2019年各種微生物生化試驗(yàn)方法原理.doc

1、各種微生物生化試驗(yàn)方法原理通常利用生化試驗(yàn)的方法，檢測細(xì)菌對各種物質(zhì)的代謝作用及其代謝產(chǎn)物，稱為細(xì)菌的生化反應(yīng)，常用于細(xì)菌的鑒別。（ 1） 分解產(chǎn)物（ 1 ） 糖發(fā)酵試驗(yàn)（ carbohydrate fermentation test） 不同種類的細(xì)菌對糖的分解利用能力不同，一般以能否分解某種糖，是否產(chǎn)酸產(chǎn)氣等現(xiàn)象來鑒別。例如大腸桿菌能分解葡萄糖和乳糖，產(chǎn)酸且產(chǎn)氣；而傷寒桿菌只分解葡萄糖產(chǎn)酸不產(chǎn)氣，且不分解乳糖。這是因?yàn)榇竽c桿菌分解葡萄糖等產(chǎn)生甲酸，經(jīng)甲酸解氫酶的作用生成H2 和 CO2。而傷寒桿菌無此酶，故分解葡萄糖只產(chǎn)酸不產(chǎn)氣。（ 2） VP 試驗(yàn)（ Voges-Proskauer tes

2、t）產(chǎn)氣桿菌將分解葡萄糖產(chǎn)生的兩分子丙酮酸脫羧，生成一分子乙酰甲基甲醇。乙酰甲基甲醇在堿性溶液中被空氣中氧氣氧化，生成二乙酰，二乙?？膳c培養(yǎng)液中含胍基的化合物（如蛋白胨中的精氨酸）反應(yīng)，生成紅色的化合物，此為VP 試驗(yàn)陽性。大腸桿菌分解葡萄糖不生成乙酰甲基甲醇，故VP 試驗(yàn)陰性。（ 3） 甲基紅試驗(yàn)（ methyl red test） 大腸桿菌和產(chǎn)氣桿菌均屬G-短桿菌，且都能分解葡萄糖、乳糖產(chǎn)酸產(chǎn)氣，二者不易區(qū)別。但兩者所產(chǎn)生的酸類和總酸量不一：大腸桿菌可產(chǎn)生甲酸、乙酸、乳酸、琥珀酸等，而產(chǎn)氣桿菌只產(chǎn)生甲酸、乙醇及乙酰甲基甲醇。故大腸桿菌培養(yǎng)液PH 在 4.5 以下，加入甲基紅指示劑呈紅色，為

3、甲基紅試驗(yàn)陽性；產(chǎn)氣桿菌培養(yǎng)液PH 在 5.4以上，加入甲基紅后呈桔黃色，為甲基紅試驗(yàn)陰性。（ 4）枸櫞酸鹽利用試驗(yàn)（citrate utilization test ） 產(chǎn)氣桿菌在以枸櫞酸鹽為唯一碳源的培養(yǎng)基上生長，分解枸櫞酸鹽產(chǎn)生CO2，并轉(zhuǎn)變?yōu)樘妓猁}，使培養(yǎng)基由中性變?yōu)閴A性，含溴麝香草酚藍(lán)（BTB ）指示劑的培養(yǎng)基由淡綠色變?yōu)樯钐m色，此為枸櫞酸鹽利用試驗(yàn)陽性。大腸桿菌不能利用枸櫞酸鹽，故在此培養(yǎng)基上不能生長，培養(yǎng)基仍為綠色。2、蛋白質(zhì)及氨基酸的分解產(chǎn)物（ 1 ）硫化氫試驗(yàn)（hydrogen sulfide test ） 有些細(xì)菌能分解培養(yǎng)基中的含硫氨基酸（如胱氨酸、甲硫氨酸等）產(chǎn)生H2S

4、，如遇醋酸鉛或硫酸亞鐵，能生成黑色的硫化物，為硫化氫試驗(yàn)陽性。本試驗(yàn)常用于區(qū)別腸道桿菌的種類。沙門氏菌屬通常為陽性;大腸桿菌、產(chǎn)氣桿菌、志賀氏菌為陰性。（ 2）明膠液化試驗(yàn)（gelatin liguefaction test ） 有些細(xì)菌具有明膠酶，能分解明膠使其失去凝固能力而液化。變形桿菌、霍亂弧菌、綠膿桿菌、枯草桿菌等能液化明膠；大腸桿菌、沙門氏菌則不能。（ 3）吲哚試驗(yàn)（indole test）有些細(xì)菌含有色氨酸酶，能分解蛋白胨中的色氨酸生成無色吲哚，加入對-二甲基氨基苯甲醛，無色吲哚生成紅色玫瑰吲哚，為吲哚試驗(yàn)陽性。大腸桿菌、霍亂弧菌等吲哚試驗(yàn)陽性；產(chǎn)氣桿菌、傷寒沙門氏菌為吲哚試驗(yàn)陰性

