李麗娜開題完稿描述PPT學(xué)習(xí)教案

1、會計學(xué)1李麗娜開題完稿描述李麗娜開題完稿描述研究的目的和意義研究的目的和意義國內(nèi)外研究動態(tài)和趨勢國內(nèi)外研究動態(tài)和趨勢 試驗研究的主要內(nèi)容和方法試驗研究的主要內(nèi)容和方法 試驗研究實施方案和進(jìn)度試驗研究實施方案和進(jìn)度 食品學(xué)院食品學(xué)院20092009級研究生開題報告級研究生開題報告試驗研究預(yù)期效果試驗研究預(yù)期效果第1頁/共16頁1.1.枯草芽孢桿菌研究意義枯草芽孢桿菌研究意義食品學(xué)院食品學(xué)院20092009級研究生開題報告級研究生開題報告2.2.全基因組改組研究的意義全基因組改組研究的意義 一一. .研究的目的和意義研究的目的和意義生長快、營養(yǎng)簡單，能產(chǎn)生耐熱抗逆的生長快、營養(yǎng)簡單，能產(chǎn)生耐熱抗逆

2、的芽抱，這也有利于生防菌劑的生產(chǎn)、劑芽抱，這也有利于生防菌劑的生產(chǎn)、劑型加工及在環(huán)境中的存活、定殖與繁殖型加工及在環(huán)境中的存活、定殖與繁殖，而且批量生產(chǎn)工藝簡單，成本也較低，而且批量生產(chǎn)工藝簡單，成本也較低，施用方便，儲存期長，是一種理想的，施用方便，儲存期長，是一種理想的生防微生物。生防微生物。 全基因組改組是近年來興起的微生物遺傳育種和菌種改良的一項新技術(shù)。該項技術(shù)通過微生物多個正突變體遞進(jìn)融合進(jìn)行基因組隨機重組，快速篩選所需表型有重大改進(jìn)的菌株。第2頁/共16頁1.1.國內(nèi)研究概況國內(nèi)研究概況 2.2.國外研究概況國外研究概況20072007年胡雪萍等在比較納豆芽孢桿菌營養(yǎng)年胡雪萍等在比

3、較納豆芽孢桿菌營養(yǎng)體和芽孢之間的生物學(xué)特性時發(fā)現(xiàn)體和芽孢之間的生物學(xué)特性時發(fā)現(xiàn), ,芽孢芽孢對溫度、酸堿度、鹽和模擬胃腸道環(huán)境等對溫度、酸堿度、鹽和模擬胃腸道環(huán)境等不利環(huán)境的耐受性均明顯強于營養(yǎng)體不利環(huán)境的耐受性均明顯強于營養(yǎng)體, ,可可在模擬胃腸道環(huán)境中生長萌發(fā)。在模擬胃腸道環(huán)境中生長萌發(fā)。日本學(xué)者用日本學(xué)者用NTGNTG誘變處理鏈霉菌誘變處理鏈霉菌U121U121的孢的孢子子, ,獲得突變菌株的基因組庫獲得突變菌株的基因組庫, ,然后通過三然后通過三輪的基因組改組輪的基因組改組, ,獲得的菌株產(chǎn)獲得的菌株產(chǎn)HCAHCA能力比能力比原始出發(fā)菌株產(chǎn)量高原始出發(fā)菌株產(chǎn)量高5 5倍以上倍以上, ,

4、三角瓶培養(yǎng)三角瓶培養(yǎng)顯示細(xì)胞生長速度也獲得了大幅提高。顯示細(xì)胞生長速度也獲得了大幅提高。食品學(xué)院食品學(xué)院20092009級研究生開題報告級研究生開題報告第3頁/共16頁主要內(nèi)容要內(nèi)容食品學(xué)院食品學(xué)院20092009級研究生開題報告級研究生開題報告1 1、枯草芽孢桿菌生長條件的確定。、枯草芽孢桿菌生長條件的確定。2 2、菌株產(chǎn)酶活性的測定。、菌株產(chǎn)酶活性的測定。3 3、菌株紫外線誘變，選育高產(chǎn)酶菌株。、菌株紫外線誘變，選育高產(chǎn)酶菌株。4 4、菌株全基因組改組技術(shù)的研究。、菌株全基因組改組技術(shù)的研究。第4頁/共16頁食品學(xué)院食品學(xué)院20092009級研究生開題報告級研究生開題報告 3.1 3.1

