Agilent1200型高效液相色譜儀操作手冊

1、Agilent 1200 LC（中文版 B01.01）現(xiàn)場培訓(xùn)教材安捷倫科技有限公司 生命科學(xué)與化學(xué)分析儀器部培訓(xùn)目的： 基本了解 1200LC硬件操作。 掌握化學(xué)工作站的開機，關(guān)機，參數(shù)設(shè)定, 學(xué)會數(shù)據(jù)采集, 數(shù)據(jù)分析的基本操作。培訓(xùn)準(zhǔn)備：1、儀器設(shè)備： Agilent 1200LC G1310A :（單元泵） ；G1312A二（ 元泵） ；G1311A四（ 元泵）。 G1313A（標(biāo)準(zhǔn)型自動進樣器）。 G1316A（柱溫箱）。 G1314A（ VWD檢測器）。 G1362A（示差檢測器）。 色譜柱 : Eclipse XDB-C18 150 x 4.6 mm, 5um column P/N

2、 993967-9022、溶劑準(zhǔn)備： 色譜級純或優(yōu)級純乙腈或甲醇。 二次蒸餾水基本操作步驟 :（一）、開機：1、打開計算機,進入中文Windows XP畫面,并運行CAG Bootp Server程序。2 、打開 1200 LC 各模塊電源。3 、待各模塊自檢完成后，雙擊“Instrument 1 Online ”圖標(biāo)，化學(xué)工作站自動與 1200LC 通訊，進入的工作站畫面如下所示。4 、從“視圖”菜單中選擇“方法和運行控制”畫面, 點擊“視圖”菜單中的“顯示頂部工具欄”，“ 顯示 狀態(tài)工具欄”，“系統(tǒng)視圖”, “樣品視圖”，使其命令前有“”標(biāo)志，來調(diào)用所需的界面。5 、把流動相放入溶劑瓶中。

3、6 、打開沖洗閥。7 、點擊“泵”圖標(biāo)，點擊“設(shè)置泵”選項，進入泵編輯畫面。8 、設(shè)流速：5ml/min，點擊“確定”。9 、點擊“泵” 圖標(biāo)，點擊“控制”選項，選中“啟動”，點擊“確定” ，則系統(tǒng)開始沖洗，直到管線 內(nèi)（由溶劑瓶到泵入口）無氣泡為止, 切換通道繼續(xù)沖洗，直到所有要用通道無氣泡為止。10 、點擊“泵” 圖標(biāo)，點擊“控制”選項，選中“關(guān)閉”，點擊“確定”關(guān)泵， 關(guān)閉沖洗閥。11 、點擊“泵”圖標(biāo)，點擊“設(shè)置泵選項”，設(shè)流速：1.0ml/min 。12 、點擊泵下面的瓶圖標(biāo)，如下圖所示（以單元泵為例），輸入溶劑的實際體積和瓶體積。 也可輸入停泵的體積，點擊“確定”二）數(shù)據(jù)采集方法編

4、輯：1 、開始編輯完整方法： 從“方法”菜單中選擇“編輯完整方法” 項，如下圖所示選中除“數(shù)據(jù)分析 ”外的三項， 點擊“確定”，進入下一畫面。2、方法信息： 在“方法注釋”中加入方法的信息（如：測試方法）。 點擊 “確定”， 進入下一畫面。3、泵參數(shù)設(shè)定：（以四元泵為例） 在“流速”處輸入流量,如1ml/min，在“溶劑 B”處輸入80.0,（A=100-B-C-D） ,也可“插入 ” 一行“時間表” , 編輯梯度。在“壓力限”處輸入柱子的最大耐高壓，以保護柱子。 點擊“確定”，進入下一畫面。4、自動進樣器參數(shù)設(shè)定: （以標(biāo)準(zhǔn) G1313為例） 選擇合適的進樣方式, 如圖所示，進樣體積 5.0

5、ul , 洗瓶位置為6 號?！皹?biāo)準(zhǔn)進樣”只能輸入進樣體積，此方式無洗針功能。“洗針進樣” 可以輸入進樣體積和洗瓶位置，此方式針從樣品瓶抽完樣品后，會在洗瓶中洗針?！笆褂眠M樣器程序”- 可以點擊“編輯” 按鈕進行進 樣程序編輯。 點擊進“確定”，進入下一畫面。5、柱溫箱參數(shù)設(shè)定: 在“溫度”下面的空白方框內(nèi)輸入所需溫度, 如：40 度。并選中它,點擊“更多” 鍵, 如圖所示,選中“與左側(cè)相同”，使柱溫箱的溫度左右一致 點擊“確定”，進入下一畫面6、VWD檢測器參數(shù)設(shè)定: 在“波長”下方的空白處輸入所需的檢測波長,如254nm, 在“峰寬 ( 響應(yīng)時間)”下方點擊下拉 式箭頭, 選擇合適的響應(yīng)時間

