分子診斷技術(shù)平臺(tái)的進(jìn)展及展望

1、分子診斷技術(shù)平臺(tái)的進(jìn)展及展望分子診斷技術(shù)平臺(tái)的進(jìn)展及展望內(nèi)內(nèi) 容容 病原體檢測(cè)技術(shù)概述病原體檢測(cè)技術(shù)概述 病原體核酸檢測(cè)技術(shù)概述病原體核酸檢測(cè)技術(shù)概述 病原體核酸檢測(cè)新技術(shù)應(yīng)用病原體核酸檢測(cè)新技術(shù)應(yīng)用 核酸檢測(cè)新技術(shù)存在問(wèn)題及發(fā)展核酸檢測(cè)新技術(shù)存在問(wèn)題及發(fā)展治治 療療 近近1010年新發(fā)傳染病絕大多數(shù)是病毒引起年新發(fā)傳染病絕大多數(shù)是病毒引起病毒與亞病毒6819種408屬動(dòng)物病毒1917種204屬感染人296種37屬背景背景背景檢測(cè)技術(shù)概述 形態(tài)學(xué)（電鏡）形態(tài)學(xué)（電鏡） 組織學(xué)（細(xì)胞培養(yǎng)）組織學(xué)（細(xì)胞培養(yǎng)） 免疫學(xué)（免疫學(xué)（ELISA,Western Blot,ELISA,Western Blo

2、t, IF,NT,HI IF,NT,HI） 分子生物學(xué)（分子生物學(xué)（PCR,RT-PCR,qPCR,mPCR,PCR,RT-PCR,qPCR,mPCR, Microarray,Sequencing Microarray,Sequencing） 傳統(tǒng)檢測(cè)方法的局限性傳統(tǒng)檢測(cè)方法的局限性 膠體金膠體金 （靈敏度（靈敏度 窗口期）窗口期） ELISA ELISA （靈敏度（靈敏度 窗口期）窗口期） PCR/RT-PCR PCR/RT-PCR （通量（通量 未知病原）未知病原） Real-time PCR Real-time PCR （通量（通量 未知病原未知病原) ) 巣式巣式PCR/RT-PCR

3、(PCR/RT-PCR (污染，電泳）污染，電泳） 核酸擴(kuò)增檢測(cè)技術(shù)概述核酸擴(kuò)增檢測(cè)技術(shù)概述 核酸擴(kuò)增技術(shù)是一種常規(guī)生物技術(shù)，是分子生物學(xué)的基礎(chǔ)研究方法。核酸擴(kuò)增技術(shù)是一種常規(guī)生物技術(shù)，是分子生物學(xué)的基礎(chǔ)研究方法。作為主流檢測(cè)技術(shù)被廣泛應(yīng)用于實(shí)驗(yàn)室、醫(yī)院。作為主流檢測(cè)技術(shù)被廣泛應(yīng)用于實(shí)驗(yàn)室、醫(yī)院。 核酸擴(kuò)增技術(shù)可分為核酸擴(kuò)增技術(shù)可分為變溫?cái)U(kuò)增技術(shù)變溫?cái)U(kuò)增技術(shù)和和等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)。變變 溫溫 擴(kuò)擴(kuò) 增增PCRPCRRealtime PCRRealtime PCRRT PCRRT PCRNested PCRNested PCRMultiplex PCRMultiplex PCRDigita

4、l PCRDigital PCR等等 溫溫 擴(kuò)擴(kuò) 增增TMA/NASBATMA/NASBASMARTSMARTHDAHDASDA/NDASDA/NDARCA/MDARCA/MDALAMPLAMP/ /基于基于T7 PromoterT7 Promoter基于解旋酶基于解旋酶基于鏈置換活性的基于鏈置換活性的DNA DNA 聚合酶聚合酶鏈置換和重組酶鏈置換和重組酶核酸檢測(cè)新技術(shù)核酸檢測(cè)新技術(shù) LAMP/IMSA/RPA LAMP/IMSA/RPA Multiplex PCR Multiplex PCR Nested PCR ( Nested PCR (一步法）一步法） Digital PCR Dig

