二氮嗪預(yù)處理對缺氧復(fù)氧后大鼠海馬神經(jīng)元凋亡及JNK表達(dá)的影響

1、二氮嗪預(yù)處理對缺氧復(fù)氧后大鼠海馬神經(jīng)元凋亡及JNK表達(dá)的影響 作者：劉榮國， 崔翔， 宋娜， 陳彥青【摘要】 目的 探討二氮嗪(DZ)預(yù)處理能否抑制CJun氨基末端激酶(JNK)表達(dá)而減輕缺氧復(fù)氧后大鼠海馬神經(jīng)元的凋亡。 方法 原代培養(yǎng)910 d的SD大鼠海馬神經(jīng)元隨機分為5組：對照組、DZ 0，30，100 mol/L和DZ 100 mol/L+5羥癸酸(5HD)100 mol/L預(yù)處理組。除對照組外，其余4組神經(jīng)元自缺氧前2 d開始，每天實施以上對應(yīng)濃度DZ預(yù)處理1 h，連續(xù)3 d。于體外缺氧4 h復(fù)氧48 h后，采用四唑藍(lán)比色法測定海馬神經(jīng)元活力，AnnexinFITC流式細(xì)胞術(shù)測定凋亡

2、率，Western blotting法檢測JNK蛋白表達(dá)。 結(jié)果 與對照組比較，缺氧復(fù)氧后海馬神經(jīng)元的活力下降，凋亡率增大，JNK蛋白表達(dá)增強(P<0.05)。與其他預(yù)處理組比較，DZ 100 mol/L預(yù)處理組的神經(jīng)元活力高，凋亡率低(P<0.05)，其他預(yù)處理組間比較無統(tǒng)計學(xué)意義。DZ預(yù)處理后，JNK蛋白表達(dá)減低，且DZ 100 mol/L組表達(dá)弱于DZ 30 mol/L組(P<0.05)。同時給于5HD預(yù)處理后，DZ未能抑制JNK蛋白表達(dá)。 結(jié)論 DZ預(yù)處理可能抑制JNK表達(dá)而減輕缺氧復(fù)氧后大鼠海馬神經(jīng)元的凋亡。 【關(guān)鍵詞】 二氮嗪; 海馬; 疾

3、病模型，動物; 缺氧缺血，腦; 神經(jīng)元; 細(xì)胞凋亡; JNK絲裂原活化蛋白激酶類2 / 17 以二氮嗪(Diazoxide，DZ)為代表的線粒體內(nèi)膜上ATP敏感鉀通道(Mitochondrial ATP Sensitive Potassium Channel, MitoKATP)開放劑可模擬缺血預(yù)處理，激發(fā)腦的內(nèi)源性保護機制而增強抗損傷效果12。腦損傷患者的愈后與凋亡密切相關(guān)。cJun氨基末端激酶 (cJun Nterminal kinase，JNK)是有絲分裂原激活蛋白激酶超家族成員之一，具有促凋亡和抗凋亡的雙重功能，發(fā)揮哪一功能受到細(xì)胞類型、刺激方式、持續(xù)時間以及其他信號的影響，在離體培養(yǎng)

4、大鼠海馬神經(jīng)元缺氧實驗中，JNK信號主要發(fā)揮促凋亡作用34。本研究以原代培養(yǎng)的大鼠海馬神經(jīng)元為實驗對象，探討DZ預(yù)處理能否抑制JNK信號蛋白表達(dá)而減低缺氧復(fù)氧后大鼠海馬神經(jīng)元的凋亡，旨在進(jìn)一步了解藥物預(yù)處理的抗損傷機制。1 材料與方法1.1 主要藥品、試劑和儀器 二氮嗪(批號：022K1516)、5羥癸酸(5Hydroxydecanoate，5HD，批號：057H5076)購自美國Sigma公司;Annexin FITC試劑為美國BD公司產(chǎn)品;多克隆兔抗大鼠JNK抗體(FL型SC57)、山羊抗兔IgG抗體購自美國Santa cruz公司。密閉缺氧裝置為北京通達(dá)科技公司產(chǎn)品;電泳儀(MiniPr