5、。吲哚 對二甲基氨基苯甲醛玫瑰吲哚細(xì)菌的生化反應(yīng)是鑒別細(xì)菌的重要手段：其中吲哚試驗(yàn)（ I） 、甲基紅試驗(yàn)（ M） 、 VP 試驗(yàn) （V）和枸櫞酸鹽利用試驗(yàn)（C） ，簡稱為IMVIC 試驗(yàn)，常用于大腸桿菌與產(chǎn)氣桿菌的鑒別。典型的大腸桿菌的IMViC 試驗(yàn)結(jié)果為“+-”，而產(chǎn)氣桿菌是“-+”。（ 票 票數(shù)實(shí)驗(yàn)四、微生物的快速鑒定和自動化分析技術(shù)如何使微生物學(xué)技術(shù)方法快速、準(zhǔn)確、簡易和自動化，一直是微生物學(xué)工作者研究的熱點(diǎn)，尤其是臨床醫(yī)學(xué)方面，對微生物的快速準(zhǔn)確鑒定，更是"時間就是生命"。近 20 多年來，隨著微電子、計算機(jī)、 分子生物學(xué)、物理、 化學(xué)等先進(jìn)技術(shù)向微生物學(xué)的滲透和

6、多學(xué)科的交叉，這方面已取得了突破性進(jìn)展，許多快速、準(zhǔn)確、敏感、簡易、自動化的方法技術(shù)，不僅在微生物鑒定中廣為使用，而且在微生物學(xué)的其它方面也被采用，推動了微生物學(xué)的迅速發(fā)展。一、微量多項試驗(yàn)鑒定系統(tǒng)該系統(tǒng)的根本原理是根據(jù)微生物生理生化特征鑒定的結(jié)果，而進(jìn)行的數(shù)碼分類鑒定。這種技術(shù)也稱為簡易診檢技術(shù)，或數(shù)碼分類鑒定法。它是針對微生物的生理生化特征，配制各種培養(yǎng)基、 反應(yīng)底物、試劑等，分別微量 （約 0.1ml ） 加入各個分隔室中（或用小圓紙片吸收），冷凍干燥脫水或不干燥脫水，各分隔室在同一塑料條或板上構(gòu)成檢測卡。試驗(yàn)時加入待檢測的某一種菌液，培養(yǎng)248 小時，觀察鑒定卡上各項反應(yīng)，按判定表判定

7、試驗(yàn)結(jié)果，用此結(jié)果編碼，查檢索表（根據(jù)數(shù)碼分類鑒定的原理編制成），得到鑒定結(jié)果，或?qū)⒕幋a輸入計算機(jī)，用根據(jù)數(shù)碼分類鑒定原理編制的軟件鑒定，打印出結(jié)果。微量多項試驗(yàn)鑒定系統(tǒng)已廣泛用于動、植物檢疫、臨床檢驗(yàn)、食品衛(wèi)生、藥品檢查、環(huán)境監(jiān)測、發(fā)酵控制、生態(tài)研究等方面，尤其是臨床檢驗(yàn)中深受歡迎，迅猛發(fā)展。國際上此技術(shù)的產(chǎn)品， 或稱系統(tǒng)，種類繁多，國內(nèi)有河南開封醫(yī)學(xué)生物研究所的腸桿菌科細(xì)菌鑒定卡E-15 ；上海市衛(wèi)生防疫站的發(fā)酵性革蘭氏陰性桿菌鑒定系統(tǒng)SWF-A ；中國人民解放軍一八一醫(yī)院的厭氧菌快速生化鑒定系列ARB-ID ； 深圳華士達(dá)生物科技有限公司的腸桿菌科的細(xì)菌生化鑒定卡 ENT 等。國外的產(chǎn)品

8、已標(biāo)準(zhǔn)化、系統(tǒng)化和商品化，主要有法國生物-梅里埃集團(tuán)的API/ATB ；瑞士羅氏公司的Micro-ID ， Enterotube,Minitek ；美國的Biolog 全自動和手動細(xì)菌鑒定系統(tǒng)：日本的微孔濾膜塊等，其中API/ATB 包括眾多的鑒定系統(tǒng)，共計有750種反應(yīng)，可鑒定幾乎所有常見的細(xì)菌。微量多項鑒測技術(shù)優(yōu)點(diǎn)突出，不僅能快速、敏感、準(zhǔn)確、重復(fù)性好地鑒檢微生物，而且簡易，節(jié)省人力、物力、時間和空間，缺點(diǎn)是各系統(tǒng)差異較大， 有的價格貴，有的個別反應(yīng)不準(zhǔn)，難判定，但毫無疑問，它是微生物技術(shù)方法向快速、簡易和自動化發(fā)展的重要方向之一。API20E 系統(tǒng)是 API/ATB 中最早和最重要的產(chǎn)品

