的應(yīng)用。 【材料】 1新生24小時(shí)內(nèi)的wistar大鼠。 2主要試劑、進(jìn)口、dmem/f12培養(yǎng)基、n2添加劑、b27添加劑、表皮生長(zhǎng)因子（epidermal growth factor, egf)、堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子（basic fibroblast growth fac

6、tor, bfgf) ,mtf,cck-8試劑盒、3h-胸腺嘧啶核昔(3 h-tdr )、兔抗大鼠神經(jīng)元特、兔抗大鼠膠質(zhì)、兔抗大鼠巢蛋白單克隆抗體、羊抗免-cy3熒光二抗等。 3主要儀器超凈化工作臺(tái)、c02孵箱、倒置相差顯微鏡、熒光顯微鏡、液體閃耀計(jì)數(shù)儀、96孔掃描分光光度計(jì)等。 【辦法】 1神經(jīng)干細(xì)胞的分別、培養(yǎng)及鑒定無(wú)菌剝離新生大鼠的全腦，置于冰冷的d-hanks液中沖洗，解剖顯微鏡下分別雙側(cè)海馬組織，用眼科剪刀剪成糜狀，0.12537消化2030分鐘，用含10胎牛血清的dmem/f12培養(yǎng)基終止胰酶的作用，離心后將細(xì)胞懸浮于神經(jīng)干細(xì)胞培養(yǎng)液（dmem/f12+2% b27添加劑+1% n

7、2添加劑+20ng/ml bfgf+20ng/ml egf+2mmol/l+100u/ml+100ug/ml）中，再次離心（1000r/min,10分鐘）去除胰酶和血清后，過(guò)200目細(xì)胞篩，得到單個(gè)細(xì)胞懸液，錐蟲(chóng)藍(lán)染色檢測(cè)細(xì)胞存活率，保證細(xì)胞的存活率在95以上。調(diào)節(jié)細(xì)胞濃度以(78)x105/ml的密度，將細(xì)胞接種于（polylysine, pll）處理的t25培養(yǎng)瓶中，每3天半量換液1次，換液時(shí)需離心(1000r/min,10分鐘），去半量上清液，重新加入半量新的神經(jīng)干細(xì)胞培養(yǎng)液，7天傳代，收集神經(jīng)球，巴斯德管輕柔將神經(jīng)球吹打成單細(xì)胞，接種密度為（35)x105/ml。 2試驗(yàn)設(shè)計(jì) (1)藥

8、物對(duì)神經(jīng)干細(xì)胞增殖作用的影響：選取第2代生長(zhǎng)良好的神經(jīng)干細(xì)胞即可挺直接種在96孔或24孔板中培養(yǎng)，待細(xì)胞融合即可試驗(yàn)。通常把細(xì)胞孔分成正常組（不加藥）和若干給藥組（加不同劑量藥物）。給藥組細(xì)胞首先給含藥培養(yǎng)液，培養(yǎng)數(shù)小時(shí)（普通472小時(shí)內(nèi)），然后舉行形態(tài)學(xué)觀看，采納mtt法、cck-8法和3h-tdr摻入法檢測(cè)藥物對(duì)神經(jīng)干細(xì)胞增殖的影響。 (2）藥物對(duì)神經(jīng)干細(xì)胞分化的影響：吸出培養(yǎng)瓶中的神經(jīng)球，離心撤除絲裂原，將沉淀重懸于神經(jīng)干細(xì)胞分化培養(yǎng)基中（dmem/f12+2% b27添加劑+1%n2添加劑+2mmo1/l+100u/ml+100ug/ml+10），同樣接種于含pll處理過(guò)的蓋玻片的六孔

9、板中，給藥組中加入不同濃度的待測(cè)藥物，正常組（不給藥）加入同等體積的pbs。4872小時(shí)換液1次（維持待測(cè)藥物的濃度）。培養(yǎng)67天終止培養(yǎng)，于倒置顯微鏡下觀看形態(tài)，并舉行細(xì)胞免疫化學(xué)染色檢測(cè)藥物對(duì)神經(jīng)干細(xì)胞分化的影響，試驗(yàn)流程見(jiàn)圖11-29。 【結(jié)果與分析】 1神經(jīng)干細(xì)胞的鑒定 (1)形態(tài)學(xué)觀看：將新生大鼠海馬組織的單細(xì)胞懸浮于神經(jīng)干細(xì)胞培養(yǎng)基，接種于25 ml的細(xì)胞培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)觀看。剛接種的細(xì)胞為圓形，大小不一，邊緣發(fā)亮，折光性強(qiáng)。培養(yǎng)第24天，部分細(xì)胞死亡，可見(jiàn)大量細(xì)胞碎片；培養(yǎng)液內(nèi)可見(jiàn)數(shù)個(gè)細(xì)胞組成的細(xì)胞團(tuán)（或稱神經(jīng)球），如典型的兩個(gè)細(xì)胞銜接成的啞鈴形；隨著培養(yǎng)時(shí)光的延伸（大約至1周時(shí)），神經(jīng)

10、球的體積與數(shù)目不斷的增多，它們懸浮生長(zhǎng)，形態(tài)規(guī)章，沒(méi)有顯然的突起。若將神經(jīng)球用吸管吹打成單細(xì)胞或小細(xì)胞團(tuán)，傳代培養(yǎng)，傳代細(xì)胞經(jīng)57天又可以形成神經(jīng)球（圖11-30) ; (2）化學(xué)標(biāo)記物：巢蛋白（nestin )是一種中間絲蛋白，是神經(jīng)上皮干細(xì)胞特異性表達(dá)的分子標(biāo)記物?？刹杉{巢蛋白免疫熒光法染色舉行神經(jīng)干細(xì)胞的鑒定（圖11-31a)。 2神經(jīng)元的鑒定 (1)形態(tài)學(xué)特征：普通狀況神經(jīng)細(xì)胞接種1416小時(shí)后多數(shù)細(xì)胞貼壁，24小時(shí)后形成粗細(xì)不一的突起；細(xì)胞體逐漸變大，突起伸長(zhǎng)變粗，并逐步發(fā)出分支互相銜接，交織成網(wǎng)，光暈不斷擴(kuò)大。當(dāng)神經(jīng)細(xì)胞受損后，形態(tài)發(fā)生轉(zhuǎn)變，表現(xiàn)為細(xì)胞皺縮變形或胞體腫脹；膜結(jié)構(gòu)的轉(zhuǎn)變，浮現(xiàn)空泡和（或）膜表面微絨毛缺失或變形；進(jìn)一步損傷時(shí)，細(xì)胞膜可裂解，內(nèi)容物釋放，同時(shí)尚可浮現(xiàn)線粒體腫脹、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腫脹及脫顆粒等細(xì)胞器轉(zhuǎn)變，細(xì)胞核固縮、破碎甚至分解；損傷后突起可浮現(xiàn)樹(shù)突截?cái)?、碎裂甚至缺失?(2)化學(xué)標(biāo)記物：成熟的神經(jīng)元標(biāo)記物為特(neuron specific enolase,nse)，烯醇化酶有，組成的5種二聚體同工酶，其中型特異性的存在于神經(jīng)元和神經(jīng)內(nèi)分泌細(xì)胞中，被視為神