5、ital PCR 自動(dòng)化檢測(cè)自動(dòng)化檢測(cè) 再測(cè)序芯片再測(cè)序芯片 PCR PCR 陣列陣列 二代測(cè)序（二代測(cè)序（NGSNGS） POCT POCT（現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)）（現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)） 核酸檢測(cè)技術(shù)發(fā)展趨勢(shì) 未知病原 多病原 高通量 自動(dòng)化 現(xiàn)場(chǎng)技術(shù) (POCT)中中 心心 實(shí)實(shí) 驗(yàn)驗(yàn) 室室 科科 研研 方方 向向 簡(jiǎn)簡(jiǎn) 介介 未知病原檢測(cè)技術(shù)平臺(tái) 高通量自動(dòng)化工作站技術(shù)平臺(tái) 多病原、癥候群檢測(cè)技術(shù)平臺(tái) 現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)技術(shù)平臺(tái)4123u 現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)技術(shù) - LAMP, IMSAu 多病原檢/監(jiān)測(cè)技術(shù) - GeXP, Qiaxcel, RPMu 未知病原鑒定未知病原鑒定 - NGS，VIDISCA, RPM u 自動(dòng)化檢

6、測(cè)- Liquid handling systemu 生物信息學(xué)支持- VIP軟件 檢測(cè)檢測(cè)/ /監(jiān)測(cè)監(jiān)測(cè)/ /鑒定鑒定技術(shù)平臺(tái)定位功能實(shí)際應(yīng)用相關(guān)英文文章（中文文章略）未知病原鑒定國(guó)家級(jí)技 術(shù) 服務(wù) 和 支撐T e m b u s u V i r u s i n ducks, China, Echo 33Echo33J. Virol. 2012, 86(6):3406Emerging Infect Dis, 2011. 17 (10):1873Archive virology, 2014，DOI 10.1007自動(dòng)化檢測(cè) 國(guó)家級(jí)技 術(shù) 服務(wù) 和 支撐全國(guó)分子和血清學(xué)流行病學(xué)調(diào)查，大規(guī)模SNP

7、分析J. Infection 2011，62(1):107BMC Infect Dis, 2010， 10:178Inflam. Bowel Dis 2011,1 7(12):2472PLOS One , 2013, 8(1): e55197多病原檢測(cè)/監(jiān)測(cè)省級(jí)高 通 量檢 測(cè) 和癥 候 群監(jiān)測(cè)呼吸道(9+7)，手足口，流感，腹瀉，HPV分型，SNP，耐藥,轉(zhuǎn)基因，腦炎J Virol Met. 168 (2010) 255258Adv. in Virology 2011: 129134J. Clin. Microbiol 2012, 50(2):288J.Med Virol. 2012, 84

8、:957J. Clin. Microbiol. 2012, 50(7)：2384BMC Infect Dis, 2012,12:189BMC Microbiology 2013, 13:58PLOS One, 2013 (accepted)現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)地市級(jí)現(xiàn) 場(chǎng) 初步篩查手足口，H1N1H1N1，H7N9H7N9流感流感，諾如病毒, HPV，HIV，HCV,MERS, EbolaJ Virol Met 2010,167(2), 214J Virol Met 2011,175:283J. Clin. Microbiol 2011, 49(10）3545PLOS One ,2012,7(12): e

9、52486Adv. in Infect Dis, 2012, 2, 110-118 生物信息學(xué)軟件DS2，VIP 國(guó)家級(jí)技 術(shù) 服務(wù) 和 支撐表位分析，抗原抗體相互作用J Virol Met 181 (2012) 182 187 Biomed Environ Sci, 2012; 25(1): 98-103 病毒檢測(cè)病毒檢測(cè)/監(jiān)測(cè)監(jiān)測(cè)/簽定技術(shù)平臺(tái)及生物信息學(xué)簽定技術(shù)平臺(tái)及生物信息學(xué) 核酸檢測(cè)新技術(shù)核酸檢測(cè)新技術(shù) LAMP/ Multiplex PCR Nested PCR (一步法） Digital PCR 自動(dòng)化檢測(cè) 再測(cè)序芯片 PCR 陣列 二代測(cè)序（NGS） POCT（現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)） LA

10、MPLAMP技術(shù)特點(diǎn)技術(shù)特點(diǎn)u 特異性強(qiáng)特異性強(qiáng): 2: 2對(duì)引物配對(duì)對(duì)引物配對(duì)6 6個(gè)區(qū)域或個(gè)區(qū)域或3 3對(duì)引物配對(duì)對(duì)引物配對(duì)8 8個(gè)區(qū)域個(gè)區(qū)域u 靈敏度高：靈敏度高： 10-100 copies10-100 copiesu 設(shè)備要求低設(shè)備要求低: : 不需要不需要PCRPCR儀器，儀器，65 65 水?。ǖ葴兀┧。ǖ葴兀﹗ 檢測(cè)快速：檢測(cè)快速： 1 1小時(shí)小時(shí)u 操作簡(jiǎn)單：操作簡(jiǎn)單： 一步法（單管）一步法（單管）u 結(jié)果判定方便：顏色（肉眼觀察顏色變化和沉淀）結(jié)果判定方便：顏色（肉眼觀察顏色變化和沉淀） 吸光值（半定量，吸光值（半定量，650nm650nm比色）比色） 普通瓊脂糖電泳普通