9、，也是國際上應(yīng)用最多的系統(tǒng)。該系統(tǒng)的鑒定卡是一塊有20 個分隔室的塑料條，分隔室由相連通的小管和小環(huán)組成，各小管中含不或底物等，每一分隔室可進(jìn)行一種生化反應(yīng)，個別的分隔室可進(jìn)行兩種反應(yīng)，主要用來鑒定腸桿菌科細(xì)菌，如圖1 所示。1 API 20E 鑒定卡示意圖鑒定未知細(xì)菌的主要過程：將菌液加入每一個分隔室；培養(yǎng)后，有的分隔室的小杯中需要添加試劑，觀察鑒定卡上20 個分隔室中的反應(yīng)變色情況，根據(jù)反應(yīng)判定表（表1 ），判定各項反應(yīng)是陽性還是陰性反應(yīng)；按鑒定卡上反應(yīng)項目從左到右的順序，每三個反應(yīng)項目編為一組，共編為七組，每組中每個反應(yīng)項目定為一個數(shù)值，依次是1 、 2 、 4，各組中試驗(yàn)結(jié)果判定的反應(yīng)

10、是陽性者記" "，則寫下其所定的數(shù)值，反應(yīng)陰性者記" "，則寫為0，每組中的數(shù)值相加，便是該組的編碼數(shù)，這樣便形成了7 位數(shù)字的編碼，表 2 為舉例說明；用 7位數(shù)字的編碼查API20E 系統(tǒng)的檢索表，或輸入計算機(jī)檢索，則能將檢驗(yàn)的細(xì)菌鑒定出是什么菌種或生物型。表 1 API20E 反應(yīng)判定表鑒定卡上的反應(yīng)項目反 應(yīng) 結(jié) 果代號項目名稱陰性陽性O(shè)NPN - 半乳糖苷酶無色黃ADH精氨酸水解黃綠紅，橘紅LDC賴氨酸脫羧黃綠紅，橘紅ODC鳥氨酸脫羧黃綠紅，橘紅CIT枸椽酸鹽利用黃綠綠藍(lán)HS產(chǎn) H2S無色黑色沉淀URE尿素酶黃紅紫TDA色胺酸脫氨酶黃紅紫IND

11、吲哚形成黃綠紅VPV.P. 試驗(yàn)無色紅GEL蛋白酶黑粒黑液GLU葡萄糖產(chǎn)酸藍(lán)黃綠MAN甘露醇產(chǎn)酸藍(lán)黃綠INO肌醇產(chǎn)酸藍(lán)黃綠SOR山梨醇產(chǎn)酸藍(lán)黃綠RHA鼠李糖產(chǎn)酸藍(lán)黃綠SAC蔗糖產(chǎn)酸藍(lán)黃綠MEL密二糖產(chǎn)酸黃綠AMY淀粉產(chǎn)酸藍(lán)黃綠ARA阿拉伯糖產(chǎn)酸藍(lán)黃綠表 2 API20E 舉例說明項目名ONPG ADH LDC ODC CIT H 2SURE TDA IND VP GEL GLU MAN INO SORRHA SAC MEL AMY所定數(shù)試驗(yàn)結(jié)記下數(shù)編碼檢索結(jié)5305773產(chǎn)氣腸桿菌（Enterobacter aerogenes實(shí)驗(yàn)五、抗微生物藥物敏感性試驗(yàn)一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康目刮⑸锼幬锩舾行栽囼?yàn)（藥

12、敏試驗(yàn)）的主要目的檢出細(xì)菌的耐藥性，預(yù)測抗微生物藥物的臨床治療效果，并為臨床醫(yī)生針對某一特定的臨床感染選用藥物提供依據(jù)。對所有臨床分離的可疑致病菌，如不能從該菌的種屬特征可靠地推知其對抗菌藥物的敏感性，就需要進(jìn)行藥敏試驗(yàn)。紙片擴(kuò)散法此法是臨床和實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)化研究所（CLSI/NCCLS ）所推薦的臨床微生物理學(xué)室常規(guī)開展的藥敏試驗(yàn)方法。將含有定量抗菌藥物的紙片（藥敏紙片）貼在已接種待檢菌的瓊脂平板表面特定部位。藥物借其分子的擴(kuò)散力向周圍瓊脂中擴(kuò)散，形成了隨著離紙片距離加大，瓊脂中的藥物濃度逐漸減少的梯度濃度。其紙片周圍一定區(qū)域瓊脂內(nèi)的藥物濃度高于抑制待檢菌所需濃度時，則該區(qū)域內(nèi)細(xì)胞不能生長，形成

13、透明抑制圈。抑菌圈的大小可以反映待檢對測定藥物的敏感程度，并與該藥對待檢菌的最低抑菌濃度（MIC ）呈負(fù)相關(guān)，即抑菌圈愈大，MIC 愈小。三、實(shí)驗(yàn)器材和試劑1 菌種 金黃色葡萄球菌ATCC25923 、大腸埃希菌ATCC25922 、銅綠假單胞菌ATCC27853 或臨床分離的菌株。2 培養(yǎng)基MH （ Mueller-Hintion ）瓊脂。3 試劑 無菌生理鹽水，0.5 麥?zhǔn)蠘?biāo)準(zhǔn)比濁管（McFarlandstandard ，相當(dāng)于1.5 × 108CFU/ml ），抗菌藥物紙片：選用直徑6.35mm 吸水量 20l的專用藥敏紙片，包括阿米卡星（AMK ）、青霉素（PEN）、氨芐西林

