如何選擇紫外分光光度計？

1、如何選擇紫外分光光度計？主要考慮光學(xué)構(gòu)造、光譜范圍、樣品類型和分析工具。研究者們有眾多的新紫外光分光光度計可選。自從60年前紫外分光光度計出現(xiàn)在實(shí)驗(yàn)室的工作臺之后，已經(jīng)形成了一種能解決廣泛難題的儀器，從單一波長的測量到高性能多光譜的測量分析?？茖W(xué)家們選擇時需要根據(jù)自己實(shí)驗(yàn)室的需要和目的用途來考慮，光學(xué)構(gòu)造和光源、探測方法、樣品類型和數(shù)據(jù)處理等都是要考慮的因素。光學(xué)構(gòu)造（OPTICAL CONFIGURATION）一般來說，紫外光分光光度計分為單光束和雙光束兩類。顧名思義，單光束型主要是依賴單束光進(jìn)行測量。一束給定波長的光通過對照物，然后再通過實(shí)際樣品溶液，就能得到吸光結(jié)果。雙光束型則是通過一個

2、斬光輪（mirrored chopper wheel）將一束光分成兩束，分別測量對照樣品和實(shí)際樣品?？梢宰钚』馄疲╨amp drift）和減少測量時間。一些雙光型光度計不利用斬光輪，而是利用一種光束分光器來代替，將一束光分成兩束平行的光然后同時測量對照樣品和目的樣品。因?yàn)樵黾恿藴y量的速度，所以雙光束分光光度計在測量一些溶液隨時間動態(tài)變化的研究中大有用處。光源和檢測方法（LIGHT SOURCES AND DETECTION）分光光度計的光譜也是需要考慮的一個重要因素。實(shí)驗(yàn)室研究人員希望省錢購入專門儀器定量核酸、蛋白或者細(xì)菌的生長情況。例如Amersham Biosciences of Pi

3、scataway公司的GeneQuant II能在230、260、280、320、595和600nm的波長下測量樣品。果果需要更大的靈活性，研究者可以考慮一種更高性能的寬光譜儀器，可以程序性地進(jìn)行ELISAs分析和比色分析。紫外分光光度計一般覆蓋190nm和380nm波長，通常利用氘燈照明。一些特殊的儀器可以提供滿足光子學(xué)和半導(dǎo)體研究需要的光譜范圍。 Varian of Palo Alto公司的Cary Deep UV和Hitachi High Technologies of Tokyo的U-7000 Automated Vacuum UV System就是這樣的儀器。一些儀器具有多種光源供選

4、擇：紫外光、可見光和甚至紅外光（780 nm 至3,000 nm）。鎢燈和鹵素?zé)粢话阒桓采w可見光部分（大約380 nm 到800 nm）。而氙燈則可以覆蓋紫外光和可見光區(qū)域。分光光度計的帶寬（bandwidth）很大程度上依賴于單色儀的狹縫的寬度?？梢酝渡涑鰧?shí)驗(yàn)精確要求的光譜。一種嚴(yán)格帶寬使得儀器能對復(fù)雜的混合物進(jìn)行高分辨率的吸光測量。可變的單色儀的狹縫寬度能使一臺分光光度計滿足多種實(shí)驗(yàn)需要。為了測量吸光值，分光光度計制造商通常使用光電倍增管（photo-multiplier tubes，PMTs）和光敏二極管。PMTs提供快速的反應(yīng)時間和良好的靈敏度，并且可以在紫外光譜調(diào)節(jié)至特定的范圍。但一