6、, 如0.1min (2s) 。 在“時間表” 中可以“插入”一行，輸入隨時間切換的波長，如 1min ，波長=300nm。點擊“確 定”，進入下一畫面。7、RID檢測器參數(shù)設(shè)定: 色譜條件:進樣體積: 20ul 。光學(xué)單元溫度: “關(guān)閉” 。極性: “正極性” 。峰寬（響應(yīng)時間） : 4s 。 如圖所示: “光學(xué)部件溫度” - 若環(huán)境溫度控制在±2 , 設(shè)定為“關(guān)閉”, 若環(huán)境溫度不穩(wěn)定, 則設(shè)定 光學(xué)單元溫度為高于環(huán)境溫度5度,以防樣品在池中沉淀?！胺鍖?（響應(yīng)時間） ”- 大多數(shù)分析設(shè)為“ 4s” ， 只有在高速分析下設(shè)為更短?！胺治龊笞詣友h(huán)”- 在不進行分析時可以讓流動相循

7、環(huán)，節(jié)省流動相，檢測 器連續(xù)運行，可隨時投入使用。 * 點擊 RID圖標(biāo)，選擇 RID Control ：Heater 設(shè)為 On，若要循環(huán)流動相，必須將“ Recycling Valve” 設(shè)為ON。手動purge 參比池，將其設(shè)為On，并輸入Purge 時間。8、在“ 運行時選項表 ”中選中“ 數(shù)據(jù)采集”，點擊“確定”9、點擊“方法”菜單，選中“方法另存為”，輸入一方法名，如“測試”，點擊“確定”10、從菜單 “視圖”中選中“在線信號”,選中“信號窗口1”,然后點擊“改變” 鈕,將所要繪圖的信號移到右邊的框中, 點擊“確定”。（如同時檢測二個信號,則重復(fù) 10,選中“信號窗口 2”。單擊“

8、改變鍵，即可彈出右側(cè)的編輯信號圖譜 ”窗口，進而選擇所需的譜圖信號。11、從“運行控制”菜單中選擇“樣品信息”選項，如下圖所示，輸入操作者名稱，如“安 裝工程師”；在“數(shù)據(jù)文件 ”中選擇“手動”或“前綴/ 計數(shù)器”。區(qū)別:手動-每次做樣之前必須給出新名字,否則儀器會將上次的數(shù)據(jù)覆蓋掉。 Pr 在前綴/ 計數(shù)器 “前綴”框中輸入前綴，在“計數(shù)器”框中輸入計數(shù)器的起始位，儀器會自動命名，如vwd數(shù)據(jù) 0001，vwd數(shù)據(jù) 0002。12、 點擊“確定” , 從“儀器” 菜單選擇“系統(tǒng)開啟”。13、 等儀器準(zhǔn)備好，基線平穩(wěn)，從“運行控制”菜單中選擇“運行方法”，進樣。（ 若無自 動進樣器，則基線平穩(wěn)

9、后，進樣并搬動手動進樣閥，啟動運行。）（DAD, VW色D 譜圖如下所示：）3、 做譜圖優(yōu)化： 從“圖形”菜單中選擇“信號選項”，如下圖所示。從“范圍” 中選擇“滿量 程” 或“自動量程” 及合適的時間范圍或選擇“自定義量程” 調(diào)整。反復(fù)進行，直到圖的 比例合適為止。點擊“ 確定”。三）、數(shù)據(jù)分析方法編輯:1、 從“視圖”菜單中，點擊“數(shù)據(jù)分析”進入數(shù)據(jù)分析畫面。2、從“文件”菜單選擇“調(diào)用信號”，選中您的數(shù)據(jù)文件名，如下圖所示。點擊“ 確 定”，則數(shù)據(jù)被調(diào)出。4、積分: 從“積分”菜單中選擇“積分事件”選項，如下圖所示。選擇合適的“斜率靈敏度” ，“峰寬”，“最小峰面積”，“最小峰高”。 從