5、otean3，美國Amersham Biosciences公司);酶標(biāo)儀(Model 550，美國BioRad公司);凝膠成像系統(tǒng)(Gel Doc XR+，美國BioRad公司);流式細(xì)胞儀(FACS Calibur，美國BD公司)。1.2 方法1.2.1 大鼠海馬神經(jīng)元原代培養(yǎng)和鑒定 取新生SD大鼠出生時間<24 h，56 g，二級，上海實驗動物中心提供(許可證號：SCXK滬20070005)，經(jīng)消毒、斷頭后分離出海馬，切碎并移入0.125%胰蛋白酶溶液中消化30 min。終止消化，吹打細(xì)胞懸液，以5×105 mL1的細(xì)胞密度接種于直徑35 mm培養(yǎng)皿或96孔板中，每

6、皿2 mL或每孔100 L，置于37 、體積分?jǐn)?shù)為0.1的CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，910 d后行實驗。神經(jīng)元鑒定方法為：培養(yǎng)至第9天，應(yīng)用神經(jīng)元特異性烯醇化酶(Neuron Specific Enolase,NSE)免疫細(xì)胞化學(xué)染色，海馬神經(jīng)元細(xì)胞質(zhì)和突起被染成棕褐色，為陽性細(xì)胞;未被染色的細(xì)胞為陰性細(xì)胞。1.2.2 實驗分組、缺氧方法和DZ預(yù)處理方法 大鼠海馬神經(jīng)元分為對照組(A組)、DZ 0 mol/L組(B組)、DZ 30 mol/L組(C組)、DZ 100 mol/L組(D組)、DZ 100 mol/L+5HD 100 mol/L(E組)。每次實驗每組采用12孔或2皿，實驗重復(fù)3次。除對照

7、組外，其他組于缺氧前2 d開始，每天實施以上對應(yīng)濃度DZ預(yù)處理，每次1 h，隨后培養(yǎng)液全量置換，連續(xù)3 d。將海馬神經(jīng)元置入密閉缺氧裝置中后，充體積分?jǐn)?shù)為0.95的N20.05的CO2氣體4 h，流速為0.2 L/min，以造成缺氧環(huán)境，于復(fù)氧48 h測定相關(guān)指標(biāo)。1.2.3 四唑藍(lán)比色法測定神經(jīng)元活力 96孔板之每孔中加入5 mg/mL四甲基偶氮唑藍(lán)磷酸緩沖液10 L，繼續(xù)培養(yǎng)4 h后棄去上清液，再加入100 L二甲基亞砜均勻振蕩10 min，在酶標(biāo)儀(測量波長600 nm)上讀取數(shù)值為吸光度值，以吸光度值表示海馬神經(jīng)元的活力。1.2.4 Annexin VFITC法檢測神經(jīng)元凋亡率 海馬神

8、經(jīng)元按以下程序處理：0.1 mol/L PBS漂洗后，0.125%胰蛋白酶消化5 min，終止消化后制備單細(xì)胞懸液，收集細(xì)胞并離心(1 000 r/min)5 min，棄去胰蛋白酶后，0.1 mol/L PBS漂洗2次，以含Ca2+緩沖液將神經(jīng)元濃度稀釋為1×106 mL1，加Annexin V(120)避光反應(yīng)10 min，再以PI(120)標(biāo)記后，立即在流式細(xì)胞儀上測定凋亡率。1.2.5 Western blot檢測JNK蛋白的表達(dá) 采集細(xì)胞后，1 200 r/min離心5 min收集細(xì)胞，加入80 L細(xì)胞裂解液，冰上裂解30 min后，4 再離心(12 000 r/ min)5