11、瓊脂糖電泳 濁度（濁度儀，實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)，半定量）濁度（濁度儀，實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)，半定量） 實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀2小時(shí)水浴、熱塊、PCR儀、濁度儀電泳、濁度、顏色指示劑、肉眼觀察1小時(shí)25￥/Reaction儀器要求實(shí)驗(yàn)結(jié)果反應(yīng)時(shí)間實(shí)驗(yàn)成本Realtime PCR 與 LAMPLAMP 特點(diǎn)比較Realtime PCRLAMPVS實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀50￥/Reaction病原體檢測(cè)LAMP擴(kuò) 展J Virol Met 2010,167(2), 214H1N1J Virol Met 2011,175:283Advances in Infect. Dis. 2012EV71CA16J Clin. Microb

12、iol 2011,49(10):3545HPVNorVPLOS One 2012, 7(12)direct LAMP定量 HIVIMSA/EV71/CA16 JCM,2014, 52（6): 1862MERS (submitted)Gene, 2014, 541, 123-128Food and enviromental virology ,2014GEAR/HRVClin Microbiol Infect. 2013H7N9submitted 內(nèi)容：LAMP檢測(cè)技術(shù)應(yīng)用于手足口病例的現(xiàn)場(chǎng)評(píng)價(jià) 合作單位：湖南、山東、河北省CDC 標(biāo)本數(shù)量：手足口500份（每?。㎜AMP 技術(shù)的現(xiàn)場(chǎng)評(píng)價(jià)LAMP

13、 技術(shù)現(xiàn)場(chǎng)評(píng)價(jià)LAMP 檢測(cè)技術(shù)應(yīng)用于手足口病例的評(píng)價(jià) (湖南)2012, 4(2) 110-118試驗(yàn)真陽(yáng)性(TP)真陰性(TN)合計(jì)LAMP陽(yáng)性233(DP)0(FP)233LAMP陰性0(FN)282(DN)282總數(shù)233282515腸道病毒EV71型核酸檢測(cè)結(jié)果比較腸道病毒CoxA16型核酸檢測(cè)結(jié)果比較試驗(yàn)真陽(yáng)性(TP)真陰性(TN)合計(jì)LAMP陽(yáng)性103(DP)0 (FP)103LAMP陰性2(FN)410(DN)412總數(shù)105410515p小結(jié)臨床標(biāo)本515份EV71符合率100%CA16符合率99.6%參照：國(guó)產(chǎn)RealTime PCR 檢測(cè)試劑盒IMSAIMSA (Isot

14、hermal Multiple (Isothermal Multiple Self-matching-initiated AmplificationSelf-matching-initiated Amplification) ) 目的：建立具有自主知識(shí)產(chǎn)權(quán)的等溫多自配體 引發(fā)擴(kuò)增反應(yīng) 專利進(jìn)入實(shí)質(zhì)審查 引物設(shè)計(jì)軟件：www.imsa-IMSA 與 LAMP 的特點(diǎn)比較IMSALAMP引物6條4-6條靶基因上的7個(gè)位點(diǎn)靶基因上的6-8個(gè)位點(diǎn)外引物為混合型：對(duì)應(yīng)2個(gè)位點(diǎn)外引物只對(duì)應(yīng)1個(gè)位點(diǎn)內(nèi)引物5端互補(bǔ)-外/內(nèi)/莖=1/4/8外/內(nèi)/環(huán)=1/8/4擴(kuò)增反應(yīng)產(chǎn)生4種可自我循環(huán)復(fù)制的基本結(jié)構(gòu)產(chǎn)生1種可

15、自我循環(huán)復(fù)制的基本結(jié)構(gòu)所有引物在反應(yīng)中持續(xù)起作用外引物只在反應(yīng)初始起作用IMSA 與 LAMP 方法檢測(cè)手足口病結(jié)果IMSA方法在常見(jiàn)傳染病檢測(cè)中的應(yīng)用方法在常見(jiàn)傳染病檢測(cè)中的應(yīng)用IMSA法針對(duì)EV71和CVA16 檢測(cè)的最低檢測(cè)線：利用概率元分析法（probit analysis）拷貝數(shù)（copies/反應(yīng)）陽(yáng)性數(shù)/總測(cè)試數(shù)，括號(hào)外為 EV71的測(cè)試，括號(hào)內(nèi)為CVA16的測(cè)試IMSA實(shí)時(shí)濁度法mHNB顏色判定法（IMSA）HNB顏色判定法（IMSA）LAMP實(shí)時(shí)濁度法1000015/15 (15/15)15/15 (15/15)15/15 (15/15)15/15 (15/15)500015

