蛋白質(zhì)電泳分離

1、醋酸纖維薄膜電泳法醋酸纖維薄膜電泳法分離血清蛋白質(zhì)分離血清蛋白質(zhì)4 4學(xué)時學(xué)時通過實驗使學(xué)生掌握電泳通過實驗使學(xué)生掌握電泳的基本原理的基本原理一二三熟悉熟悉薄膜電泳的基本操作薄膜電泳的基本操作 一、一、實驗?zāi)康膶嶒災(zāi)康恼莆照莆沾姿崂w維素薄膜電泳法醋酸纖維素薄膜電泳法分離分離血清蛋白血清蛋白的原理的原理二、實驗原理二、實驗原理1、電泳法、電泳法 是指帶電粒子在外電場的作用下，向是指帶電粒子在外電場的作用下，向著與其電性著與其電性相反相反的電極移動的現(xiàn)象。的電極移動的現(xiàn)象。如：不處于等電點的蛋白質(zhì)分子帶電荷。如：不處于等電點的蛋白質(zhì)分子帶電荷。pH=pIpH=pI OH-pHpIpHpI H+ O

2、H- H+pHpIpHpI蛋白質(zhì)蛋白質(zhì)的兼性離子的兼性離子 陽離子陽離子陰離子陰離子CHNHCOOHR CHNH2COOHRCHNHCOOR CHNH2COO-RCHNHCOOR CHNH3COO-R+CHNHCOOHR CHNH3COOHR+2、電泳技術(shù)、電泳技術(shù) 是利用樣品中各帶電粒子在電場中的是利用樣品中各帶電粒子在電場中的遷移速度遷移速度不同，從而對樣品中分子進行不同，從而對樣品中分子進行分分離離、鑒定鑒定、純化純化和和制備。制備。外在因素外在因素電場強度、電場強度、溶液的溶液的pHpH值、值、溶液的離子強度、溶液的離子強度、電滲現(xiàn)象電滲現(xiàn)象影響電泳遷移率的因素影響電泳遷移率的因素粒子

3、所帶凈電粒子所帶凈電荷的量、大小荷的量、大小和形狀和形狀內(nèi)在因素內(nèi)在因素3、電泳的分類、電泳的分類依據(jù)支持物的性質(zhì)不同：依據(jù)支持物的性質(zhì)不同：紙電泳、紙電泳、醋酸纖維素薄膜電泳、醋酸纖維素薄膜電泳、瓊脂糖凝膠電泳、聚丙烯酰胺凝膠電泳瓊脂糖凝膠電泳、聚丙烯酰胺凝膠電泳 醋酸纖維素薄膜電泳醋酸纖維素薄膜電泳 醋酸纖維薄膜電泳醋酸纖維薄膜電泳是以醋酸纖維薄膜作是以醋酸纖維薄膜作支持物的一種區(qū)帶電泳技術(shù)。支持物的一種區(qū)帶電泳技術(shù)。 該膜具有均一細密微孔結(jié)構(gòu)，對分子移動阻該膜具有均一細密微孔結(jié)構(gòu)，對分子移動阻力小，作為區(qū)帶電泳的支持物，它具有操作簡便、力小，作為區(qū)帶電泳的支持物，它具有操作簡便、快速、樣

4、品需要量少，應(yīng)用范圍廣等優(yōu)點。不足快速、樣品需要量少，應(yīng)用范圍廣等優(yōu)點。不足之處是分辨率比聚丙烯酰胺凝膠電泳低，薄膜厚之處是分辨率比聚丙烯酰胺凝膠電泳低，薄膜厚度小不適于做樣品制備用。度小不適于做樣品制備用。血清中含有清蛋白、血清中含有清蛋白、-球蛋白、球蛋白、-球蛋球蛋白、白、-球蛋白和各種脂蛋白等。球蛋白和各種脂蛋白等。清蛋白1球蛋白 2球蛋白球蛋白球蛋白pI4.885.065.065.126.85-7.3泳動度(cm2/s.v)5.910-55.1410-54.110-52.810-51.010-5分子量(kD)6920030090-150156-3004、血清蛋白的種類、血清蛋白的種類

