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文檔簡(jiǎn)介
1、實(shí)時(shí)熒光定量原理t aqman 探針簡(jiǎn)介實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)原理與應(yīng)用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)可對(duì)特定核甘酸片斷進(jìn)行指數(shù)級(jí)的擴(kuò)增。在擴(kuò)增反 應(yīng)結(jié)束之后,我們可以通過凝膠電泳的方法對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行定性的分析,也 可以通過 放射性核素?fù)饺霕?biāo)記后的光密度掃描來進(jìn)行定量的分析。無(wú)論定性還是定量分析,分析的都是 PCR終產(chǎn)物。但是在許多情況下,我們所感興 趣的是未經(jīng)PCR信號(hào)放大之前的起始模板量。例如我們想知道某一轉(zhuǎn)基因動(dòng) 植物轉(zhuǎn)基因的拷貝數(shù)或者某一特定基因在特定組織中的表達(dá)量。在這種需求下熒光定量PCR技術(shù)應(yīng)運(yùn)而生。所謂的實(shí)時(shí)熒光定量 PCR就是 通過對(duì)PCR 擴(kuò)增反應(yīng)中每一個(gè)循環(huán)產(chǎn)物熒光信號(hào)的實(shí)時(shí)檢
2、測(cè)從而實(shí)現(xiàn)對(duì)起始模板定量及 定性的分析。在實(shí)時(shí)熒光定量 PCR反應(yīng)中,引入了一種熒光化學(xué)物質(zhì),隨著 PCR反應(yīng)的進(jìn)行,PCR反應(yīng)產(chǎn)物不斷累計(jì),熒光信號(hào)強(qiáng)度也等比例增加。每 經(jīng)過一個(gè)循環(huán),收集一個(gè)熒光強(qiáng)度信號(hào),這樣我們就可以通過熒光強(qiáng)度變化 監(jiān)測(cè)產(chǎn)物量的變化,從而得到一條熒光擴(kuò)增曲線圖(如圖1)。Ww睡 bio &n :c dhu圖1實(shí)時(shí)熒光擴(kuò)增曲線圖F I I 1 J I T F I B 1 I T .f I T 1 I 11 ,一M 百 www.bioon.onrt«一般而言,熒光擴(kuò)增曲線擴(kuò)增曲線可以分成三個(gè)階段:熒光背景信號(hào)階段,熒光信號(hào)指數(shù)擴(kuò)增階段和平臺(tái)期。在熒光背景信
3、號(hào)階段,擴(kuò)增的熒光信號(hào)被 熒光背景信號(hào)所掩蓋,我們無(wú)法判斷產(chǎn)物量的變化。而在平臺(tái)期,擴(kuò)增產(chǎn)物 已不再呈指數(shù)級(jí)的增加。PCR的終產(chǎn)物量與起始模板量之間沒有線性關(guān)系, 所以根據(jù)最終的PCR產(chǎn)物量不能計(jì)算出起始DNA拷貝數(shù)。只有在熒光信號(hào) 指數(shù)擴(kuò)增階段,PCR產(chǎn)物量的對(duì)數(shù)值與起始模板量之間存在線性關(guān)系,我們 可以選擇在這個(gè)階段進(jìn)行定量分析。為了定量和比較的方便,在實(shí)時(shí)熒光定 量PCR技術(shù)中引入了兩個(gè)非常重要的概念:熒光閾值和CT值。熒光閾值是在熒光擴(kuò)增曲線上人為設(shè)定的一個(gè)值,它可以設(shè)定在熒光信號(hào)指數(shù)擴(kuò)增階段 任意位置上,但一般我們將熒光域值的缺省設(shè)置是3-15個(gè)循環(huán)的熒光信號(hào)的標(biāo)準(zhǔn)偏差的10倍。每個(gè)
4、反應(yīng)管內(nèi)的熒光信號(hào)到達(dá)設(shè)定的域值時(shí)所經(jīng)歷的 循環(huán)數(shù)被稱為CT值(threshold value )(如圖2所示)。圖2.熒光定量標(biāo)準(zhǔn)曲線兩嗨k- Shw EdhoLscf mis .CT值與起始模板的關(guān)系研究表明,每個(gè)模板的 CT值與該模板的起始拷貝數(shù)的對(duì)數(shù)存在線性關(guān)系,起始拷貝數(shù)越多,CT值越小。利用已知起始拷貝數(shù)的標(biāo)準(zhǔn)品可作出標(biāo)準(zhǔn)曲線,其中橫坐標(biāo)代表起始拷貝數(shù)的對(duì)數(shù),縱坐標(biāo)代表Ct值(如圖3所示)。因此,只要獲得未知樣品的 Ct值,即可從標(biāo)準(zhǔn)曲線上計(jì)算出該樣品的起始拷貝數(shù)。圖3閾值線和CT值熒光探針和熒光染料實(shí)時(shí)熒光定量PCR的化學(xué)原理包括探針類和非探針類兩種,探針類是利用與靶序列特異雜交
5、的探針來指示擴(kuò)增產(chǎn)物的增加,非探針類則是利用熒光染料或者特殊設(shè)計(jì)的引物來指示擴(kuò)增的增加。前者由于增加了探針的識(shí)別步驟,特異性更高,但后者則簡(jiǎn)便易行。TaqMan探針Polymer i z a I i o n C o m p I e! e(JTaqMan探針是多人擁有的專利技術(shù)。TaqMan探針是一種寡核甘酸探針,它的熒光與目的序列的擴(kuò)增相關(guān)。它設(shè)計(jì)為與目標(biāo)序列上游引物和下游引物之間的序列配對(duì)。熒光基團(tuán)連接在探針的 5'末端,而淬滅劑則在3'末端。當(dāng)完整的探針與目標(biāo)序列配對(duì)時(shí),熒光基團(tuán)發(fā)射的熒光因與3'端的淬滅劑接近而被淬滅。但在進(jìn)行延伸反應(yīng)時(shí),聚合酶的5'外切酶活性將探針進(jìn)行酶切,使得熒光基團(tuán)與淬滅劑分離。TaqMan探針適合于各種耐熱的聚合酶,如 DyNAz
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