14、（AMP ）、哌拉西林（ PIP）、頭孢唑啉（FZN ）、頭孢呋辛（FRX）、頭孢他啶（CAZ ）、頭孢他啶/棒酸（ CD03 ）、氨曲南（ATM ）、亞胺培南（IMP ）、環(huán)丙沙星（CIP ）、萬古霉素（VAN ）、克林霉素（CLI ）、復(fù)方新諾明（SXT ）。4 其他 無菌棉拭子、鑷子、毫米尺、接種環(huán)。四、方法步驟1 菌液制備（ 1 ）對數(shù)生長法：從瓊脂平板上選取至少3-5 個形態(tài)特征一致的菌落，用接種環(huán)轉(zhuǎn)移至含45ml 的肉湯培養(yǎng)管（如胰酶消化大豆肉湯）中，35 孵育 2-6h 。用無菌鹽水或肉湯調(diào)整菌液濁度相當(dāng)于0.5 麥?zhǔn)蠘?biāo)準(zhǔn)。（ 2 ） 直接菌落法：從孵育 18-24h 的非選擇性

15、培養(yǎng)基（如血瓊脂）平板上， 挑取單個菌落，直接用肉湯或無菌鹽水制成0.5 麥?zhǔn)蠘?biāo)準(zhǔn)濁度的懸液。2 接種 細(xì)菌懸液制備后15min 內(nèi)接種至MH 瓊脂平板。用無菌棉拭醮取菌懸液，在管內(nèi)壁液面上方旋轉(zhuǎn)緊壓，將多余菌液擠去，最后沿平板內(nèi)緣涂抹一周。3 貼藥敏紙片涂布后的平板在室溫下干燥3-5min ，用紙片分配器或無菌鑷子將紙片貼于瓊脂表面并輕壓，使紙片與瓊脂表面完成接觸。各紙片中心相距應(yīng)大于24mm ，紙片貼上后就不能再移動位置。4 孵育將平板倒置放入35 孵箱（苛養(yǎng)菌敏平板應(yīng)放置于5%-10%CO2 環(huán)境中），16-18h 讀取結(jié)果，葡萄球菌和腸球菌必須孵育24h 以檢測對苯唑西林和萬古霉素的耐

16、藥性。五、結(jié)果判斷抑菌圈的直徑（包含紙片的直徑），以毫米數(shù)報告（取整數(shù)）。根據(jù)CLSI 判定標(biāo)準(zhǔn)測量抑菌圈直徑大小可以判斷細(xì)菌對該抗生素是敏感、中介還是耐藥。敏感（S）：表示常規(guī)劑量的測定藥物在體內(nèi)所達(dá)到的濃度能抑制或殺滅待測菌。中介（I ）：不是敏感性的度量，而是一個“緩沖區(qū) ”，用以防止因微小的技術(shù)因素失控導(dǎo)致的結(jié)果偏差，因而其臨床意義是不確定的，故不應(yīng)作臨床報告。耐藥（R）：表示常規(guī)劑量的測定藥物在體內(nèi)達(dá)到有效濃度時不能抑制待測菌生長。六、藥敏試驗(yàn)結(jié)果判斷注意事項（ 1 ）藥敏試驗(yàn)的結(jié)果容易受培養(yǎng)基、抗菌藥物、孵育條件等多種因素影響，實(shí)驗(yàn)室開展藥敏試驗(yàn)時應(yīng)定期用標(biāo)準(zhǔn)菌株對上述因素進(jìn)行質(zhì)量

17、控制。（ 2 ）變形桿菌屬的菌株可擴(kuò)散到某些抗菌藥物的抑菌圈內(nèi)，所以在明顯的抑菌圈內(nèi)有薄膜樣爬行生長可以忽略。（ 3 ）對于鏈球菌應(yīng)檢測生長抑制圈而不是溶血抑制圈。對于甲氧芐啶和磺胺，拮抗物可使細(xì)菌輕微生長，所以抑菌圈直徑的檢測不考慮細(xì)微生長的部分（生長菌苔的20% 或以下）而測量比較明顯的邊緣。（ 4 ）對于沙門菌屬和志賀菌屬的分離株只有氨芐西林、一種喹諾酮類藥物和磺胺甲唑/ 甲氧芐啶可用于常規(guī)試驗(yàn)和報告，第一、 第二代頭孢菌素和氨基糖苷類抗生素體外可能對這些菌株有活性，但臨床卻無效，所以對上述藥物不應(yīng)報告為敏感。（ 5 ）沙門菌屬的腸道外分離株應(yīng)測試并報告氯霉素和一種三代頭孢菌素的敏感性。