5、PH8.6PH8.6緩沖液緩沖液中帶負電荷中帶負電荷電泳后，將薄膜取出，經(jīng)染色和漂電泳后，將薄膜取出，經(jīng)染色和漂洗，薄膜上顯示出五條區(qū)帶，每條帶洗，薄膜上顯示出五條區(qū)帶，每條帶代表一種蛋白質(zhì)。代表一種蛋白質(zhì)。結(jié)果示意圖：結(jié)果示意圖： 2 1 清蛋白清蛋白三、實驗器材與試劑三、實驗器材與試劑1.1.器材：器材： 電泳儀、電泳槽、電泳儀、電泳槽、醋酸纖維素薄膜醋酸纖維素薄膜(2X8cm)(2X8cm)、毛細管、毛細管、培養(yǎng)皿培養(yǎng)皿、載玻片載玻片、 粗濾紙粗濾紙、鑷子，燒杯，量筒，鉛筆。鑷子，燒杯，量筒，鉛筆。2.2.試劑：試劑：新鮮人血清新鮮人血清（無溶血現(xiàn)象）（無溶血現(xiàn)象）PH8.6PH8.6緩

6、沖液緩沖液：巴比妥：巴比妥1.66g1.66g、 巴比妥鈉巴比妥鈉12.76g12.76g、加水至加水至1000ml1000ml，置置44冰箱保存。冰箱保存。染色液染色液：氨基黑：氨基黑10B 0.5g10B 0.5g、 甲醇甲醇50ml50ml、 冰醋冰醋酸酸10ml10ml、蒸餾水蒸餾水40ml40ml，混勻溶解貯存。混勻溶解貯存。 漂洗液漂洗液：9595乙醇乙醇45ml45ml、冰醋酸冰醋酸5ml5ml、蒸餾水蒸餾水50ml50ml、混勻?；靹颉＝萁蓦娪静蹨?zhǔn)備電泳槽準(zhǔn)備點樣點樣 電泳電泳脫色脫色染色染色五、實驗過程五、實驗過程1.1.浸泡浸泡：在薄膜：在薄膜粗糙面粗糙面距一端距一端2

7、cm2cm左右左右處處用鉛筆輕輕劃一條直線，表示點樣位用鉛筆輕輕劃一條直線，表示點樣位置。將薄膜粗糙面向下，浸泡于置。將薄膜粗糙面向下，浸泡于PH8.6PH8.6的巴比妥緩沖液中至少的巴比妥緩沖液中至少十分鐘十分鐘，使之，使之完全完全浸泡透浸泡透。2. 2. 電泳槽的準(zhǔn)備電泳槽的準(zhǔn)備 電泳槽有兩個互相隔離的槽，各自裝有電泳槽有兩個互相隔離的槽，各自裝有緩沖液，接不同的電極，紅色為正極，黑緩沖液，接不同的電極，紅色為正極，黑色為負極。每個槽上都有一根可移動的橫色為負極。每個槽上都有一根可移動的橫桿，濾紙的一頭搭在橫桿上，另一頭浸入桿，濾紙的一頭搭在橫桿上，另一頭浸入緩沖液中，形成了濾紙橋。兩桿之

8、間的距緩沖液中，形成了濾紙橋。兩桿之間的距離調(diào)節(jié)到略小于醋酸纖維薄膜的長度，點離調(diào)節(jié)到略小于醋酸纖維薄膜的長度，點好樣的醋酸纖維薄膜就搭在濾紙橋上。好樣的醋酸纖維薄膜就搭在濾紙橋上。3. 3. 點樣點樣：把膜條從緩沖液中取出，夾在兩層：把膜條從緩沖液中取出，夾在兩層粗濾紙內(nèi)吸干多余的液體，然后鋪在干凈粗濾紙內(nèi)吸干多余的液體，然后鋪在干凈的平皿蓋上的平皿蓋上( (粗糙面粗糙面點樣點樣) )，將毛細管在血，將毛細管在血清中沾一下，封住上端，在載玻片的一端清中沾一下，封住上端，在載玻片的一端均勻涂過，使樣品均勻涂過，使樣品連續(xù)、均勻、適量連續(xù)、均勻、適量，把，把載玻片在薄膜粗糙面上點樣位置輕而溫和載