5、些制造商依賴于光敏二極管的動態(tài)范圍在數(shù)秒內(nèi)行使所有的光譜測量。樣品類型（SAMPLE FORMAT）在大部分的樣品類型中，分光光度計可接受樣品孔、小玻璃管cuvette、吸漿管和微孔板。微孔板主要是滿足高通量的需要和大規(guī)模的實(shí)驗(yàn)室需求。但盡管對于小實(shí)驗(yàn)室來說，制造商仍然提供了多種容器轉(zhuǎn)換器來滿足通量的要求和減少實(shí)驗(yàn)時間。用小試管cuvette裝樣品容量一般從1 l-5ml，并且一些儀器裝備了各種樣品固定物來滿足各種改變需要。體現(xiàn)了柔韌性。數(shù)據(jù)管理（DATA MANAGEMENT）大部分單機(jī)型的分光光度計包含了驅(qū)動儀器運(yùn)行和管理數(shù)據(jù)的軟件。高性能的儀器，通常與PC機(jī)一起聯(lián)用，需要從制造商提供額外

6、的軟件。同時用戶也可以選擇升級軟件以滿足他們的需要。另外一個值得考慮的因素是數(shù)據(jù)的最終使用。各獨(dú)立實(shí)驗(yàn)室都有各自感興趣的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。例如一些藥物機(jī)構(gòu)需要考慮美國FDA的要求和歐聯(lián)盟的藥物評價機(jī)構(gòu)的要求選擇不同的數(shù)據(jù)處理方式。紫外可見分光光度計常見故障的排除一 光源部分：（1）故障：鎢燈不亮；原因：鎢燈燈絲燒斷（此種原因幾率最高）；檢查：鎢燈兩端有工作電壓，但燈不亮；取下鎢燈用萬用表電阻檔檢測。處置：更換新鎢燈；（2）故障：鎢燈不亮；原因：沒有點(diǎn)燈電壓；檢查：保險絲被熔斷；處置：更換保險絲，（如更換后再次燒斷則要檢查供電電路）；（3）故障：氘燈不亮；原因：氘燈壽命到期（此種原因幾率最高）；檢查：燈

7、絲電壓、陽極電壓均有，燈絲也可能未斷（可看到燈絲發(fā)紅）；處置：更換氘燈；（4）故障：氘燈不亮；原因：氘燈起輝電路故障；檢查：氘燈在起輝的過程中，一般是燈絲先要預(yù)熱數(shù)秒鐘，然后燈的陽極與陰極間才可起輝放電，如果燈在起輝的開始瞬間燈內(nèi)閃動一下或連續(xù)閃動，并且更換新的氘燈后依然如此，有可能是起輝電路有故障，燈電流調(diào)整用的大功率晶體管損壞的幾率最大。處置：需要專業(yè)人士修理；二信號部分：（1）故障：沒有任何檢測信號輸出；原因：沒有任何光束照射到樣品室內(nèi)；檢查：將波長設(shè)定為530nm，狹縫盡量開到最寬檔位，在黑暗的環(huán)境下用一張白紙放在樣品室光窗出口處，觀察白紙上有無綠光斑影像；處置：檢查光源鏡是否轉(zhuǎn)到位？

8、雙光束儀器的切光電機(jī)是否轉(zhuǎn)動了（耳朵可以聽見電機(jī)轉(zhuǎn)動的聲音）？（2）故障：樣品室內(nèi)無任何物品的情況下，全波長范圍內(nèi)基線噪聲大；原因：光源鏡位置不正確、石英窗表面被濺射上樣品；檢查：觀察光源是否照射到入射狹縫的中央？石英窗上有無污染物？處置：重新調(diào)整光源鏡的位置，用乙醇清洗石英窗；（3）故障：樣品室內(nèi)無任何物品的情況下，僅僅是紫外區(qū)的基線噪聲大；原因：氘燈老化、光學(xué)系統(tǒng)的反光鏡表面劣化、濾光片出現(xiàn)結(jié)晶物；檢查：可見區(qū)的基線較為平坦，斷電后打開儀器的單色器及上蓋，肉眼可以觀察到光柵、反光鏡表面有一層白色霧狀物覆蓋在上面；如果光學(xué)系統(tǒng)正常，最大的可能是氘燈老化，可以通過能量檢查或更換新燈方法加以判斷