9、 min。上樣前將樣品煮沸5 min，計算含50 g蛋白的溶液體積即為上樣量。垂直電泳兩玻璃板間隙中灌注12%分離膠及5%濃縮膠，加入Marker 10 L，其余空格按預(yù)定順序加樣。電泳在濃縮膠電壓80 V，分離膠電壓100 V，總時間2.5 h左右;而后在4 、電流200 mA條件下轉(zhuǎn)膜4560 min，將蛋白轉(zhuǎn)移至NC膜，10%脫脂牛奶封閉NC膜2 h，將多克隆兔抗大鼠JNK抗體(1500)與NC膜充分接觸雜交，4 下過夜，后與actin(11 000)雜交反應(yīng)35 h，再與山羊抗兔IgG抗體二抗(12 000)于室溫下孵育2 h，然后顯影、定影、圖象分析。結(jié)果用Gel Doc凝膠成像分析

10、系統(tǒng)掃描目標(biāo)條帶的分子量，成像結(jié)果用Quantity One軟件行半定量分析，以A組為對照，取相對值。1.3 統(tǒng)計學(xué)處理 計量資料以x±s表示，采用SPSS 13.0統(tǒng)計軟件包進(jìn)行數(shù)據(jù)處理。單因素方差分析，Newmankeuls兩兩比較。P<0.05為差別有統(tǒng)計學(xué)意義。2 結(jié) 果2.1 海馬神經(jīng)元的鑒定結(jié)果及活力、凋亡率比較 光鏡下隨機計數(shù)8個非重疊視野細(xì)胞，計算NSE陽性細(xì)胞百分率，海馬神經(jīng)元所占比例為(87.7±5.6)%，見圖1。缺氧復(fù)氧后海馬神經(jīng)元活力下降，凋亡率增大(P<0.05);D組活力高于其他缺氧組，而凋亡率則低于其他缺氧組(P&

11、amp;lt;0.05)。各組海馬神經(jīng)元吸光度值、凋亡率比較見表1。 細(xì)胞質(zhì)和突起被染成棕褐色為海馬神經(jīng)元，其他未被深染色的細(xì)胞為非神經(jīng)元.表1 各組海馬神經(jīng)元的吸光度、凋亡率和JNK蛋白表達(dá)比較2.2 JNK蛋白的定量分析 缺氧復(fù)氧后，JNK蛋白表達(dá)增強。與B組比較，C和D組JNK表達(dá)均明顯減弱(P<0.05)，JNK在C組減弱19%，D組減弱35%。B組與E組比較無統(tǒng)計學(xué)差異(P>0.05)。與C組比較，D組的JNK表達(dá)減弱(P<0.05)。各組JNK蛋白具體表達(dá)和比較見圖2和表1。3 討 論腦缺血/缺氧嚴(yán)重危害人類健康，積極探索缺血/缺氧導(dǎo)致腦損

12、傷機制和有效防治措施，具有重要的臨床價值。在腦內(nèi)，MitoKATP含量極為豐富，DZ激活MitoKATP后能產(chǎn)生理想的保護效果。本研究中DZ預(yù)處理的劑量、時間、方法和5HD劑量是根據(jù)前期實驗基礎(chǔ)確定的5。應(yīng)用四唑藍(lán)比色法測定活細(xì)胞的吸光密度值代表細(xì)胞的活力，可以反映海馬神經(jīng)元的存活率。缺氧復(fù)氧損傷后，DZ 100 mol/L組活力大于DZ 0 mol/L組、凋亡率低于DZ 0 mol/L組;而DZ+5HD組與DZ 0 mol/L組的活力和凋亡率比較無統(tǒng)計學(xué)差異，以上說明DZ 100 mol/L可通過開放MitoKATP通道誘導(dǎo)海馬神經(jīng)元產(chǎn)生缺氧耐受。已知的主要機制是，開放MitoKATP可降低