9、玻片在薄膜粗糙面上點樣位置輕而溫和地印一下。地印一下。2cm4.4.電泳電泳：將薄膜：將薄膜粗糙面朝下粗糙面朝下，平行扣于電泳，平行扣于電泳槽支架的濾紙橋上，膜條槽支架的濾紙橋上，膜條點樣的一端放在點樣的一端放在負極上負極上，膜條與濾紙必須貼緊，平衡，膜條與濾紙必須貼緊，平衡5 5分鐘分鐘后通電。調(diào)節(jié)電壓至后通電。調(diào)節(jié)電壓至90-120V90-120V左右，電流強左右，電流強度為度為0.40.6mA/cm0.40.6mA/cm，電泳時間，電泳時間40min-1h40min-1h。 5.5.染色：染色：電泳完畢后將膜條取下并放在染色電泳完畢后將膜條取下并放在染色液中浸泡液中浸泡2-52-5分鐘。

10、分鐘。6.6.漂洗漂洗：將膜條從染色液中取出后移置到漂將膜條從染色液中取出后移置到漂洗液洗液中中漂洗漂洗3 3-4-4次至無蛋白區(qū)次至無蛋白區(qū)底色脫凈底色脫凈為止，為止，可得到色帶清晰的電泳圖譜可得到色帶清晰的電泳圖譜。五、實驗結(jié)果與分析五、實驗結(jié)果與分析 清蛋白清蛋白 1 2 失敗圖譜的分析失敗圖譜的分析拖尾狀拖尾狀：點樣量過多，被分離的血清蛋白不能分離成5條區(qū)帶或產(chǎn)生拖尾。有斑點有斑點：點樣不均勻，不整齊，導(dǎo)致被分離的區(qū)帶出現(xiàn)斑點。邊流現(xiàn)象邊流現(xiàn)象：點樣板蘸取血清一邊多一邊少，導(dǎo)致區(qū)帶分離不清，出現(xiàn)邊流現(xiàn)象。區(qū)帶模糊區(qū)帶模糊：薄膜過濕，樣品擴散迅速，導(dǎo)致樣品分離不成區(qū)帶。 鋸齒狀鋸齒狀：薄

11、膜用濾紙吸水過度（薄膜上出現(xiàn)白斑）或未及時搭橋，導(dǎo)致薄膜過于干燥，使區(qū)帶成鋸齒狀。區(qū)帶傾斜區(qū)帶傾斜：薄膜搭載濾紙上的位置歪斜，彎曲，與電流方向不平行，或點樣一邊多一邊少，區(qū)帶容易泳斜。 區(qū)帶重疊區(qū)帶重疊：在染色固定前，薄膜與薄膜之間重疊，造成薄膜上還未固定的血清蛋白彼此粘連。 區(qū)帶過密區(qū)帶過密：電泳時電壓，電流過小或時間不夠，造成區(qū)帶未分離。六、臨床意義六、臨床意義 血漿蛋白是血漿中最主要的固體成分，含量為血漿蛋白是血漿中最主要的固體成分，含量為606080g/L,80g/L,大部分由肝臟合成。大部分由肝臟合成。正常值：正常值：蛋白質(zhì)蛋白質(zhì)血漿中濃度血漿中濃度白蛋白白蛋白404050g/L50

12、g/L1 1-球蛋白球蛋白2 24g/L4g/L2 2-球蛋白球蛋白4 49g/L9g/L-球蛋白球蛋白6 611g/L11g/L-球蛋白球蛋白131317g/L17g/L肝炎肝炎白蛋白、白蛋白、1、2 和和球蛋白降低，球蛋白降低，球蛋白升高；球蛋白升高；肝硬化肝硬化白蛋白、白蛋白、1、2 和和球蛋白下降明顯，球蛋白下降明顯，球蛋白極度升高；球蛋白極度升高；腎病綜合征腎病綜合征白蛋白降低，白蛋白降低， 2 和和球蛋白升高。球蛋白升高。多發(fā)性骨髓瘤：多發(fā)性骨髓瘤：白蛋白降低，白蛋白降低，球蛋白升高，球蛋白升高， 和和球蛋白區(qū)帶之間出現(xiàn)球蛋白區(qū)帶之間出現(xiàn)“M”帶。帶。急慢性腎炎、腎病綜合征、腎功能