9、；處置：更換氘燈、用火棉膠粘取鏡面上的污物或用研磨膏研磨濾光片（注意：此種技巧需要有一定維修經(jīng)驗(yàn)者來實(shí)施）；（4）故障：樣品室放入空白后做基線記憶，噪聲較大，紫外區(qū)尤甚；原因：比色皿表面或內(nèi)壁被污染、使用了玻璃比色皿或空白樣品對紫外光譜的吸收太強(qiáng)烈，使放大器超出了校正范圍；檢查：將波長設(shè)定為250nm，先在不放任何物品的狀態(tài)下調(diào)零，然后將空比色皿插入樣品道一側(cè)，此時吸光值應(yīng)小于0.07Abs；如果大于此值，有可能是比色皿不干凈或使用了玻璃比色皿；同樣方法也可判斷空白溶液的吸光值大??；處置：清洗比色皿，更換空白溶液；（5）故障：吸光值結(jié)果出現(xiàn)負(fù)值（最常見）；原因：沒做空白記憶、樣品的吸光值小于空

10、白參比液；檢查：將參比液與樣品液調(diào)換位置便知；處置：做空白記憶、調(diào)換參比液或用參比液配置樣品溶液；（6）故障：樣品信號重現(xiàn)性不良；原因：排除儀器本身的原因外，最大的可能是樣品溶液不均勻所致；在簡易的單光束儀器中，樣品池架一般為推拉式的，有時重復(fù)推拉不在同一個位置上；檢查：更換一種穩(wěn)定的試樣判定；處置：采取正確的試樣配置手段；修理推拉式樣品架的定位碰珠；（7）故障：做基線掃描或樣品掃描時，基線或信號有一個大的負(fù)脈沖；原因：掃描速度設(shè)置得過快，信號在讀取時，誤將濾光片或光源鏡的切換當(dāng)做信號讀取了；檢查：改變掃描速度；（8）故障：做基線掃描或樣品掃描時，基線或信號有一個長時間段的負(fù)值或滿屏大噪聲；原

11、因：濾光片飼服電機(jī)“失步”，造成檔位錯位，國產(chǎn)電機(jī)尤甚；檢查：重新開機(jī)有可能回復(fù)，或打開單色器對照波長與濾光片的相對位置來檢查（注意：打開單色器時要保護(hù)檢測器不被強(qiáng)光刺激）；處置：更換飼服電機(jī)；（9）故障：樣品出峰位置不對；原因：波長傳動機(jī)構(gòu)產(chǎn)生位移；檢查：通過氘燈的656.1nm的特征譜線來判斷波長是否準(zhǔn)確；處置：對于高檔儀器而言處理手段相對簡單，使用儀器固有的自動校正功能即可；而對于相對簡單的儀器，這種調(diào)整則需要專業(yè)人員來進(jìn)行了；（10）故障：信號的分辨率不夠，具體表現(xiàn)是：本應(yīng)疊加在某一大峰上的小峰無法觀察到；原因：狹縫設(shè)置過窄而掃描速度過快，造成檢測器響應(yīng)速度跟不上，從而失去應(yīng)測到的信號

12、；按常理，一定的狹縫寬度要對應(yīng)一定范圍的掃描速度；或者狹縫設(shè)置得過寬，使儀器的分辨率下降，將小峰融合在大峰里了。檢查：放慢掃描速度看一看或?qū)ⅹM縫設(shè)窄；處置：將掃描速度、狹縫寬窄、時間常數(shù)三者擬合成一個最優(yōu)化的條件；（11）故障：當(dāng)儀器波長固定在某個波長下時，吸光值信號上下擺動，特別是測量模式轉(zhuǎn)換為按鍵開關(guān)式的簡易儀器；原因：開關(guān)觸點(diǎn)因長期氧化所致造成接觸不良；檢查：用手加重力量按琴鍵時，吸光值隨之變化；處置：用金屬活化劑清洗按鍵觸點(diǎn)即可；（12）故障：儀器零點(diǎn)飄忽不定，主要反映在簡易儀器上；原因：在簡易儀器中，零點(diǎn)往往是通過電位器來調(diào)整，這種電位器一般是炭膜電阻制作的，使用久了往往造成接觸不良