16、/15 (15/15)15/15 (15/15)15/15 (15/15)15/15 (15/15)100015/15 (15/15)15/15 (15/15)15/15 (15/15)9/15 (15/15)50012/15 (15/15)10/15 (15/15)9/15 (15/15)6/15 (15/15)2509/15 (15/15)9/15 (15/15)6/15 (15/15)3/15 (12/15)1006/15 (15/15)6/15 (15/15)3/15 (15/15)3/15 (6/15)503/15 (12/15)3/15 (9/15)0/15 (9/15)0/15

17、(3/15)250/15 (9/15)0/15 (6/15)0/15 (3/15)0/15 (0/15)100/15 (3/15)0/15 (3/15)0/15 (0/15)0/15 (0/15)50/15 (3/15)0/15 (0/15)0/15 (0/15)0/15 (0/15)10/15 (0/15)0/15 (0/15)0/15 (0/15)0/15 (0/15)93710391749326667108149430JCM,2014, 52（6): 1862IMSA 與 LAMP 方法檢測(cè)手足口病臨床標(biāo)本結(jié)果IMSA法針對(duì)261份手足口臨床標(biāo)本的檢測(cè)：以商業(yè)化qRT-PCR試劑盒檢測(cè)結(jié)

18、果為標(biāo)準(zhǔn)qRT-PCR檢測(cè)IMSA實(shí)時(shí)濁度法HNB顏色判定法（IMSA）mHNB顏色判定法（IMSA）LAMP實(shí)時(shí)濁度法 陽(yáng)性陰性陽(yáng)性陰性陽(yáng)性陰性陽(yáng)性陰性EV71 陽(yáng)性（56）542524542515陰性（205）0205020502050205靈敏度（%）96.4% (95% CI: 87.7-99.6%)92.9% (95% CI: 82.7-98.0%)96.4% (95% CI: 87.7-99.6%)91.1% (95% CI: 80.4-97.0%)特異性（%）100.0% (95% CI: 98.2-100.0%)100.0% (95% CI: 98.2-100.0%)100.0

19、% (95% CI: 98.2-100.0%)100.0% (95% CI: 98.2-100.0%)陽(yáng)性預(yù)測(cè)值（%）100.0% (95% CI: 93.4-100.0%)100.0% (95% CI: 93.2-100.0%)100.0% (95% CI: 93.4-100.0%)100.0% (95% CI: 93.0-100.0%)陰性預(yù)測(cè)值（%）99.0% (95% CI: 96.6-99.9%)98.1% (95% CI: 95.2-99.5%)99.0% (95% CI: 96.6-99.9%)97.6% (95% CI: 94.5-99.2%)CVA16 陽(yáng)性（130）1237

20、12010122811812陰性（131）0131013101310131靈敏度（%）94.6% (95% CI: 89.2-97.8%)92.3% (95% CI: 86.3-96.3%)93.9% (95% CI: 88.2-97.3%)90.8% (95% CI: 84.4-95.1%)特異性（%）100.0% (95% CI: 97.2-100.0%)100.0% (95% CI: 97.2-100.0%)100.0% (95% CI: 97.2-100.0%)100.0% (95% CI: 97.2-100.0%)陽(yáng)性預(yù)測(cè)值（%）100.0% (95% CI: 97.1-100.0%

21、)100.0% (95% CI: 97.0-100.0%)100.0% (95% CI: 97.0-100.0%)100.0% (95% CI: 96.9-100.0%)陰性預(yù)測(cè)值（%）94.9% (95% CI: 89.8-97.9%)92.9% (95% CI: 87.3-96.6%)94.2% (95% CI: 89.0-97.5%)91.6% (95% CI: 85.8-95.6%)IMSA法對(duì)手足口臨床標(biāo)本的檢測(cè)，其診斷靈敏度要高于LAMP法IMSA檢測(cè)H7N9方法的建立及評(píng)估 5份臨床標(biāo)本的實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)驗(yàn)證 與國(guó)家流感中心結(jié)果（qPCR）相一致 衛(wèi)生部臨檢中心的H7N9檢測(cè)技術(shù)考核P