5、枯草芽孢桿菌生長條件的研究枯草芽孢桿菌生長條件的研究 v 種子液制備種子液制備v 250mL250mL錐形瓶分裝錐形瓶分裝50mL50mL基礎(chǔ)基礎(chǔ)LBLB種子培養(yǎng)基接種后，在種子培養(yǎng)基接種后，在3737，160rpm160rpm的條件下震蕩培養(yǎng)的條件下震蕩培養(yǎng)12h12h。v 以滅菌的基礎(chǔ)種子培養(yǎng)基作為空白對照，測定菌液以滅菌的基礎(chǔ)種子培養(yǎng)基作為空白對照，測定菌液的的OD600OD600，作為培養(yǎng)條件優(yōu)化的種子液，作為培養(yǎng)條件優(yōu)化的種子液 。 菌種生長培養(yǎng)液配制及測定菌種生長培養(yǎng)液配制及測定v將種齡為將種齡為12h12h的種子培養(yǎng)液按的種子培養(yǎng)液按5%5%接種于裝有接種于裝有6mL6mL基礎(chǔ)種

6、子培養(yǎng)基的基礎(chǔ)種子培養(yǎng)基的試管中。試管中。v已接種的試管分別在各單因素條件下振蕩培養(yǎng)，每隔兩小時取樣，已接種的試管分別在各單因素條件下振蕩培養(yǎng)，每隔兩小時取樣，測定測定ODOD600600，達(dá)到菌種的最大生長量為止。，達(dá)到菌種的最大生長量為止。v以時間為橫坐標(biāo)，以以時間為橫坐標(biāo)，以O(shè)DOD600600為縱坐標(biāo)，繪制菌種生長曲線，使菌種為縱坐標(biāo)，繪制菌種生長曲線，使菌種在短時間內(nèi)達(dá)到較大生長量者為最適生長條件。在短時間內(nèi)達(dá)到較大生長量者為最適生長條件。第5頁/共16頁Title吸水率吸水率溫度溫度pH搖床轉(zhuǎn)速搖床轉(zhuǎn)速接種量接種量裝液量裝液量種齡種齡實驗方法實驗方法食品學(xué)院食品學(xué)院20092009

7、級研究生開題報告級研究生開題報告第6頁/共16頁食品學(xué)院食品學(xué)院20092009級研究生開題報告級研究生開題報告實驗方法實驗方法3.2 3.2 菌種產(chǎn)酶活性測定菌種產(chǎn)酶活性測定 蛋白酶活性測定蛋白酶活性測定 淀粉酶活性測定淀粉酶活性測定 纖維素酶活性測定纖維素酶活性測定脂肪酶活性測定脂肪酶活性測定第7頁/共16頁食品學(xué)院食品學(xué)院20092009級研究生開題報告級研究生開題報告實驗方法實驗方法3.33.3紫外線紫外線誘變誘變出發(fā)菌株斜面出發(fā)菌株斜面 洗下孢子洗下孢子 過濾除菌絲過濾除菌絲 制成孢子懸浮液制成孢子懸浮液 紫外線誘變紫外線誘變 轉(zhuǎn)無菌管轉(zhuǎn)無菌管02h 02h 后培養(yǎng)后培養(yǎng) 稀釋涂平板

8、稀釋涂平板 暗培養(yǎng)暗培養(yǎng)24h24h 初篩初篩復(fù)篩復(fù)篩 高產(chǎn)酶菌株高產(chǎn)酶菌株 生化鑒定生化鑒定 遺傳穩(wěn)定性遺傳穩(wěn)定性 第8頁/共16頁食品學(xué)院食品學(xué)院20092009級研究生開題報告級研究生開題報告實驗方法實驗方法3.33.3紫外線紫外線誘變誘變1.1.紫外燈照射時間對誘變的影響紫外燈照射時間對誘變的影響 時間(s)20 30 40 50 60 70 80 90 100 110 對照菌落個數(shù)2.2.篩選步驟篩選步驟 UV第一輪：一株出發(fā)菌株第一輪：一株出發(fā)菌株 選出選出200株單菌落株單菌落初初篩篩 選出選出60株株復(fù)篩復(fù)篩選出五株選出五株 UV第二輪：五株出發(fā)菌株第二輪：五株出發(fā)菌株 540