13、；處置：更換電位器；分光光度計波長誤差的調(diào)節(jié)方法分光光度計使用一段時間后，一般都會存在一定的 波長誤差。誤差較小時只需調(diào)整波長刻度盤或波長計數(shù) 器，就能使誤差減小到合格范圍內(nèi)；當(dāng)波長誤差較大時， 則不能再簡單地運(yùn)用上述方法進(jìn)行調(diào)整。對于不同類型 的分光光度計。由于單色器色散特性的不同，誤差校正 方法將有較大的區(qū)別。 在棱鏡型儀器波長的長波區(qū)和短波區(qū)，棱鏡變化同 樣位置時，儀器長波區(qū)的波長變化值將大于短波區(qū)的波 長變化值。即在調(diào)整儀器的波長校正螺絲時，引起儀器 波長變化的情況是非線性的。例如當(dāng)調(diào)波長校正螺絲使 儀器650nm處變化(78)nm時，此時儀器400nm處只會變 化lnm左右。利用這一

14、特性，當(dāng)儀器出現(xiàn)較大的非線性誤 差時，就能將儀器波長誤差準(zhǔn)確而迅速地調(diào)整到合格范 圍內(nèi)。         光柵的色散特性是線性的，光柵型儀器的波長誤差一 般都是線性的。波長誤差的調(diào)整方法較為簡單，這里不作 介紹。下面詳細(xì)介紹棱鏡型儀器波長誤差的調(diào)整方法。        方法1：短波區(qū)是負(fù)誤差。長波區(qū)是正誤差時的調(diào)整 例如：某721型儀器短波區(qū)用標(biāo)準(zhǔn)值為4300nm標(biāo)準(zhǔn) 干涉濾光片檢定，A。=一6nm。長波區(qū)用標(biāo)準(zhǔn)值為6830nm 標(biāo)準(zhǔn)干涉濾光片檢

15、定，AA=lOnm。打開儀器上部蓋板，松開波長盤上的3個固定螺絲，將刻度盤向高波長方向 移IAI一1=I一61一l=5nm(注意此時波長盤不能動，只是移 動波長刻度盤位置)。即原波長指示為44O0nm，移動波 長刻度盤后指示為4450nm。然后緊固刻度盤上的3個螺 絲，將儀器調(diào)到長波區(qū)標(biāo)準(zhǔn)濾光片的標(biāo)準(zhǔn)值6830nm處。 將6830nm干涉濾光片放人光路，反時針調(diào)儀器右邊的 波長校準(zhǔn)螺絲，使儀器透射比為最大。再將4300nm干涉 濾光片放人光路，檢查儀器短波區(qū)波長誤差情況，若還 是負(fù)誤差，再用上述方法繼續(xù)調(diào)整；若是正誤差，按下述 方法2繼續(xù)調(diào)整。    &

16、#160;   方法2：短波區(qū)是正誤差。長波區(qū)是負(fù)誤差時的調(diào)整 例如：某721型儀器用上述干涉濾光片檢定后，A。= 70nm，A2=一80nm。此時將儀器波長刻度盤向低波長方 向移A廣1=71=6nm，并緊固刻度盤。再將儀器波長調(diào)到 6830nm處。將6830干涉濾光片放人光路，順時針調(diào)儀器 波長校準(zhǔn)螺絲，使儀器透射比為最大，其他同方法l。 用方法1或方法2將儀器高低端波長誤差減小 到±1nm后。500nm一600nm間的波長誤差將不會很大。該 方法適用于各種棱鏡型紫外和可見分光光度計。讀者可 根據(jù)平時的調(diào)修經(jīng)驗(yàn)參考使用 轉(zhuǎn)貼分析儀器中英文名稱對照儀器中文名稱 儀

