甾類同化激素類藥物殘留分析技術(shù)——前處理方法（一）

1、甾類同化激素類藥物殘留分析技術(shù)前處理方法（一） 8.1.4.1 前處理辦法 因?yàn)榛|(zhì)復(fù)雜，ass的殘留量極低，再加上樣品提取和純化的過程十分繁瑣，導(dǎo)致最后的回收率較低，使得樣品中ass多組分殘留的檢測具有一定的難度。不但要求有高敏捷度的檢測辦法，而且也需要相應(yīng)高效的提取和凈化辦法。普通固體樣品需要經(jīng)過粉碎或冷凍干燥均質(zhì)化后，在適當(dāng)條件下水解，將結(jié)合態(tài)的ass解離出來，然后經(jīng)有機(jī)溶劑提取和凈化后舉行分析。 (1) 水解辦法 ass在動物體內(nèi)常以結(jié)合態(tài)形式存在，如、等。為提高辦法提取效率，必需通過水解使ass游離出來。水解辦法普通有三種:酸解、堿解和酶解。 rambaud等建立了人頭發(fā)中ass多殘

2、留的氣相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜(gc-ms/ms)檢測辦法。樣品經(jīng)磨碎后在50條件下用甲醇提取，用甲醇化鈉(meona)和hcl舉行酸性水解后，用乙酸乙酯再次提取，再用naoh中和，gc-msms分析。辦法定量限(loq)可達(dá)0.110g/kg，平均回收率為50%。 kaklamanos等建立了肌肉組織中的20種ass的液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜(lc-ms/ms)檢測辦法。樣品用含枯草桿菌的ph9.5 tris緩沖液舉行堿水解，叔丁基甲醚提取，55旋轉(zhuǎn)蒸干，加入甲醇-水(4+1，v/v)渦動混勻，然后采納正己烷除脂，再用oasishlb和氨基柱分離舉行凈化后，lc-ms/ms檢測。該辦法檢測限(cca)為0

3、.030.14ng/g，檢測能力(cc)為0.050.24ng/g。 酶解的作用條件溫柔，可避開ass在強(qiáng)酸、高溫等條件下被破壞，且因?yàn)槊傅拇呋钚?，水解效率高，被廣泛用法。酶解常采納-葡萄糖醛酸苷酶和芳基硫酸酯酶，通常在37酶解數(shù)小時。marchand等利用氣相色譜-質(zhì)譜(gc-ms)檢測了肉中的ass。凍干樣品用-醋酸緩沖液提取后，通過和解離待測藥物(52孵育15小時，ph5.2)，再用緩沖液液液分配，過envi-chrom p柱凈化后，分離按酚結(jié)構(gòu)藥物和d4-3-酮類藥物舉行衍生化，再用gc-ms分析。該辦法測得23種ass的檢測限(lod)為5100ng/kg，其辦法學(xué)指標(biāo)符合歐盟標(biāo)準(zhǔn)

4、。 (2)提取辦法 ass殘留的提取主要采納液液萃取(lle)的辦法。近年來，一些新的提取技術(shù)，如微波輔助提取(mae)、加速溶劑萃取(ase)、超臨界流體萃取(sfe)也開頭應(yīng)用到ass殘留的提取中。 1) 液液萃取(liquid liquid extraction，lle) ass種類較多，殘留濃度較低(ng/kgg/kg)，且樣品基質(zhì)較為復(fù)雜，使殘留分析變得較為困難。普通來說，肉、脂肪、腎臟和肝臟常采納有機(jī)溶劑舉行l(wèi)le提取，同時舉行研磨、冷凍干燥和勻質(zhì)，然后舉行多步驟液液分配凈化或固相萃取凈化。普通常以甲醇為提取溶劑，、等也可作為其提取劑。 秦燕等建立了動物肌肉組織中多種ass的lc-

5、ms/ms分析辦法。樣品加醋酸緩沖溶液均質(zhì)，經(jīng)酶水解后，再加甲醇超聲提取，用叔丁基甲醚lle起碼兩次后，再用反相固相萃取柱凈化，用lc-ms/ms在多反應(yīng)監(jiān)測(mrm)模式下定性及定量分析。該辦法測得10種ass的loq為0.51.0g/kg，平均回收率為55%77%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(rsd)為7.1%35%。blasco等建立了肉中ass殘留檢測的lc-ms/ms分析辦法。樣品經(jīng)酶解后用甲醇提取，然后用c18和氨基柱固相萃取凈化，結(jié)合用法正離子和負(fù)離子切換模式舉行質(zhì)譜分析，辦法lod和loq都低于0.5ng/g。vanhaecke等建立了牛肉中34種ass(10種雌激素、14種雄激素和10種孕

6、激素)殘留的超高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜(uplc-ms/ms)檢測辦法。樣品經(jīng)甲醇勻質(zhì)，除脂，乙醚lle后，采納硅膠柱和氨基柱凈化。uplc-ms/ms采納大氣壓化學(xué)電離源(apci)在正離子和負(fù)離子模式下采集數(shù)據(jù)。該辦法的cca為0.040.88g/kg，cc為0.121.9ug/kg，日內(nèi)變異系數(shù)(cv)與日間cv均低于20%，線性關(guān)系良好(r 0.99)。 徐錦忠等用乙腈提取了雞肉和雞蛋中的睪酮、甲基睪酮、群勃龍、去氫睪酮、諾龍、美睪酮、康力龍、丙酸諾龍、丙酸睪酮和苯丙酸諾龍。超聲提取后用正己烷液液分配除脂，lc-ms/ms在挑選反應(yīng)監(jiān)測(srm)、正離子模式下舉行定性及定量分析。辦法loq