22、anel 共計(jì)10份標(biāo)本，結(jié)果全部符合，無(wú)漏檢及誤檢 2013年12月末，參與廣東省新發(fā)H7N9病例檢測(cè) 結(jié)果符合，顯色法結(jié)果判讀準(zhǔn)確 H7N9檢測(cè)試劑盒轉(zhuǎn)讓北京愛(ài)普益生物科技有限公司 現(xiàn)場(chǎng)無(wú)儀器化提取核酸，發(fā)展直接法現(xiàn)場(chǎng)無(wú)儀器化提取核酸，發(fā)展直接法 多重檢測(cè)多重檢測(cè) （含內(nèi)參）（含內(nèi)參） 污染問(wèn)題污染問(wèn)題存在問(wèn)題核酸檢測(cè)新技術(shù)核酸檢測(cè)新技術(shù) LAMP/ Multiplex PCR Nested PCR (一步法） Digital PCR 自動(dòng)化檢測(cè) 再測(cè)序芯片 PCR 陣列 二代測(cè)序（NGS） POCT（現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)）DPODPO探針熔解曲線探針熔解曲線BioPlex氨基糖苷類(lèi)耐藥基因氨基糖苷類(lèi)

23、耐藥基因結(jié)核桿菌多耐藥性結(jié)核桿菌多耐藥性-手足口病相關(guān)病毒手足口病相關(guān)病毒-人乳頭瘤病毒人乳頭瘤病毒流感病毒流感病毒- 648520腹瀉相關(guān)病毒腹瀉相關(guān)病毒-呼吸道病毒呼吸道病毒乳腺癌宮頸癌相關(guān)乳腺癌宮頸癌相關(guān)SNPsSNPsTemperature Switch PCR (TSP)GeXP, QIAxcelBMC Microbiology.2013, 13:582013 , 8(4): e62126BRI, 2013, 327620 研究結(jié)果研究結(jié)果 引物濃度調(diào)整：嵌合引物和通用引物的比例；各嵌合引引物濃度調(diào)整：嵌合引物和通用引物的比例；各嵌合引物濃度；擴(kuò)增體系選擇物濃度；擴(kuò)增體系選擇 三個(gè)退

24、火溫度調(diào)整，三個(gè)退火溫度調(diào)整， 三個(gè)循環(huán)數(shù)調(diào)整，三個(gè)循環(huán)數(shù)調(diào)整，擴(kuò)增條件探索與優(yōu)化擴(kuò)增條件探索與優(yōu)化研究結(jié)果：研究結(jié)果：基于基于QIAxcelQIAxcel全自動(dòng)電泳儀全自動(dòng)電泳儀Group A（9種）Group B（7種）流感病毒A型和B型、季節(jié)性H1N1呼吸道合胞病毒A型和B型副流感病毒1型副流感病毒2、3型冠狀病毒OC43、229E、HKU1冠狀病毒NL63人鼻病毒；腺病毒人偏肺病毒；人博卡病毒兩組中均加入兩組中均加入Rnasep-DNARnasep-DNA引物作為內(nèi)參；引物作為內(nèi)參；病原體分組病原體分組基于基于QiaxcelQiaxcel的多重的多重PCRPCR檢測(cè)技術(shù)檢測(cè)技術(shù)16種常

25、見(jiàn)呼吸道病毒分型檢測(cè)種常見(jiàn)呼吸道病毒分型檢測(cè) 呼吸道病毒多重呼吸道病毒多重PCR快速檢測(cè)試劑盒快速檢測(cè)試劑盒( ABT9+7)商業(yè)化商業(yè)化發(fā)熱呼吸道癥候群多種病原核酸檢測(cè)培訓(xùn)班發(fā)熱呼吸道癥候群多種病原核酸檢測(cè)培訓(xùn)班 -北京北京 2012. 05 “常見(jiàn)常見(jiàn)1616種呼吸道病毒檢測(cè)的多重種呼吸道病毒檢測(cè)的多重PCRPCR試劑盒試劑盒”應(yīng)用于十二五傳染病重大應(yīng)用于十二五傳染病重大專項(xiàng)發(fā)熱伴呼吸道癥候群監(jiān)測(cè)項(xiàng)目專項(xiàng)發(fā)熱伴呼吸道癥候群監(jiān)測(cè)項(xiàng)目“常見(jiàn)常見(jiàn)16種呼吸道病毒檢測(cè)的多重種呼吸道病毒檢測(cè)的多重PCR試劑盒試劑盒”應(yīng)用于全應(yīng)用于全國(guó)流感監(jiān)測(cè)網(wǎng)絡(luò)部分實(shí)驗(yàn)室國(guó)流感監(jiān)測(cè)網(wǎng)絡(luò)部分實(shí)驗(yàn)室呼吸道病毒多重呼吸道