9、株株初篩初篩 選出選出60株株復(fù)篩復(fù)篩選出五株選出五株第三、四輪第三、四輪同第一輪直至選出較優(yōu)菌株同第一輪直至選出較優(yōu)菌株第9頁/共16頁食品學(xué)院食品學(xué)院20092009級研究生開題報告級研究生開題報告實驗方法實驗方法3.4 3.4 全基因組改組技術(shù)全基因組改組技術(shù)出發(fā)菌株斜面出發(fā)菌株斜面 洗下孢子洗下孢子 過濾處菌絲過濾處菌絲 制成孢子懸浮液制成孢子懸浮液 預(yù)處理預(yù)處理 酶解酶解 稀釋涂平板稀釋涂平板 初篩初篩 復(fù)篩復(fù)篩 高產(chǎn)酶菌株高產(chǎn)酶菌株 生化鑒定生化鑒定 遺傳穩(wěn)定性遺傳穩(wěn)定性原生質(zhì)體制備原生質(zhì)體制備第10頁/共16頁2424 2626 2828 3030 3232 3434 3636生

10、成率生成率再生率再生率1%1%2%2%3%3%4%4%5%5%6%6%7%7%生成率生成率再生率再生率6h6h6.5h6.5h7h7h7.5h7.5h8h8h8.5h8.5h9h9h生成率生成率再生率再生率食品學(xué)院食品學(xué)院20092009級研究生開題報告級研究生開題報告原生質(zhì)體制備原生質(zhì)體制備實驗方法實驗方法1.1.酶解溫度對原生質(zhì)體制備的影響酶解溫度對原生質(zhì)體制備的影響 2.2.酶濃度對原生質(zhì)體制備的影響酶濃度對原生質(zhì)體制備的影響 3.3.酶解時間對原生質(zhì)體制備的影響酶解時間對原生質(zhì)體制備的影響 4.4.正交實驗確定原生質(zhì)體制備的最佳條件正交實驗確定原生質(zhì)體制備的最佳條件 （A）溫度（B）時

11、間h（C）濃度%實驗1實驗2實驗3實驗4實驗5實驗6實驗7實驗8實驗9111222333123231312123312231第11頁/共16頁食品學(xué)院食品學(xué)院20092009級研究生開題報告級研究生開題報告實驗方法實驗方法原生質(zhì)體融合原生質(zhì)體融合 取兩親株原生質(zhì)體懸浮液各取兩親株原生質(zhì)體懸浮液各lmllml混合，混合，3500r/min3500r/min離心離心1515分鐘。棄去上清液，緩慢加入分鐘。棄去上清液，緩慢加入預(yù)熱預(yù)熱1.8ml 10%PEG60001.8ml 10%PEG6000溶液和溶液和0.2ml0.2ml的新生磷酸的新生磷酸鈣溶液，融合鈣溶液，融合30min30min，混合均

12、勻，混合均勻. .立即加入立即加入SMMSMM終終止反應(yīng)，止反應(yīng)，3500r/min3500r/min離心離心10min10min去除融合液，去除融合液，SMMSMM高滲緩沖液離心洗滌兩次后，重懸于高滲緩沖液離心洗滌兩次后，重懸于SMMSMM液中，液中，用用SMMSMM高滲透壓緩沖液稀釋高滲透壓緩沖液稀釋1010倍后，取倍后，取0.1ml0.1ml用用夾層法培養(yǎng)于再生基本培養(yǎng)塊平板上，培養(yǎng)夾層法培養(yǎng)于再生基本培養(yǎng)塊平板上，培養(yǎng)7 7天天觀察記數(shù)取單親株及混合后不加觀察記數(shù)取單親株及混合后不加PEGPEG的原生質(zhì)體的原生質(zhì)體分別作對照試驗。分別作對照試驗。 第12頁/共16頁實驗方法實驗方法融合子的檢出及鑒定融合子的檢出及鑒定實驗方法實驗方法第13頁/共16頁1.1.本課題的特點及創(chuàng)新點本課題的特點及創(chuàng)新點2.2.研究計劃及預(yù)期進(jìn)展研究計劃及預(yù)期進(jìn)展食品學(xué)院食品學(xué)院20092009級研究生開題報告級研究生開題報告五五. .試驗研究預(yù)期效果試驗研究預(yù)期效果1.1.枯草芽孢桿菌培養(yǎng)條件的確定枯草芽孢桿菌培養(yǎng)條件的確定 2.2.確定酶活性測定方法確定酶活性測定方法 2010年4月2010年9月 相關(guān)的資料查找與準(zhǔn)備工作。2010年10月2010年12月 菌株誘變，選育高產(chǎn)酶枯草押寶菌株。2011年1月2011年7月 全基因組改組技術(shù)的研究。2011年8月2012年3月 對實驗數(shù)