7、為0.5g/kg，平均回收率為73.4%108.9%，rsd為3.4%13.4%。試驗(yàn)比較了乙腈、叔丁基甲醚和乙酸乙酯的提取效率，發(fā)覺幾種溶劑的提取回收率相差不大，乙酸乙酯和叔丁基甲醚提取后脂肪較多，而乙腈提取液中則較少。 曾東平等建立了豬肉中8種性激素(己烯雌酚、甲基睪酮、17a-乙炔雌二醇、雌二醇、6a-甲基-17a-羥基孕酮、苯甲酸雌二醇和醋酸氯地孕酮)的gc-ms檢測辦法。樣品用乙醚提取，然后用法甲醇-水和石油醚舉行液液分配，氮?dú)獯蹈商崛∫汉?，用水和乙醚舉行再次提取，然后用氨基固相萃取柱凈化，再經(jīng)衍生化反應(yīng)后進(jìn)gc-ms分析。8種ass的平均回收率大于70%，批內(nèi)cv為2.7%12%，

8、批間cv為5.9%12%；lod和loq分離為0.941.92g/kg、3.138.03g/kg。賀利民等在堿性條件下用叔丁基甲醚提取肌肉組織及雞蛋中的11種ass，經(jīng)過冷凍離心脫脂凈化后，lc-ms/ms檢測。動物肌肉和雞蛋中睪酮、甲基睪酮、去氫睪酮、美睪酮及康力龍的lod是0.3g/kg，回收率是62.3%105%，rsd為0.5%15%；群勃龍、諾龍、丙酸諾龍、丙酸睪酮、苯丙酸諾龍的回收率大于50%，rsd小于16%。試驗(yàn)比較了甲醇、乙腈、乙酸乙酯和叔丁基甲醚等溶劑或其混合物的提取效果，發(fā)覺叔丁基甲醚的提取回收率高且易于濃縮。saeed等在對肉制品中同化激素殘留水平調(diào)查中，也采納叔丁基甲

9、醚提取，藥物經(jīng)免疫親和柱凈化后，gc-ms檢測分析。6種ass的平均回收率是77%99%。 2)超臨界流體萃取(supercritical fluid extraction，sfe) sfe是跟索氏提取法類似的一項(xiàng)技術(shù)，區(qū)分是提取過程中用法超臨界流體作為溶劑，最常用的超臨界流體是二氧化碳。這項(xiàng)技術(shù)的主要優(yōu)點(diǎn)是高蔓延率、低黏度和較小的表面張力16。stolker等將sfe應(yīng)用于動物組織中醋酸甲地孕酮、醋酸甲羥孕酮、醋酸氯睪酮和醋酸美侖孕酮的檢測。采納為超臨界流體，氧化鋁作為吸附劑來提取待檢測化合物。經(jīng)提取后的激素再舉行堿性酶解和衍生化處理，最后上gc-ms分析。辦法lod可以達(dá)到2g/kg，重復(fù)

10、性為4%42%(n=9)，再現(xiàn)性為2%39%。din等用法sfe技術(shù)提取牛肉中的群勃龍，采納甲醇增強(qiáng)溶解性，并削減基質(zhì)干擾。用含10%甲醇的在400atm、75下提取60min，回收率可達(dá)到98%。 3)加速溶劑萃取(accelerated solvent extraction，ase) ase是利用上升溫度和壓力，增強(qiáng)物質(zhì)溶解度和溶質(zhì)蔓延速度，提高萃取的效率。與傳統(tǒng)提取方式相比，ase速度快、溶劑用量少、萃取效率高、待測組分回收率好，可實(shí)現(xiàn)全自動平安操作。hooijerink等采納ase建立了一種檢測腎脂肪中6種孕激素(醋酸氟羥孕酮、地馬孕酮醋酸酯、醋酸甲地孕酮、氯地孕酮、醋酸美侖孕酮、醋酸

11、甲羥孕酮)的分析辦法。ase裝置中裝有氧化鋁、無水硫酸鈉和腎脂肪，混合后，用乙腈舉行在線提取，再冷凍除去脂肪，c18固相萃取柱凈化，lc-ms/ms舉行檢測。該辦法的cca為0.30.9ng/g，cc小于等于2ng/g，回收率為17%58%。 4)微波輔助萃取(microwave-assisted extraction，mae) mae可加熱攪拌樣品，有助于提高固體樣品的提取效率。同時，mae提取時光短，可用于替代索式提取法，但仍其需要其他的提取與凈化步驟。wang等采納動態(tài)微波輔助提取(dmae)與鹽析液液萃取(slle)相結(jié)合辦法檢測魚組織中9種ass。該辦法提取過程見圖8-3。ass藥物在微波輔助下采納乙腈-水提取，乙腈-醋酸銨溶液中舉行分配，lc-ms/