26、病毒多重PCRPCR快速檢測(cè)試劑盒快速檢測(cè)試劑盒 存在問(wèn)題：病毒變異存在問(wèn)題：病毒變異 （引物優(yōu)化）（引物優(yōu)化） 病毒地區(qū)差異病毒地區(qū)差異 （引物優(yōu)化）（引物優(yōu)化） 結(jié)果判斷結(jié)果判斷 陽(yáng)性對(duì)照陽(yáng)性對(duì)照 （1616質(zhì)粒質(zhì)粒/RNA/RNA） 增加病原體（流感亞型）增加病原體（流感亞型） 內(nèi)參更換內(nèi)參更換 （假病毒）（假病毒） 兩管并一管（兩管并一管（1111種病毒）種病毒） 流感耐藥流感耐藥 基于基于熔熔解曲線分析的解曲線分析的多重多重PCRPCR檢測(cè)技術(shù)檢測(cè)技術(shù)六種常見(jiàn)食源性細(xì)菌的檢測(cè)六種常見(jiàn)食源性細(xì)菌的檢測(cè)目的菌種目的菌種致瀉性大腸桿菌致瀉性大腸桿菌沙門(mén)氏菌沙門(mén)氏菌志賀氏菌志賀氏菌單核細(xì)胞增

27、生性李斯特氏菌單核細(xì)胞增生性李斯特氏菌副溶血弧菌副溶血弧菌金黃色葡萄球菌金黃色葡萄球菌引物設(shè)計(jì)引物設(shè)計(jì)單引物單模板單引物單模板多引物多模板及引物分組多引物多模板及引物分組3 沙門(mén)氏菌沙門(mén)氏菌3 副溶血弧菌副溶血弧菌1 1 志賀氏菌志賀氏菌2 2 致瀉性大腸桿菌致瀉性大腸桿菌1 1 金黃色葡萄球菌金黃色葡萄球菌2 李斯特氏菌李斯特氏菌122331十二種腹瀉病原體的檢測(cè)十二種腹瀉病原體的檢測(cè)(submitted)(submitted)目的病毒目的病毒目的細(xì)菌目的細(xì)菌 諾如病毒諾如病毒GIGI型型空腸彎曲菌空腸彎曲菌札如病毒札如病毒鼠疫耶爾森菌鼠疫耶爾森菌腺病毒腺病毒F F組組副溶血弧菌副溶血弧菌諾

28、如病毒諾如病毒GIIGII型型志賀氏菌志賀氏菌輪狀病毒輪狀病毒A A組組大腸桿菌大腸桿菌人類(lèi)星狀病毒人類(lèi)星狀病毒沙門(mén)氏菌沙門(mén)氏菌核酸檢測(cè)新技術(shù)核酸檢測(cè)新技術(shù) LAMP/ Multiplex PCR Nested PCR (一步法） Digital PCR 自動(dòng)化檢測(cè) 再測(cè)序芯片 PCR 陣列 二代測(cè)序（NGS） POCT（現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)）one-step Real-Time nested RT-PCR(ORTN RT-PCR) (submitted) 基于基于 TSP TSP 設(shè)計(jì)的新型一步法設(shè)計(jì)的新型一步法巣式巣式PCR PCR 方法方法實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)：實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)： 一管四引物兩退火溫度一管四引物兩退火溫

29、度 F1 F2R2 R1 不同長(zhǎng)度的內(nèi)外引物不同長(zhǎng)度的內(nèi)外引物 退火溫度不同退火溫度不同 引物濃度不同引物濃度不同 溶解曲線分析溶解曲線分析 極高靈敏度極高靈敏度實(shí)驗(yàn)結(jié)果：熔解曲線實(shí)驗(yàn)結(jié)果：熔解曲線& &瓊脂糖電泳瓊脂糖電泳1 1（L1L1）：陰性樣品。）：陰性樣品。 2 2（L2L2）：陽(yáng)性樣品）：陽(yáng)性樣品實(shí)驗(yàn)結(jié)果：實(shí)驗(yàn)結(jié)果：EV71 EV71 標(biāo)準(zhǔn)曲線圖標(biāo)準(zhǔn)曲線圖本試驗(yàn)方法可用作本試驗(yàn)方法可用作EV71EV71樣品的定量分析，樣品的定量分析，CTCT值可達(dá)到值可達(dá)到38.4038.40，1010倍于倍于qPCRqPCRAssaysPositive No. and Perce

