核酸分子雜交的種類及應(yīng)用(共3頁)

1、核酸分子雜交摘要：核酸分子雜交技術(shù)是基因工程中重要的研究手段，是目前生物化學(xué)、分子生物學(xué)、和細(xì)胞生物學(xué)研究中應(yīng)用最廣泛的技術(shù)之一。也是現(xiàn)階段定性、定量和定位檢測DNA與RNA序列片段必須掌握的基本技術(shù)和方法。本文主要介紹了核酸分子的原理，分類以及它的相關(guān)應(yīng)用。關(guān)鍵詞：核酸分子；分類；應(yīng)用；1.核酸雜交技術(shù)的原理核酸分子（DNA、RNA）是由許多單核苷酸分子通過3，5磷酸二酯鍵相互連接所形成的生物大分子。DNA分子雙鏈的形成，DNA的復(fù)制，以及RNA的轉(zhuǎn)錄等都遵循堿基互補配對原則。DNA是由兩條互補配對的單核苷酸鏈通過氫鍵連接的雙鏈分子。雙鏈結(jié)構(gòu)的核酸分子在加熱、偏堿環(huán)境或受尿素、甲酰胺等氫鍵解

2、離劑的作用，則形成單鏈分子，稱為核酸“變性”。兩條單鏈核甘酸若有同源順序，則在一定條件下，他們的堿基互補配對，從而形成雙鏈分子，稱為核酸“復(fù)性”或核酸“雜交”1。核酸分子雜交是用核酸分子的變性，復(fù)性等理化性質(zhì)而設(shè)計的一種常用技術(shù)。通常利用一種順序已知，并被放射性同位素標(biāo)記的核酸片段看作為探針，與未知樣品的核酸進(jìn)行分子雜交，如果樣品中的核酸與探針有堿基互補順序就能形成雜交分子。此時標(biāo)有同位素或生物素的探針則固定在標(biāo)本上，用放射性自顯影法或免疫組化法可顯示出探針2。核酸分子雜交可分為液相雜交、固相雜交和原位雜交3。2.固相分子雜交：將待測的靶核甘酸鏈預(yù)先固定在固體支持物（硝酸纖維素膜或尼龍膜）上，

3、而標(biāo)記的探針則游離在溶液中，進(jìn)行雜交反應(yīng)后，使雜交分子留在支持物上，然后再進(jìn)行檢測和計算。固相分子雜交又可分為：Southern印跡雜交、Northern印跡雜交、Western印跡雜交、斑點雜交、菌落原位雜交等。2.1 Southern印跡雜交 1975年建立的一種DNA轉(zhuǎn)移方法。該法利用硝酸纖維素膜(或經(jīng)特殊處理的濾紙或尼龍膜)具有吸附DNA的功能。首先用酚提法從待檢測組織中提取DNA，然后以限制性內(nèi)切酶消化待測的DNA片段，接著進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳使DNA按分子量大小分離，電泳完畢后，將凝膠放入堿性溶液中使DNA變性，解離為兩條單鏈。再在凝膠上貼上硝酸纖維素膜，使凝膠上的單鏈DNA區(qū)帶按原

4、來的位置吸印到膜上。然后直接在膜上進(jìn)行核酸探針（已被同位素標(biāo)記）與被測樣品之間的雜交，再通過放射自顯影對雜交結(jié)果進(jìn)行檢測4。2.2 Northern印跡雜交 1976年Alwine建立了該方法。這是一種將RNA從瓊脂糖凝膠中轉(zhuǎn)印到硝酸纖維素膜上的方法。其檢測過程與Southern轉(zhuǎn)移雜交基本相同，所不同的是用DNA探針檢測經(jīng)凝膠電泳分開的RNA分子。它主要用于研究基因的轉(zhuǎn)錄活性及表達(dá)5。2.3 Western印跡雜交 Western印跡是指將蛋白質(zhì)樣品經(jīng) 分離，然后轉(zhuǎn)移至到固相載體上，然后用抗體通過免疫學(xué)反應(yīng)檢測目的蛋白，因的表達(dá)程度。固相載體以非共價鍵形式吸附蛋白質(zhì)，且能保持分離的多肽類型及