10、“積分”菜單中選擇“積分”選項， 則數(shù)據(jù)被積分。 如積分結(jié)果不理想，則修改相應(yīng)的積分參數(shù)，直到滿意為止。 點擊左邊“”圖標(biāo)，將積分參數(shù)存入方法。5、打印報告: 從“報告”菜單中選擇“設(shè)定報告”選項，進入如下圖所示畫面。 點擊“定量結(jié)果”框中“計算”右側(cè)的黑三角，選中“面積百分比”，其它選項不變 點擊“ 確定” 從“報告”菜單中選擇“打印報告”，則報告結(jié)果將打印到屏幕上，如想輸出到打印機上， 則點擊“報告” 底部的“打印”鈕。（四） 、關(guān)機: 關(guān)機前，先關(guān)燈，用相應(yīng)的溶劑充分沖洗系統(tǒng)。 退出化學(xué)工作站，依提示關(guān)泵，及其它窗口，關(guān)閉計算機 關(guān)閉Agilent 1200 各模塊電源開關(guān)。（五） 、A

11、gilent 1200 LC 維護保養(yǎng)：1、色譜柱長時間不用，存放時，柱內(nèi)應(yīng)充滿溶劑，兩端封死（如乙腈/ 甲醇適于反相色譜柱，正相色 譜柱用相應(yīng)的有機相）。2、手動進樣器，當(dāng)使用緩沖溶液時，要用水沖洗進樣口。3、流動相使用前必須過濾，不要使用多日存放的蒸餾水（易長菌。）4、帶seal-wash的 1200，要配制90%水+10%異丙醇，開啟seal-wash 清洗泵，溶劑不能干涸。5、注意事項見說明書，或由現(xiàn)場工程師介紹。* 注意：1、 本教材僅適用于現(xiàn)場工程師培訓(xùn)講解參考之用，內(nèi)容為工作站 現(xiàn)場培訓(xùn)的一般要求，請根據(jù)用戶的儀器配置及現(xiàn)場用戶的需 求進行相應(yīng)的培訓(xùn)內(nèi)容增刪。2、 安捷倫公司對本

12、教材可能存在的錯誤及其后果不承擔(dān)任何法律 責(zé)任，我們適時推出新版本的培訓(xùn)教材，恕不另行通知。維護知識問答1、 為什么溶劑和樣品要過濾? 溶劑和樣品過濾非常重要，它會對色譜柱、儀器起到保護作用，消除由于污染對分析結(jié)果的影響。 色譜柱：由于填料顆粒很細，色譜柱內(nèi)腔很小，溶劑和樣品中的細小顆粒會使色譜柱和毛細管容易堵塞。 儀器：溶劑和樣品中的細小顆粒會增加進樣閥的堵塞和磨損，同時也會增加泵頭內(nèi)的藍寶石活塞桿和活塞的 磨損。2、 為什么 HPLC用緩沖鹽時要加在線Seal-wash選項？HPLC 用緩沖鹽時, 由于泵頭內(nèi)的緩沖鹽溶液存在高壓析鹽現(xiàn)象, 析出的細小鹽粒非常堅硬, 它附著在藍寶 石活塞桿上

13、,隨著藍寶石活塞桿的往復(fù)運動 ,容易產(chǎn)生劃痕 ,并磨損密封墊,造成漏液等故障現(xiàn)象。在線 Seal-wash選項能有效的帶走可能存在的緩沖鹽結(jié)晶。緩沖鹽的濃度在0.1mol或大于0.1mol時, 必須使用該 在線沖洗選項.清洗液配制: 90%水+10%異丙醇. 該混合液可抑制菌類生長和減小水的表面張力，不能干涸。3、為什么Agilent 1200LC 的流動相管路非常細?在使用 HPLC時, 應(yīng)特別注意”柱外效應(yīng)”對分析結(jié)果的影響，由于樣品分子在液體流動相中的擴散系數(shù) 比在氣體中小 45個數(shù)量級，液體流動相的流速也比氣相慢1-2 個數(shù)量級。因此，樣品進入色譜柱后，在柱 子以外的任何死體積（進樣器

14、、柱接頭、連接管、檢測器）中，樣品分子的擴散和滯留，都會引起色譜峰的 展寬，而使柱效降低 。為使柱外效應(yīng)減之最小，獲得理想的分析結(jié)果，Agilent 1200LC 使用加工工藝難度 高的毛細管線作為流動相管路。毛細管線分類：0.17mm內(nèi)徑 綠色 ;0.12mm內(nèi)徑 紅色。PEEK 管線：內(nèi)徑 0.13mm;0.18mm;0.25mm;0.5m。m毛細管線優(yōu)點: 柔韌性好.*Agilent 公司同時備有1/16in 的粗外徑毛細管線,適用于不同習(xí)慣的用戶 , 優(yōu)點是剛性好,但柔韌性差一 些。4、流動相使用前為什么要脫氣？ 流動相使用前必須進行脫氣處理，以除去其中溶解的氣體（如O2），以防止在洗