30、ntage of EV71Negative No. and Percentage of EV71Ct valueORTN RT-PCR41（41%）59（59%）26-38qRT-PCR29（29%）71（71%）26.5-35傳統(tǒng)傳統(tǒng)巣式巣式PCRPCR41（41%）59（59%）新型一步法巣式巣式PCR與熒光定量探針?lè)≒CR和傳統(tǒng)兩步法巣式巣式PCRPCR比較比較（100份臨床樣品）針對(duì)針對(duì)1212例檢測(cè)結(jié)果不同樣品，采取重復(fù)試驗(yàn)并測(cè)序的方法驗(yàn)例檢測(cè)結(jié)果不同樣品，采取重復(fù)試驗(yàn)并測(cè)序的方法驗(yàn)證新型一步法檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性。證新型一步法檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性。Advantages of digital

31、 PCRAdvantages of digital PCR（優(yōu)點(diǎn)）（優(yōu)點(diǎn)） Not rely on external references Increased tolerance to enzyme-inhibiting substances Simultaneous template amplification Superior precision, sensitivity and reproducibility lower coefficient of variation Reduced background DNA and contaminant levels which consequ

32、ently increases the signal-to-noise ratio in positive reaction partitions核酸檢測(cè)新技術(shù)核酸檢測(cè)新技術(shù) LAMP/ Multiplex PCR Nested PCR (一步法） Digital PCR 自動(dòng)化檢測(cè) 再測(cè)序芯片 PCR 陣列 二代測(cè)序（NGS） POCT（現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)）自動(dòng)化高通量檢測(cè)Beckman Biomek NX/FXBeckman Biomek NX/FX型型實(shí)驗(yàn)室自動(dòng)化工作站實(shí)驗(yàn)室自動(dòng)化工作站 主要特點(diǎn)：?jiǎn)伪刍螂p臂，主要特點(diǎn)：?jiǎn)伪刍螂p臂，9696道、道、384384道或智能八道加樣器供選，道或智能八道加

33、樣器供選，2424個(gè)微孔盤(pán)工作區(qū)，多種分注功能及配件定位器可選個(gè)微孔盤(pán)工作區(qū)，多種分注功能及配件定位器可選未知病原檢測(cè)未知病原檢測(cè) 再測(cè)序芯片（再測(cè)序芯片（RPMRPM） PCR PCR 陣列（陣列（PCR array)PCR array) 二代測(cè)序二代測(cè)序 （NGSNGS）智能化的智能化的分析軟件分析軟件 芯片滾動(dòng)芯片滾動(dòng)雜交儀雜交儀芯片洗芯片洗滌工作滌工作站站定制基因芯定制基因芯片片 高分辨率的高分辨率的芯片掃描儀芯片掃描儀未知病原未知病原RPMRPMu 完成完成4 4種不同癥候群（呼吸道感染，種不同癥候群（呼吸道感染，7 7科科2323屬；胃腸道感染屬；胃腸道感染，6 6科科1313屬；

34、腦炎和神經(jīng)系統(tǒng)感染，屬；腦炎和神經(jīng)系統(tǒng)感染，6 6科科1717屬；病毒性出血血熱屬；病毒性出血血熱相關(guān)，相關(guān)，4 4科科1010屬）的相關(guān)病毒性病原體的全部引物和探針的生屬）的相關(guān)病毒性病原體的全部引物和探針的生物信息學(xué)分析、設(shè)計(jì)和芯片定制（物信息學(xué)分析、設(shè)計(jì)和芯片定制（650650片）和儲(chǔ)備片）和儲(chǔ)備u 建立了呼吸道感染和胃腸道感染再測(cè)序檢測(cè)芯片技術(shù)平臺(tái)建立了呼吸道感染和胃腸道感染再測(cè)序檢測(cè)芯片技術(shù)平臺(tái)RPM-Flu3.1：FluA(35%)12種病毒種病毒21種細(xì)菌種細(xì)菌RPM-IVDC1：86種病毒亞型種病毒亞型 22種細(xì)菌種細(xì)菌Plos One,2013 8(9) : e75704Fr

35、ontier in Microbiology,2015(accepted)Resequencing Pathogen Microarray再測(cè)序芯片（再測(cè)序芯片（RPM）高通量自動(dòng)化的腦炎癥候群檢測(cè)高通量自動(dòng)化的腦炎癥候群檢測(cè)PCR ArrayPCR Array方法方法方法建立的基礎(chǔ)方法建立的基礎(chǔ) 1 1：樣品體積擴(kuò)大：樣品體積擴(kuò)大RNA LcDNA L自動(dòng)化640RNARNAcDNAcDNA方法所需樣品量方法所需樣品量3232L L（1616個(gè)孔）個(gè)孔）方法建立的基礎(chǔ)方法建立的基礎(chǔ) 2 2：9696孔板的分配孔板的分配特點(diǎn)：特點(diǎn)：1.1.引物組在引物組在9696孔板上的分布是模式化的?？装迳?/p>

