M2巨噬細(xì)胞源性外泌體促進(jìn)血管內(nèi)支架植入后血管組織修復(fù)過程中血管平滑肌細(xì)胞的c-KIT表型

1、M2巨噬細(xì)胞源性外泌體促進(jìn)血管內(nèi)支架植入后血管組織修復(fù)過程中血管平滑肌細(xì)胞的KIT表型導(dǎo)讀對丁-成功的血管內(nèi)支架植入，血管組織的修復(fù)和治療過程至關(guān)重要的。在血管組織修復(fù)過程中， 巨噬細(xì)胞對血管平滑肌細(xì)胞（VSMCs ）具有重要的命運調(diào)控作用，己證實Ml巨噬細(xì)胞來源的外泌體加 重 了新生內(nèi)膜增生，但H2巨噬細(xì)胞外泌體對VSMCs的作用機制仍未明確。本研究發(fā)現(xiàn)血巨噬細(xì)胞衍生的 外泌體（M2Es）介導(dǎo)VSMCs細(xì)胞間相互作用并誘導(dǎo)去分化表型。M2Es通過激活c-Jun/激活蛋白1 （AP-1 ）信 號通路來上調(diào)VSMCs c-KIT表達(dá)促進(jìn)c-KIT表達(dá)和附近VSMCs的軟化，加速血管組織修 復(fù)過程

2、。強調(diào)了 M2E通過激活c-Jun / AP-1 fd號通路在VSMC去分化和血管組織修復(fù)中的重要作用，對冠狀動脈支架技術(shù) 的治療策略具有深遠(yuǎn)的影響。結(jié)果1血管內(nèi)支架植入后，M2巨噬細(xì)胞與c-KIT + VSMCs相鄰?fù)ㄟ^將316L裸金屬支架（BMS）從左動脈植入SD大鼠的腹上動脈，鑒定c-KIT + VSMCs在支架 植入 部位的存在和位品。免疫熒光圖像顯示支架植入后第7天，新內(nèi)膜中有大雖SM22Q+細(xì)胞表達(dá)c-KITo支架 晝?nèi)牒蟮?8天，在支架支桿周圍發(fā)現(xiàn)很少的c-KIT- rSM22 a +細(xì)胞，而在新內(nèi)膜的支架絲周圉發(fā)現(xiàn)了大 雖的c-KIT和SM22 a雙陽性細(xì)胞，且內(nèi)膜SM22 a

3、 +細(xì)胞中的c-KIT和SM22 a雙陽性 細(xì)胞在支架且入后7 天和28天分別從13. 61%顯著增加至63. 78%。為分析修復(fù)區(qū)域與c-KIT +細(xì)胞 之間的關(guān)系，研究者沿著 支架血管的近端直至遠(yuǎn)端檢測c-KIT +細(xì)胞的分布（圖1A）。通過表而染色，發(fā)現(xiàn)位丁 -支架血骨遠(yuǎn)端 的支架支柱周圍有6. /磁的C-KIT+細(xì)胞（圖1B和1D）,而在支架血管的近 端和中間部位，c-KIT +細(xì)胞 占比分別為不到戰(zhàn)和1. 79購接卜來，研究者對腹上動脈支架內(nèi)的CD6s進(jìn)行表面染色，以進(jìn)一步研究 巨噬細(xì)胞的出現(xiàn)和定位是否與c-KIT + VSMCs同步。支架植入后第7天，在支架植入節(jié)段的遠(yuǎn)端發(fā)現(xiàn)了 C

4、D68+細(xì)胞，而正常腹上動脈中CD68陽性細(xì)胞較少（圖1C）。在支架植入血管的遠(yuǎn)端發(fā)現(xiàn)每平方電米有 近60個CD68陽性細(xì)胞（圖1E） 口通過免疫組織化學(xué)的方法在植入支架的血管遠(yuǎn)端檢測到MAC-2 （總巨 噬細(xì)胞的標(biāo)記）和YM-1 （血巨噬細(xì)胞的標(biāo)記。在新內(nèi)膜支 架周圍發(fā)現(xiàn)了 MAC-2 +細(xì)胞和YM-1 +細(xì)胞。 且在支架置入后7天和28天,YM-1 +細(xì)胞可進(jìn)一步深入 到正在發(fā)育的新內(nèi)膜并與VSMCs相鄰。支架植入 后7天和28 7 ；，正在發(fā)育的新內(nèi)膜中MAC-2 +細(xì)胞分別為8. 77 + 0. 64%和2. 23 + 0. 20% ； YMT +細(xì)胞 分別為7. 32±0.