18、（ 6 ）腸球菌屬對頭孢菌素類、氨基糖苷類（僅篩選高水平耐藥性）、磺胺甲唑 / 甲氧芐啶和克林霉素在體外可能有活性，但在臨床上耐藥，所以不能報告對這些藥物敏感。七、影響藥敏結(jié)果的因素1. 培養(yǎng)基：應(yīng)根據(jù)試驗(yàn)菌的營養(yǎng)需要進(jìn)行配制。傾注平板時，厚度合適（約5-6mm ），不可太薄，一般90mm 直徑的培養(yǎng)皿，傾注培養(yǎng)基18-20ml 為宜。培養(yǎng)基內(nèi)應(yīng)盡量避免有抗菌藥物的拮抗物質(zhì)，如鈣、 鎂離子能減低氨基糖苷類的抗菌活性，胸腺嘧啶核苷和對氨苯甲酸（ PABA ）能拮抗磺胺藥和TMP 的活性。2. 細(xì)菌接種量：細(xì)菌接種量應(yīng)恒定，如太多，抑菌圈變小，能產(chǎn)酶的菌株更可破壞藥物的抗菌活性。3. 藥物濃度：藥

19、物的濃度和總量直接影響抑菌試驗(yàn)的結(jié)果，需精確配制。商品藥應(yīng)嚴(yán)格按照其推薦治療量配制。4. 培養(yǎng)時間：一般培養(yǎng)溫度和時間為37 8-18 小時，有些抗菌藥擴(kuò)散慢如多粘菌素，可將已放好抗菌藥的平板培養(yǎng)基，先置 4 冰箱內(nèi)2-4 小時， 使抗菌藥預(yù)擴(kuò)散，然后再放37 溫箱中培養(yǎng)，可以推遲細(xì)菌的生長，而得到較大的抑菌圈。八、思考題1. 操作藥敏試驗(yàn)并說出注意事項。2. 試述藥敏試驗(yàn)的意義？3. 如何根據(jù)藥敏試驗(yàn)的結(jié)果選擇藥物？4. 什么叫抑菌圈？如何根據(jù)抑菌圈大小判斷細(xì)菌對藥物的敏感度？實(shí)驗(yàn)六、微生物的生理生化反應(yīng)微生物生理生化反應(yīng)的多樣性在自然界產(chǎn)生了兩種結(jié)果: 第一是使自然界的有機(jī)分子都有可能得到

20、分解; 第二是使不同微生物之間有了互相作用和互相依賴的基礎(chǔ). 例如 ,一種微生物能利用另一種微生物所分解的產(chǎn)物, 或者一種微生物的產(chǎn)物可抑制或殺死另一種微生物.所以微生物的生理生化反應(yīng)也被作為細(xì)菌鑒定和分類的內(nèi)容。一、大分子物質(zhì)的水解試驗(yàn)（ 一 ） 目的要求1. 證明不同微生物對各種有機(jī)大分子的水解能力不同,從而說明不同微生物有著不同的酶系統(tǒng)。2. 掌握進(jìn)行微生物大分子水解試驗(yàn)的原理和方法。（ 二 ） 基本原理微生物對大分子的淀粉, 蛋白質(zhì)和脂肪不能直接利用,必須靠產(chǎn)生的胞外酶將大分子物質(zhì)分解才能被微生物吸收利用.胞外酶主要為水解酶,通過加水裂解大的物質(zhì)為較小的化合物,使其能被運(yùn)輸至細(xì)胞內(nèi).

21、如淀粉酶水解淀粉為小分子的糊精, 雙糖和單糖; 脂肪酶水解脂肪為甘油和脂肪酸; 蛋白酶水解蛋白質(zhì)為氨基酸等. 這些過程均可通過觀察細(xì)菌菌落周圍的物質(zhì)變化來證實(shí): 淀粉遇碘液會產(chǎn)生藍(lán)色, 但細(xì)菌水解淀粉的區(qū)域,用碘測定不再產(chǎn)生藍(lán)色,表明細(xì)菌產(chǎn)生淀粉酶. 脂肪水解后產(chǎn)生脂肪酸可改變培養(yǎng)基的pH, 使 pH 降低 ,加入培養(yǎng)基的中性紅指示劑會使培養(yǎng)基從淡紅色變?yōu)樯罴t色, 說明胞外存在著脂肪酶。微生物可以利用各種蛋白質(zhì)和氨基酸作為氮源外, 當(dāng)缺乏糖類物質(zhì)時, 亦可用它們作為碳源和能源 . 明膠是由膠原蛋白經(jīng)水解產(chǎn)生的蛋白質(zhì), 在 25 以下可維持凝膠狀態(tài), 以固體形式存在 . 而在 25 以上明膠就會