36、的分布是模式化的。2.2.更快的分配體系。更快的分配體系。3.3.節(jié)省了樣品編號(hào)的時(shí)間。節(jié)省了樣品編號(hào)的時(shí)間。引物組可以安排在同一個(gè)整行或整列也可以平均分配整行或者整列ABCDEFGH12腸道病毒乙腦皰疹腮腺炎彈狀病毒副粘病毒麻疹西尼羅蜱傳腦炎細(xì)菌16s呼吸道合胞風(fēng)疹布尼亞病毒蟲(chóng)媒病毒沙粒病毒黃病毒方法中所用的引物：方法中所用的引物：200200對(duì)對(duì)+ +來(lái)源來(lái)源再測(cè)序芯片的引物再測(cè)序芯片的引物文獻(xiàn)中查到的文獻(xiàn)中查到的各個(gè)科室提供的各個(gè)科室提供的根據(jù)每年流行情況不同，對(duì)引物組進(jìn)行調(diào)整根據(jù)每年流行情況不同，對(duì)引物組進(jìn)行調(diào)整特點(diǎn)：特點(diǎn)：1.1.每個(gè)樣品由每個(gè)樣品由1616個(gè)不同的引物組檢測(cè)個(gè)不同的

37、引物組檢測(cè)2.2.整板的整板的PCRPCR產(chǎn)物都用同一對(duì)引物測(cè)序。產(chǎn)物都用同一對(duì)引物測(cè)序。方法流程（方法流程（2424小時(shí)完成）小時(shí)完成）全自動(dòng)電泳儀RNAcDNA工作站加樣與PCR可以做成預(yù)制反應(yīng)體系獲得電泳結(jié)果獲得sanger法測(cè)序結(jié)果 測(cè)序陰性樣本：做二代測(cè)序Real time Real time 結(jié)果結(jié)果PCR arrayPCR array方法結(jié)果方法結(jié)果提示提示所有樣品一般都所有樣品一般都為為Real timeReal time陰陰性樣本性樣本常見(jiàn)病原體陽(yáng)性常見(jiàn)病原體陽(yáng)性有突變，或方法靈敏度不同有突變，或方法靈敏度不同不常見(jiàn)病原體陽(yáng)性不常見(jiàn)病原體陽(yáng)性少見(jiàn)的病原體少見(jiàn)的病原體陰性陰性參

38、考參考16SRNA16SRNA結(jié)果結(jié)果結(jié)果分析結(jié)果分析臨床檢測(cè)結(jié)果：兒童醫(yī)院樣品臨床檢測(cè)結(jié)果：兒童醫(yī)院樣品lz18Pseudomonaslz32Mumpslz144EVMumpslz162EVlz136EVPseudomonaslz149Pseudomonaslz160Mumpslz130cEVMumpslz153EVlz117cEVLZ104cMumpsLZ155EVLz87MumpsLz67EVLz81EVLz85EVLz91MumpsLz75MumpsLz79Mumps陽(yáng)性率：1996 (19.8%) 另有147份樣本進(jìn)行中新一代測(cè)序技術(shù)應(yīng)用領(lǐng)域新一代測(cè)序技術(shù)應(yīng)用領(lǐng)域攜帶者篩查預(yù)處理藥理基因測(cè)試產(chǎn)前監(jiān)測(cè)孕后監(jiān)測(cè)孕期監(jiān)測(cè)胚胎遺傳學(xué)診斷遺傳疾病遺傳疾病腫瘤研究腫瘤研究腫瘤切除邊緣治療狀態(tài)監(jiān)測(cè)預(yù)后復(fù)發(fā)檢測(cè)風(fēng)險(xiǎn)預(yù)警早期檢測(cè)篩查腫瘤診斷設(shè)備平臺(tái)感染疾病感染疾病動(dòng)物微生物研究微生物定性病毒載量監(jiān)測(cè)微生物定量突變株鑒定病毒整合移植配型移植配型鑒定和配型組織排斥全程監(jiān)測(cè)移植后排斥監(jiān)測(cè)以及更廣闊的應(yīng)用以及更廣闊的應(yīng)用可感染人病毒的發(fā)現(xiàn)時(shí)間曲線Woolhouse M E et al. Proc. R. Soc. B 2008;275:2111-2115 隨著越來(lái)越多的病毒被發(fā)現(xiàn)了，其中可能致病的病毒種隨著越來(lái)越多的病毒被發(fā)現(xiàn)了，其中可能致病的病毒種類(lèi)也隨之增加。類(lèi)也隨之增加。臨