15、脫過程中當(dāng)流動相 由色譜柱流至檢測器時，因壓力降低而產(chǎn)生氣泡。氣泡會增加基線的噪音，造成靈敏度下降，甚至無法 分析。溶解的氧氣還會導(dǎo)致樣品中某些組份被氧化，柱中固定相發(fā)生降解而改變柱的分離性能。若用 FLD， 可能會造成熒光猝滅。常用的脫氣方法比較： 氦氣脫氣法：利用液體中氦氣的溶解度比空氣低，連續(xù)吹氦脫氣，效果較好，但成本高。 加熱回流法：效果較好，但操作復(fù)雜，且有毒性揮發(fā)污染。抽真空脫氣法：易抽走有機相。 超聲脫氣法：流動相放在超聲波容器中，用超聲波振蕩10- 15min，此法效果最差。 在線真空脫氣法：Agilent1200LC真空脫機利用膜滲透技術(shù)，在線脫氣，智能控制，無需額外操作，成

16、 本低，脫氣效果明顯優(yōu)于以上幾種方法，并適用于多元溶劑體系。5、如何防止溶劑瓶內(nèi)溶劑過濾器的堵塞，以及堵塞后的處理？ 溶劑的質(zhì)量或污染以及藻類的生長會堵塞溶劑過濾器，從而影響泵的運行，尤其水溶液或磷酸鹽緩 沖液（PH=47）。以下幾種方法可以有效防止溶劑瓶內(nèi)溶劑過濾器的堵塞。A：請嚴(yán)格執(zhí)行溶劑過濾。B：請勿使用多日存放的蒸餾水及磷酸鹽緩沖液C：如果應(yīng)用許可，可在溶劑中加入0.0001-0.001M 的疊氮化鈉.D:在溶劑瓶內(nèi)溶劑的上方小流量連續(xù)吹氬氣, 以隔絕空氣。 E：避免使溶劑瓶暴露在直射陽光下，盡量使用琥珀色的溶劑瓶盛放水溶液或磷酸鹽緩沖液。6、Agilent 1200LC 泵如何維護？

17、Agilent 1200LC 泵給色譜柱提供穩(wěn)定、無脈動、流量準(zhǔn)確的流動相，及時合理的維護非常重要。A：流動相使用前請必須脫氣、過濾。B：使用緩沖鹽時，要加在線Seal-wash選項。C：關(guān)機前，用相應(yīng)的溶劑充分沖洗系統(tǒng)。D：及時更換 Purge Valve 內(nèi)的過濾芯。（當(dāng)打開 Purge Valve 時，壓力高于 10bar，表明過濾芯已堵）。 E ：使用合適的密封圈。7、如何選擇合適的泵頭活塞密封圈？泵頭活塞的標(biāo)準(zhǔn)密封圈能適合于大多數(shù)應(yīng)用，但使用正相溶劑（如正己烷），不適合使用標(biāo)準(zhǔn)活塞密封圈， 特別是長時間使用時，需更換另一種不同的密封圈，我們建議使用聚四氟乙烯密封圈。（p/n0905-

18、1420 2/pk ） * 注意：聚四氟乙烯密封圈的壓力范圍為：0200bar；建議在泵的壓力限制中，將最大壓力設(shè)為200bar。8、使用梯度比例發(fā)時要注意那些事項？當(dāng)鹽溶液與有機溶劑溶液混合時，鹽溶液能與有機溶劑溶液完全混溶，而不會出現(xiàn)沉淀。但是在比例閥 的混合點，重力作用使鹽顆粒沉淀下來，通常，閥A接水相/ 鹽溶液，D接有機溶劑，此法連接可有效使鹽回 落到鹽溶液中，并被溶解。若顛倒過來，鹽可能落在有機溶劑中，出現(xiàn)問題。 強烈建議：當(dāng)使用緩沖鹽溶液和有機溶劑時，推薦將緩沖鹽通道接在A通道上，有機溶劑通道直接接在A通 道的上方D通道上；定期用水沖洗所有的通道，以除去閥口上可能出現(xiàn)的鹽沉淀。9、更換色譜柱時要注意什么事項?在使用 HPLC時, 應(yīng)特別注意”柱外效應(yīng)”對分析結(jié)果的影響，由于樣品分子在液體流動相中的擴散系數(shù) 比在氣體中小 45個數(shù)量級，液體流動相的流速也比氣相慢1-2 個數(shù)量級。因此，樣品