5、其生物學(xué)活性不變。以固相載體上的蛋白質(zhì)或多肽作為抗原，與對應(yīng)的抗體起免疫反應(yīng)，再與酶或同位素標(biāo)記的第二抗體起反應(yīng)，經(jīng)過底物顯色或放射自顯影以檢測電泳分離的特異性目的基因表達(dá)的蛋白成分6。2.4斑點雜交 將待測核酸樣品進(jìn)行DNA或RNA變性處理后，直接點在硝酸纖維素濾膜上，經(jīng)烘烤固定后，與同位素或生物素標(biāo)記的探針進(jìn)行雜交，雜交后放射性雙鏈DNA可使X光膠片感光，形成自顯影斑點。2.5菌落原位雜交 將培養(yǎng)基上長出的菌落通過影印方法轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜上，堿變性破壞細(xì)菌的細(xì)胞壁使其釋放出DNA，并經(jīng)變性處理使雙鏈DNA解鏈，經(jīng)烘烤固定后，用同位素標(biāo)記的探針進(jìn)行雜交，最后放射自顯影。如果底片上出現(xiàn)蝌蚪狀

6、黑點，即證明相應(yīng)的菌落中具有與探針DNA同源的核酸片段。3.液相分子雜交5 液相分子雜交是將待測的核酸樣品和同位素標(biāo)記的DNA探針同時溶于雜交液中進(jìn)行反應(yīng)，然后分離雜交雙鏈和未參加反應(yīng)的標(biāo)記探針，用儀器檢測并計算分析雜交結(jié)果。4.原位雜交將標(biāo)記探針與細(xì)胞或組織中的核酸按堿基配對原則進(jìn)行特異性雜交，并應(yīng)用組織化學(xué)或免疫組織化學(xué)方法在顯微鏡下進(jìn)行細(xì)胞定位或基因表達(dá)的檢測技術(shù)。5.應(yīng)用5.1基因診斷、傳染病病原體的檢測 核酸分子雜交具有很高的靈敏性和特異性，因而該技術(shù)目前已用于多種遺傳性疾病的基因診斷、惡性腫瘤的基因分析、傳染病病原體的檢測等領(lǐng)域中，其成果大大促進(jìn)了現(xiàn)代醫(yī)學(xué)的進(jìn)步和發(fā)展。例如，我們可

7、以用DNA雜交技術(shù)來檢測某人是否感染了乙肝病毒（乙肝病毒的遺傳物質(zhì)是DNA）。方法是拿一個用熒光或同位素標(biāo)記的DNA分子探針（這個探針就是乙肝病毒DNA分子），如果被檢測的DNA分子和探針雜交了，或者說雜交的部位非常多，則說明被測者感染了乙肝病毒；如果被檢測的DNA和探針沒有雜交，或者說雜交的部位非常少，則說明被測者沒有感染乙肝病毒。5.2在生物合成代謝研究中的應(yīng)用用逆轉(zhuǎn)錄酶可以在體外以mRNA為模板合成DNA，此種DNA稱互補DNA(cDNA)。用cDNA作為探針，可以檢測細(xì)胞中的mRNA。它的敏感性比直接測定蛋白質(zhì)要高1000倍。以cDNA作為探針的原位雜交技術(shù)結(jié)合蛋白測定技術(shù)，可以了解單個細(xì)胞內(nèi)mRNA的翻譯水平，即蛋白質(zhì)合成能力，從而可以了解組織器官的代謝和功能狀態(tài)，以及器官組織內(nèi)不同細(xì)胞群的功能差異,并能同時進(jìn)行形態(tài)學(xué)觀察。參考文獻(xiàn)1.王 平，核酸分子雜交技術(shù)及其應(yīng)用J.井岡山醫(yī)專學(xué)報.1996，3（2）：15-17.2.宋勝華.核酸分子雜交技術(shù)及其應(yīng)用J.臨床與實驗病理學(xué)研究.1987，3（3）：185-188.3.尹和平，張世荃.簡述核酸分子雜交技術(shù)J.生物學(xué)通報.1992,6:16-48.4.易先平.核酸雜交技術(shù)及其