22、液化. 有些微生物可產(chǎn)生一種稱作明膠酶的胞外酶, 水解這種蛋白質(zhì) , 而使明膠液化, 甚至在4 仍能保持液化狀態(tài)。還有些微生物能水解牛奶中的蛋白質(zhì)酪素, 酪素的水解可用石蕊牛奶來檢測. 石蕊培養(yǎng)基由脫脂牛奶和石蕊組成, 是昏濁的藍(lán)色.酪素水解成氨基酸和肽后,培養(yǎng)基就會變得透明.石蕊牛奶也常被用來檢測乳糖發(fā)酵,因?yàn)樵谒岽嬖谙?石蕊會轉(zhuǎn)變?yōu)榉奂t色,而過量的酸可引起牛奶的固化 （凝乳形成）. 氨基酸的分解會引起堿性反應(yīng),使石蕊變?yōu)樽仙?此外 ,某些細(xì)菌能還原石蕊 , 使試管底部變?yōu)榘咨?。尿素是由大多?shù)哺乳動物消化蛋白質(zhì)后被分泌在尿中的廢物. 尿素酶能分解尿素釋放出氨,這是一個分辨細(xì)菌很有用的診斷實(shí)驗(yàn)

23、. 盡管許多微生物都可以產(chǎn)生尿素酶, 但它們利用尿素的速度比變形桿菌屬（Proteus） 的細(xì)菌要慢, 因此尿素酶試驗(yàn)被用來從其他非發(fā)酵乳糖的腸道微生物中快速區(qū)分這個屬的成員. 尿素瓊脂含有蛋白胨, 葡萄糖 , 尿素和酚紅. 酚紅在pH6.8 時為黃色,而在培養(yǎng)過程中,產(chǎn)生尿素酶的細(xì)菌將分解尿素產(chǎn)生氨,使培養(yǎng)基的pH 升高 , 在 pH 升至 8.4 時 ,指示劑就轉(zhuǎn)變?yōu)樯罘奂t色。（ 三 ） 器材1. 菌種 枯草芽胞桿菌, 大腸桿菌,金黃色葡萄球菌,銅綠假單胞菌(Pseudomonasaeruginosa), 普通變形桿菌。2. 培養(yǎng)基 固體油脂培養(yǎng)基,固體淀粉培養(yǎng)基,明膠培養(yǎng)基試管,石蕊牛奶

24、試管,尿素瓊脂試管。3. 溶液或試劑革蘭氏染色用盧戈氏碘液(Lugol's iodine solution) 。4. 儀器或其他用具無菌平板, 無菌試管, 接種環(huán) , 接種針 , 試管架。( 四 ) 操作步驟1. 淀粉水解試驗(yàn)(1) 將固體淀粉培養(yǎng)基溶化后冷卻至50 左右 , 無菌操作制成平板。(2) 用記號筆在平板底部劃成四部分。(3) 將枯草芽孢桿菌, 大腸桿菌, 金黃色葡萄球菌, 銅綠假單胞菌分別在不同的部分劃線接種,在平板的反面分別在四部分寫上菌名。(4) 將平板倒置在37 溫箱中培養(yǎng)24h 。(5) 觀察各種細(xì)菌的生長情況, 將平板打開蓋子, 滴入少量Lugol's

25、碘液于平皿中, 輕輕旋轉(zhuǎn)平板 , 使碘液均勻鋪滿整個平板。如菌苔周圍出現(xiàn)無色透明圈, 說明淀粉己被水解,為陽性.透明圈的大小可初步判斷該菌水解淀粉能力的強(qiáng)弱, 即產(chǎn)生胞外淀粉酶活力的高低。2. 油脂水解試驗(yàn)(1) 將溶化的固體油脂培養(yǎng)基冷卻至50 左右時, 充分搖蕩, 使油脂均勻分布. 無菌操作倒入平板 , 待凝。(2) 用記號筆在平板底部劃成四部分, 分別標(biāo)上菌名。(3) 將上述四種菌分別用無菌操作劃+ 字接種于平板的相對應(yīng)部分的中心。(4) 將平板倒置,于 37 溫箱中培養(yǎng)24h 。(5) 取出平板, 觀察菌苔顏色, 如出現(xiàn)紅色斑點(diǎn)說明脂肪水解, 為陽性反應(yīng)。3. 明膠水解試驗(yàn)(1) 取三

26、支明膠培養(yǎng)基試管, 用記號筆標(biāo)明各管欲接種的菌名。(2) 用接種針分別穿刺接種(見圖 3 4B) 枯草芽抱桿菌, 大腸桿菌,金黃色葡萄球菌。(3) 將接種后的試管置20 中 , 培養(yǎng) 2 5d 。(4) 觀察明膠液化情況。4. 石蕊牛奶試驗(yàn)(1) 取兩支石蕊牛奶培養(yǎng)基試管, 用記號筆標(biāo)明各管欲接種的菌名。(2) 分別接種普通變形桿菌和金黃色葡萄球菌。(3) 將接種后的試管置35 中 , 培養(yǎng) 24 48h 。(4) 觀察培養(yǎng)基顏色變化.石蕊在酸性條件下為粉紅色,堿性條件下為紫色,而被還原時為白色。5. 尿素試驗(yàn)(1) 取兩支尿素培養(yǎng)基斜面試管, 用記號筆標(biāo)明各管欲接種的菌名。(2) 分別接種普