5、45%和1. 43±0. 14%。這些發(fā)現(xiàn)表明，M2巨噬細(xì)胞町能是c-KIT +細(xì)胞參與支架植入后損 傷應(yīng)答的笑鍵調(diào)節(jié)劑。圖c-KIT +和CD6S +細(xì)胞在帶支架的大鼠腹主劫脈血管的分布2巨噬細(xì)胞通過胞外囊泡與VSMCs交流研究者卜一步建立了 Trans拓”1共培養(yǎng)系統(tǒng)，以探索巨噬細(xì)胞是否可以增強VSMCs的祖細(xì)胞形 成。將帶有熒光染料的初始巨噬細(xì)胞（MO）、LPS +IFN-Y刺激的巨噬細(xì)胞（Ml）和ILT + IL-13刺激的 巨噬細(xì)胞（M2）與經(jīng)DIO染色的A7R5共培養(yǎng)24小時。與各種巨噬細(xì)胞共培養(yǎng)后,A7R5細(xì)胞的形態(tài) 從長紡 錘形轉(zhuǎn)變?yōu)槎噙呅?。A7R5 VSMCs中紅色

6、熒光DH染料的出現(xiàn)表明經(jīng)DI I著色的細(xì)胞膜從Transwell上部的 巨噬細(xì)胞傳遞到接種在卞部孔的受體VSMCs中。與H（）和Ml巨噬細(xì)胞胞外猱泡（EVs ）相比，VSMCs傾 向于從M2巨噬細(xì)胞吸收更多的EVs。但只有與M2巨噬細(xì)胞共培養(yǎng)的大鼠上動脈平滑 肌細(xì)胞（RASMCs） 才表現(xiàn)出DII染色的細(xì)胞膜明顯聚集。A7R5的立體坐標(biāo)視圖確認(rèn)了來門M2巨噬紐I胞的EVs己被整合 到細(xì)胞中。3 M2巨噬細(xì)胞上調(diào)c-KIT的表達(dá)并降低VSMCs的細(xì)胞硬度通過免疫染色檢測干細(xì)胞標(biāo)志物c-KIT之后，在共培養(yǎng)模型中發(fā)現(xiàn)卜-室VSMCs的c-KIT上調(diào)（圖 3A）。同時利用蛋白質(zhì)印跡分析VSMCs與巨

7、噬細(xì)胞共培養(yǎng)后其c-KIT, a ”SMA和SE22 a蛋白水平，結(jié)果 顯示與M2巨噬細(xì)胞共培養(yǎng)的RASMCs中c-KIT表達(dá)上調(diào)，但a -SMA和SM-22 a表達(dá)水平卜調(diào)。此 外，與 M0和Ml巨噬細(xì)胞EVs處理組相比，吸收M2巨噬細(xì)胞EVs的VSMCs具有F-肌動蛋白骨架解聚 作用（圖 2C）。硬度變化可以間接反映VSMCs的去分化。研究者利用膠體探針原子力顯微鏡（AFM）來驗證巨噬細(xì) 胞是否可以調(diào)節(jié)VSMCs的碩度。首先利用巨噬細(xì)胞條件培養(yǎng)基（M2巨噬細(xì)胞上清液：DMEM=1 ： 9或 通ii Transwell共培養(yǎng)刺激RASMCs,當(dāng)球形和RASMC接近時的力曲線表明，在M2巨噬細(xì)

8、胞刺激卜，RASMCs 力曲線的斜率較?。▓D2D） , 丁 PK軟件分析顯示，在條件培養(yǎng)基刺激或與M2巨噬細(xì)胞共培養(yǎng) 后,RASMCs的硬度顯著降低（圖2E）。用10 MM GW4869 （一種外泌體生物發(fā)生/釋放抑制劑）預(yù)處理THP-1巨噬細(xì)胞，而后進(jìn)行了 IL-4 + IL-13刺激。發(fā)現(xiàn)當(dāng)GW4869抑制巨噬細(xì)胞分泌外泌體后，與H2巨 噬細(xì)胞共培養(yǎng)的VSMCs的c-KIT表達(dá)并沒有上調(diào)。在mRNA水平上，外泌體抑 制后，c-Kit. SJI22Q和a- SMA的表達(dá)恢復(fù)到對照組水平。這些實驗表明，M2巨噬細(xì)胞源性外泌體町 上調(diào)經(jīng)刺激M2巨噬細(xì)胞后 VSMCs中c-KIT的表達(dá)。B OAP