13、衰竭：急慢性腎炎、腎病綜合征、腎功能衰竭：白蛋白降低，白蛋白降低，1 1、2 2 和和球蛋白升高；球蛋白升高；慢性活動性肝炎、肝硬化：慢性活動性肝炎、肝硬化：白蛋白降低，白蛋白降低，、球蛋白球蛋白升高；升高；急性炎癥：急性炎癥：1 1、2 2球蛋白升高球蛋白升高；慢性炎癥：慢性炎癥：白蛋白降低、白蛋白降低、2 2、球蛋白升高；球蛋白升高；紅斑狼瘡、類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎：紅斑狼瘡、類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎：白蛋白降低，白蛋白降低，球蛋白顯著球蛋白顯著升高；升高；多發(fā)性骨髓瘤：多發(fā)性骨髓瘤：白蛋白降低，白蛋白降低，球蛋白升高，球蛋白升高， 和和球蛋白區(qū)帶之間出現(xiàn)球蛋白區(qū)帶之間出現(xiàn)“M”M”帶。帶。七、注意事項七、注意

14、事項1.保持薄膜清潔，保持薄膜清潔， 勿用手指勿用手指接觸薄膜表面，以免油污接觸薄膜表面，以免油污或污物沾上，影響電泳結(jié)果。或污物沾上，影響電泳結(jié)果。2.加樣時一定要呈直線、垂直、分布均勻，這樣泳動加樣時一定要呈直線、垂直、分布均勻，這樣泳動的區(qū)帶整齊、不歪。的區(qū)帶整齊、不歪。 4.染色的同時也是蛋白質(zhì)的固定，所以，染色的同時也是蛋白質(zhì)的固定，所以，不要將很多不要將很多蛋白條重疊在一起蛋白條重疊在一起。3.注意薄膜正負極不要搭反，注意簿膜的正反不要放反。注意薄膜正負極不要搭反，注意簿膜的正反不要放反。放的時候注意血樣不要與濾紙接觸了。放的時候注意血樣不要與濾紙接觸了。5.通電完畢時，必須切斷電

15、源，以防觸電事故。通電完畢時，必須切斷電源，以防觸電事故。注意事項注意事項1.保持薄膜清潔，務(wù)必戴上塑料手套，保持薄膜清潔，務(wù)必戴上塑料手套，勿用手指勿用手指接觸薄膜表面，以免油污或污物接觸薄膜表面，以免油污或污物沾上，影響電泳結(jié)果。沾上，影響電泳結(jié)果。2.注意醋酸纖維膜的質(zhì)量，至少浸泡注意醋酸纖維膜的質(zhì)量，至少浸泡10分鐘，浸泡很久仍有大塊白色硬點者須棄分鐘，浸泡很久仍有大塊白色硬點者須棄之不用。之不用。3.加樣時一定要呈直線、垂直、分布均勻，這樣泳動的區(qū)帶整齊、不歪。加樣時一定要呈直線、垂直、分布均勻，這樣泳動的區(qū)帶整齊、不歪。4.電泳槽兩邊的緩沖液應(yīng)保持液面在同一水平面上，槽里的緩沖液要

16、保持清潔。電泳槽兩邊的緩沖液應(yīng)保持液面在同一水平面上，槽里的緩沖液要保持清潔。5.電泳電壓大小，時間長短與緩沖液的離子強度都有一定的關(guān)系。一般電流約電泳電壓大小，時間長短與緩沖液的離子強度都有一定的關(guān)系。一般電流約0.40.6mA/cm,電壓電壓110160V，通電時間，通電時間4060min。電壓高，電流大，電泳。電壓高，電流大，電泳速度加快，時間可縮短，但薄膜上蒸發(fā)嚴(yán)重，速度加快，時間可縮短，但薄膜上蒸發(fā)嚴(yán)重，電泳圖譜出現(xiàn)條痕，電泳圖譜出現(xiàn)條痕，因此不能無限因此不能無限增大電流。增大電流。6.使用使用培養(yǎng)培養(yǎng)皿時要潤洗。皿時要潤洗。7.染色的同時也是蛋白質(zhì)的固定，所以，染色的同時也是蛋白質(zhì)的固定，所以，不要將很多蛋白條重疊在一起不要將很多蛋白條重疊在一起。8.應(yīng)控制染色時間。時間長，薄膜底色不易脫去；時間太短，著色不易區(qū)