27、通變形桿菌和金黃色葡萄球菌。(3) 將接種后的試管置35 中 , 培養(yǎng) 2448h 。(4) 觀察培養(yǎng)基顏色變化. 尿素酶存在時為紅色, 無尿素酶時應(yīng)為黃色。( 五 ) 實(shí)驗(yàn)報告1. 結(jié)果將結(jié)果填入下表,"+" 表示陽性,"-" 表示陰性菌名枯草芽孢桿菌大 腸桿菌 金 黃色葡萄球菌淀粉水解試 驗(yàn)脂肪水解試驗(yàn)明膠液化試驗(yàn)石蕊牛奶試驗(yàn)?zāi)蛩卦囼?yàn)2. 思考題(1) 你怎樣解釋淀粉酶是胞外酶而非胞內(nèi)酶？(2) 不利用碘液,你怎樣證明淀粉水解的存在？(3) 接種后的明膠試管可以在35 培養(yǎng) , 在培養(yǎng)后你必須做什么才能證明水解的存在？(4) 解釋在石蕊牛奶中的石蕊為

28、什么能起到氧化還原指示劑的作用？(5) 為什么尿素試驗(yàn)可用于鑒定Proteus 細(xì)菌？（ 一 ） 目的要求1. 了解糖發(fā)酵的原理和在腸道細(xì)菌鑒定中的重要作用2. 掌握通過糖發(fā)酵鑒別不同微生物的方法（ 二 ） 基本原理糖發(fā)酵試驗(yàn)是常用的鑒別微生物的生化反應(yīng), 在腸道細(xì)菌的鑒定上尤為重要. 絕大多數(shù)細(xì)菌都能利用糖類作為碳源和能源, 但是它們在分解糖類物質(zhì)的能力上有很大的差異. 有些細(xì)菌能分解某種糖產(chǎn)生有機(jī)酸（如乳酸 ,醋酸,丙酸等）和氣體 （如氫氣 ,甲烷 ,二氧化碳等）; 有些細(xì)菌只產(chǎn)酸不產(chǎn)氣. 例如大腸桿菌能分解乳糖和葡萄糖產(chǎn)酸并產(chǎn)氣; 傷寒桿菌分解葡萄糖產(chǎn)酸不產(chǎn)氣 , 不能分解乳糖; 普通變

29、形桿菌分解葡萄糖產(chǎn)酸產(chǎn)氣, 不能分解乳糖. 發(fā)酵培養(yǎng)基含有蛋白胨 ,指示劑（溴甲酚紫）, 倒置的德漢氏小管和不同的糖類.當(dāng)發(fā)酵產(chǎn)酸時,溴甲酚紫指示劑可由紫色 （pH6.8） 變?yōu)辄S色（pH5.2）. 氣體的產(chǎn)生可由倒置的德漢氏試管中有無氣泡來證明.圖 . 糖發(fā)酵試驗(yàn)A. 培養(yǎng)前的情況;B. 培養(yǎng)后產(chǎn)酸不產(chǎn)氣; C. 培養(yǎng)后產(chǎn)酸產(chǎn)氣（ 三 ） 器材1. 菌種 大腸桿菌,普通變形桿菌斜面各一支。2. 培養(yǎng)基 葡萄糖發(fā)酵培養(yǎng)基試管和乳糖發(fā)酵培養(yǎng)基試管各3 支 （ 內(nèi)裝有倒置的德漢氏小試管 ）。3. 儀器或其他用具試管架,接種環(huán)等。（ 四 ） 操作步驟1. 用記號筆在各試管外壁上分別標(biāo)明發(fā)酵培養(yǎng)基名稱

30、和所接種的細(xì)菌菌名。2. 取葡萄糖發(fā)酵培養(yǎng)基試管3 支 , 分別接入大腸桿菌, 普通變形桿菌, 第三支不接種,作為照 .另取乳糖發(fā)酵培養(yǎng)基試管3 支 , 同樣分別接入大腸桿菌, 普通變形桿菌,第三支不接種,作為對照。在接種后, 輕緩搖動試管, 使其均勻, 防止倒置的小管進(jìn)入氣泡。3. 將接種過和作為對照的6 支試管均置37 培養(yǎng) 2448h 。4. 觀察各試管顏色變化及德漢氏小管中有無氣泡。（五）實(shí)驗(yàn)報告1. 結(jié)果將結(jié)果填入下表."+" 表示產(chǎn)酸或產(chǎn)氣,"-" 表示不產(chǎn)酸或不產(chǎn)氣糖類發(fā)酵大腸桿菌普 通變形桿菌對照葡萄糖發(fā) 酵乳糖發(fā)酵2. 思考題假如某種微