9、./CK.W.M2TMerge EnlargednoC DAPIF-Act inDllNCMOT7006005004003002001000-100o003OSSVM.d J。(ed) snsPOUJ sCDunoAE004000 20o00-1.5 -1-0.5 0 0.5 1 1.5 2 Vertical Tip Position (pm)圖2. M2 噬細(xì)胞上調(diào)c-KIT的表達(dá)并破壞肌動蛋口骨架.降低VSMCs的細(xì)胞皺度4. M2巨噬細(xì)胞分泌的外泌體促進(jìn)VSMCs去分化,進(jìn)而促進(jìn)血管修復(fù)透射電子顯微鏡（TEM）（圖3A）和納米粒子跟蹤分析（NTA）（圖3C顯示，M2巨噬細(xì)胞上清液中 提取

10、的外泌體直徑約為10（） nmo為證實VSMCs可直接喬噬外泌體，將標(biāo)記有17nm金納米顆粒的外泌體與 RASMCs孵育12小時。17mn金納米顆粒標(biāo)記的掩泡被VSMCs fF沒，并可以通過TEH檢測到（圖3B） o任休外，隨時間進(jìn)行VSMCs吸收更多經(jīng)DID染色的M2Es。同時,VSMCs的F-肌動蛋白絲 被解聚 并重新排列（圖3D） °處理24小時后，M2Es內(nèi)化的VSMCs的3D圖像顯示F-肌動蛋白的解聚發(fā)生在DID染 色的M2Es周圍（圖3E）。時間動態(tài)檢測顯示，在24小時后DID染色的M2Es吸收達(dá)到 最大值（圖3F）。 VSMCs與純化的M2Es共培養(yǎng)，以闡明M2Es是否

11、在VSMCs中誘導(dǎo)祖細(xì)胞的增強和碩 度變化。與對照組相 比,與M2Es共培養(yǎng)的RASMCs明顯比正常RASMCs更軟。T ./ + / ，/ too Diameter (nm)F-Actin£3lo<q< JaqEnN/15E*63E，82E-81E*81000 -joM2E/ /i；Ya/VJ1001000Diamotor (nm) Merge Enlarged12 h-EnlargedDAPI/ /DIDM2E6 4 2 0 soss'XCUJCNZPaAP QQ F J。Mlsusu- aoueosaonE圖3,外泌體介& M2巨噬細(xì)胞和VSMCs

12、Z間的細(xì)胞交漩未經(jīng)處理和經(jīng)M2Es處理的RASMCs楊氏模量分別為130S + 49. 91 Pa和232. 3 +14. 76 Pa （圖4A和 4B） o暴露于M2Es之后,VSMCs也會逐漸變?yōu)榍蛐?。長軸與短軸的比率從5. 620±（）. 3676降低到2. 161 + 0. 1652- P3-RASHCS的F-肌動蛋白骨架經(jīng)H2Es處理后被破壞（圖4C）。接卜來，研究者假 設(shè)M2Es可 能在蛋白質(zhì)水平上引起VSMCs去分化'用M2Es處理24小時后，VSMCs具有高水平的c«KIT表達(dá)，且VSMCs 中SM22U的絲狀結(jié)構(gòu)不再存在（圖4D）。通過蛋白質(zhì)印跡法

13、檢查了未處理和H2E刺 激的RASMCs中c-KIT, SM22O和a-SMA的蛋白水平。結(jié)果表明» M2Es刺激組c-KIT表達(dá)高度上調(diào)，SM22 a和a -SMA被卜調(diào)（圖4E和4F）。M2Es刺激或與M2巨噬細(xì)胞共培養(yǎng)后，RASMCs中SM22 a和a -SMA的表達(dá)顯著降低，而干 細(xì)胞標(biāo)志物c-Ki t顯著增加。未檢測到其他兩個標(biāo)記Sea-1和Oct-4 （圖4G）。這些數(shù)據(jù)強烈表明M2Es 對RASHCs公分化至關(guān)重要。C DAPI5Vertical Tip Position (pm)NC ExosomeF-ActinMergeDAPIc-KIISM22aMergeEnla