17、器英文名稱 英文縮寫原子發(fā)射光譜儀 Atomic Emission Spectrometer AES電感偶合等離子體發(fā)射光譜儀 Inductive Coupled Plasma Emission SpectrometerICP直流等離子體發(fā)射光譜儀 Direct Current Plasma Emission Spectrometer DCP紫外-可見光分光光度計 UV-Visible Spectrophotometer UV-Vis微波等離子體光譜儀 Microwave Inductive Plasma Emission Spectrometer MIP原子吸收光譜儀 Atomic Abso

18、rption Spectroscopy AAS原子熒光光譜儀 Atomic Fluorescence Spectroscopy AFS傅里葉變換紅外光譜儀 FT-IR Spectrometer FTIR傅里葉變換拉曼光譜儀 FT-Raman Spectrometer FTIR-Raman氣相色譜儀 Gas Chromatograph GC高壓/效液相色譜儀 High Pressure/Performance Liquid Chromatography HPLC離子色譜儀 Ion Chromatograph凝膠滲透色譜儀 Gel Permeation Chromatograph GPC體積排阻色

19、譜 Size Exclusion Chromatograph SECX射線熒光光譜儀 X-Ray Fluorescence Spectrometer XRFX射線衍射儀 X-Ray Diffractomer XRD同位素X熒光光譜儀 Isotope X-Ray Fluorescence Spectrometer電子能譜儀 Electron Energy Disperse Spectroscopy能譜儀 Energy Disperse Spectroscopy EDS質(zhì)譜儀 Mass Spectrometer MSICP-質(zhì)譜聯(lián)用儀 ICP-MS ICP-MS氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀 GC-MS G

20、C-MS液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀 LC-MS LC-MS核磁共振波譜儀 Nuclear Magnetic Resonance Spectrometer NMR電子順磁共振波譜儀 Electron Paramagnetic Resonance Spectrometer ESR極譜儀 Polarograph伏安儀 Voltammerter自動滴定儀 Automatic Titrator電導(dǎo)儀 Conductivity MeterpH計 pH Meter水質(zhì)分析儀 Water Test Kits電泳儀 Electrophoresis System表面科學(xué)SurfaceScience電子顯微鏡 Elect

21、ro Microscopy光學(xué)顯微鏡 Optical Microscopy金相顯微鏡Metallurgical Microscopy掃描探針顯微鏡 Scanning Probe Microscopy表面分析儀 Surface Analyzer無損檢測儀 Instrument for Nondestructive Testing物性分析 Physical PropertyAnalysis熱分析儀 Thermal Analyzer粘度計 Viscometer流變儀 Rheometer粒度分析儀 Particle Size Analyzer熱物理性能測定儀 Thermal Physical Prop

22、erty Tester電性能測定儀 Electrical Property Tester光學(xué)性能測定儀 Optical Property Tester機(jī)械性能測定儀 Mechanical Property Tester燃燒性能測定儀 Combustion Property Tester老化性能測定儀 Aging Property Tester生物技術(shù)分析 Biochemical analysisPCR儀 Instrument for Polymerase Chain Reaction PCRDNA及蛋白質(zhì)的測序和合成儀 SequencersandSynthesizers for DNA and Protein傳感器 Sensors其他 Other/Miscellaneous流動分析與過程分析 Flow Analytical and Process Analytical Chemistry氣體分析 Gas Analysis基本物理量測定 BasicPhysics樣品處理 Sample Handling金屬/材料元素分析儀 Metal/material elemental analysis環(huán)境成分分析儀 CHN Analysis發(fā)酵罐 Fermenter生物反應(yīng)器 Bio-reactor搖床 Sha