31、生物可以有氧代謝葡萄糖, 發(fā)酵試驗(yàn)應(yīng)該出現(xiàn)什么結(jié)果？三、IMViC 與硫化氫試驗(yàn)( 一 ) 目的要求了解IMViC 與硫化氫反應(yīng)的原理及其在腸道菌鑒定中的意義和方法( 二 ) 基本原理IMViC 是吲哚 (indol test), 甲基紅 (methy1 red test), 伏一普 (Voges-Prokauer test) 和 檸檬酸鹽(citrate test) 四個試驗(yàn)的縮寫,I 是在英文中為了發(fā)音方便而加上的. 這四個試驗(yàn)主要是用來快速鑒別大腸桿菌和產(chǎn)氣腸桿菌(Enterobacter aerogenes), 多用于水的細(xì)菌學(xué)檢查 . 大腸桿菌雖非致病菌, 但在飲用水中若超過一定數(shù)量

32、, 則表示受糞便污染. 產(chǎn)氣腸桿菌也廣泛存在于自然界中, 因此檢查水時要將兩者分開， 硫化氫試驗(yàn)也是檢查腸道桿菌的生化試驗(yàn)吲哚試驗(yàn)是用來檢測吲哚的產(chǎn)生. 有些細(xì)菌能產(chǎn)生色氨酸酶, 分解蛋白胨中的色氨酸產(chǎn)生吲哚和丙酮酸.吲哚與對二甲基氨基苯甲醛結(jié)合,形成紅色的玫瑰吲哚. 但并非所有微生物都具有分解色氨酸產(chǎn)生吲哚的能力, 因此吲哚試驗(yàn)可以作為一個生物化學(xué)檢測的指標(biāo)。大腸桿菌吲哚反應(yīng)陽性, 產(chǎn)氣腸桿菌為陰性。甲基紅試驗(yàn)是用來檢測由葡萄糖產(chǎn)生的有機(jī)酸, 如甲酸 , 乙酸, 乳酸等. 當(dāng)細(xì)菌代謝糖產(chǎn)生酸時培養(yǎng)基就會變酸, 使加入培養(yǎng)基的甲基紅指示劑由橘黃色(pH6.3) 變?yōu)榧t色(pH4.2), 即甲基

33、紅反應(yīng).盡管所有的腸道微生物都能發(fā)酵葡萄糖產(chǎn)生有機(jī)酸,但這個試驗(yàn)在區(qū)分大腸桿菌, 但大腸桿菌在培, 如乙醇 , 丙酮酸等,和產(chǎn)氣腸桿菌上仍然是有價值的. 這兩個細(xì)菌在培養(yǎng)的早期均產(chǎn)生有機(jī)酸養(yǎng)后期仍能維持酸性pH4, 而產(chǎn)氣腸桿菌則轉(zhuǎn)化有機(jī)酸為非酸性末端產(chǎn)物使 pH 升至大約6. 因此大腸桿菌為陽性反應(yīng), 產(chǎn)氣腸桿菌為陰性反應(yīng)。伏 - 普試驗(yàn)是用來測定某些細(xì)菌利用葡萄糖產(chǎn)生非酸性或中性末端產(chǎn)物的能力, 如丙酮酸. 丙酮酸進(jìn)行縮合, 脫羧生成乙酰甲基甲醇, 此化合物在堿性條件下能被空氣中的氧氣氧化成二乙酰 . 二乙酰與蛋白胨中精氨酸的胍基作用, 生成紅色化合物, 即伏-普反應(yīng)陽性; 不產(chǎn)生紅色化合

34、物者為陰性反應(yīng). 有時為了使反應(yīng)更為明顯, 可加入少量含胍基的化合物, 如肌酸等。檸檬酸鹽試驗(yàn)是用來檢測檸檬酸鹽是否被利用. 有些細(xì)菌能夠利用檸檬酸鈉作為碳源,如產(chǎn)氣腸桿菌; 而另一些細(xì)菌則不能利用檸檬酸鹽, 如大腸桿菌.細(xì)菌在分解檸檬酸鹽及培養(yǎng)基中的磷酸銨后, 產(chǎn)生堿性化合物, 使培養(yǎng)基的pH 升高 , 當(dāng)加入 1% 溴麝香草酚藍(lán)指示劑時, 培養(yǎng)基就會由綠色變?yōu)樯钏{(lán)色.溴麝香草酚藍(lán)的指示范圍為:pH 小于 6.0 時呈黃色,pH 在6.07.0 時為綠色,pH 大于 7.6 時呈藍(lán)色.硫化氫試驗(yàn)是檢測硫化氫的產(chǎn)生, 也是用于腸道細(xì)菌檢查的常用生化試驗(yàn). 有些細(xì)菌能分解含硫的有機(jī)物, 如胱氨酸, 半胱氨酸, 甲硫氨酸等產(chǎn)生硫化氫, 硫化氫一遇培養(yǎng)基中的鉛鹽或鐵鹽等 , 就形成黑色的硫化鉛或硫化鐵沉淀物。以半胱氨酸為例, 其化學(xué)反應(yīng)過程如下:CH2SHCHNH 2COOH+H 2OCH3COCOOH+H 2S +NH 3H2S+Pb(CH