14、rged view圖1. M2 i噬細(xì)胞分泌的外泌體降低r SMCs的硬嗖并促進(jìn)SMCs £分化研究者假設(shè)任大鼠模型中腹上動脈支架植入后，M2Es町以增強VSMCs的血管修復(fù)能力。形態(tài)計雖分 析發(fā)現(xiàn)與對照組相比，在7天和28天時用M2Es處理的支架血管的新內(nèi)膜面積有所增加,但在7天和28 天時，新內(nèi)膜厚度和新內(nèi)膜與內(nèi)膜的比率無明顯差異。在第7天，與對照組相比，M2Es處理的支架血 管狹窄百分比顯著增加。此外，在7滅和28天時總血管而積和內(nèi)側(cè)而積無顯著差異。與PBS處理相 比，M2Es處理的大鼠在28天時在新內(nèi)膜中包含更多的MAC-2巨噬細(xì)胞，并在7天和28天時具有更高的 YH-1 +

15、巨噬細(xì)胞。這些數(shù)據(jù)表明M2Es導(dǎo)致支架血管內(nèi)的炎癥細(xì)胞表型改變。經(jīng)H2Es處理大鼠的新內(nèi)膜 病變在7滅和28天時含有更多的c-KIT和SM22a雙陽性細(xì)胞（圖5A-C。與PBS處 理相比，H2Es處理的 大鼠在第7天和28天時新內(nèi)膜中含有更多的c-KIT +和SM22 a ,從而降低了內(nèi)膜中的SMCs （圖5D）。 但對培養(yǎng)基中的細(xì)胞進(jìn)行定雖，未觀察到細(xì)胞公分化的差異。免疫組織化學(xué)顯示，與PBS處理組相 比,H2Es處理組新內(nèi)膜中發(fā)現(xiàn)的IWA +細(xì)胞更多。00zADAPISM22ac-KITMergew o e N £ss <u o a N£ 更 o。EQS Epu。

16、1，詛SQU圖5. M2Es在大鼠腹主動脈支架植入模型中促進(jìn)VSMC去分 化5 AP-1的增加介導(dǎo)RASMCs的去分化研究者通過RNA-seq比較RASMCs和與M2巨噬細(xì)胞共培養(yǎng)的RASMCs基因表達(dá)譜，以進(jìn)一步表征與H2 巨噬細(xì)胞共培養(yǎng)的RASMCs。KEGG富集分析顯示與此相關(guān)的途徑是MAPK信號傳導(dǎo)、內(nèi)喬作用、粘著斑、細(xì) 胞衰老、流體切應(yīng)力、動脈粥樣硬化和門噬?；?-這些發(fā)現(xiàn)，推測MAPK途徑在VSMCs分化過程中起重 要作用。與M2巨噬細(xì)胞共培養(yǎng)的RASMCs中上調(diào)的基因與已知的干細(xì)胞特征相關(guān)（Kitlg. Cd44, Soxl7, Klf4. Xkx-5, F1M和Rexol ）

17、（圖6A）。此外，SHC特征性基因在與H2巨噬細(xì)胞共培養(yǎng)的RASMCs中被 卜調(diào)（圖6A）。盡管RNA-seq并未檢測到與M2巨噬細(xì)胞共培養(yǎng)的RASMCs中c-Ki t的水平變化，但qRT-PCR 確實發(fā)現(xiàn)經(jīng)M2Es處理的RASMCs中c-Ki t有所增加（圖9B）。生 物信息學(xué)分析顯示，在與M2巨噬細(xì)胞共 培養(yǎng)的 RASMCs 中 » MAPK / AP-1 途徑基因（Sosl. Sos2. Rras2, Kras» Xras» Rras, Braf» Map2kl» Rps6kal» Rps6ka2» Fos和Fos 1

18、1）的表達(dá)顯著增加，表明AP1活性增加。且AP-1活性增加町能是M2Es誘導(dǎo)的RASMCs 公分化的原因。qRPCR證實Fos 11和其他AP-1依賴性基因在吸收M2Es的RASMCs中高表達(dá)（圖6B）。M2Es 處理的大鼠在7天和2S天與PBS處理組相比，新內(nèi)膜中高表達(dá)APT （圖6C）（，研究者進(jìn)一步使用T-5224 （AP1的特異性抑制劑）探 究AP-1是否在VSMCs去分化過程中發(fā)揮功能性作用。qRT-PCR證實5224任 M2Es處理的RASMCs中有效抑制AP-1活性（圖6Do在存在M2Es和T-5224 （ 10 UM）的條件下培養(yǎng)24小時 后,RASMCs中的MAPK / AP-1通路基因和干細(xì)胞相關(guān)特征性基因被卜調(diào)，而SMC