13、線粒體膜電位，線粒體適度去極化，抑制細(xì)胞質(zhì)鈣離子向線粒體內(nèi)流，減輕線粒體內(nèi)鈣超載6;限制缺氧/缺血后線粒體的腫脹，使線粒體的體積保持在適當(dāng)范圍內(nèi)以維持線粒體內(nèi)電子傳遞和能量生成7;MitoKATP的活化還可以減少細(xì)胞色素C的釋放，誘導(dǎo)Bcl2表達(dá)增加，抑制Bax易位，抑制凋亡發(fā)生5。實驗中，DZ 30 mol/L組與DZ 0 mol/L組的活力、凋亡率比較均未見統(tǒng)計學(xué)差異，這同時提示DZ發(fā)揮預(yù)處理效應(yīng)與劑量有關(guān)。JNK為54kD的絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，含雙磷酸化功能區(qū)ThrProTyr，可與cJun N端的活化區(qū)結(jié)合并使其第63、73位絲氨酸殘基磷酸化，因而又被稱為cJUN氨基末端激酶。目前

14、認(rèn)為，JNK可通過以下途徑發(fā)揮促凋亡作用810：增強轉(zhuǎn)錄因子復(fù)合物AP1的活性從而促進(jìn)多種凋亡蛋白表達(dá);磷酸化并抑制線粒體膜上的Bcl2和Bclxl，線粒體膜上PT孔開放，釋放cytc入細(xì)胞質(zhì);刺激下游底物Bim，將信號傳到Bax，也可導(dǎo)致線粒體釋放cytc。本實驗中，與對照組比較，缺氧復(fù)氧后各組JNK蛋白表達(dá)程度明顯增強的同時，凋亡率增大，存活率下降，提示JNK信號通路可能參與了缺氧復(fù)氧損傷所致的細(xì)胞凋亡損傷過程。與DZ 0 mol/L組比較，DZ 100 mol/L組JNK蛋白表達(dá)明顯減弱，凋亡率下降，活力升高;而給予MitoKATP 通道的選擇性抑制劑5HD后，以上變化被消除，提示DZ預(yù)

15、處理可能通過抑制JNK活性表達(dá)，減輕凋亡發(fā)生。Jiang等在對新生大鼠海馬和皮質(zhì)缺血/缺氧的研究中，發(fā)現(xiàn)DZ預(yù)處理能抑制細(xì)胞核JNK的底物cJun蛋白的表達(dá)增加11。盡管DZ 30 mol/L和DZ 100 mol/L組的JNK蛋白表達(dá)有統(tǒng)計學(xué)差異，但此2組之間的凋亡率和活力比較無統(tǒng)計學(xué)差異，這可能是缺氧復(fù)氧后神經(jīng)元的凋亡同時受多種信號轉(zhuǎn)導(dǎo)調(diào)控，受其他因素的干擾，DZ 30 mol/L未能有效減低凋亡率。筆者認(rèn)為，JNK信號在誘導(dǎo)海馬神經(jīng)元細(xì)胞凋亡過程中起重要作用，DZ可能抑制JNK的表達(dá)而減低缺氧復(fù)氧后大鼠海馬神經(jīng)元的凋亡。但DZ如何抑制JNK信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，JNK出現(xiàn)的高峰及與細(xì)胞凋亡的具體關(guān)聯(lián)

16、，尚需進(jìn)一步研究?！緟⒖嘉墨I(xiàn)】 1 Rajapakse N,Shimizu K,Kis B,et al. Activation of mitochondrial ATPsensitive potassium channels prevents neuronal cell death after ischemia in neonatal ratsJ. Neurosci Lett, 2002,327(3):208212.2 Dirnagl U,Simon R P,Hallenbeck J M. Ischemic tolerance and endogenous neuroprotectionJ.

17、Trends Neurosci, 2003,26(5):248254.3 Kuan C Y,Whitmarsh A J,Yang D D,et al. A critical role of neuralspecific JNK3 for ischemic apoptosisJ. Proc Natl Acad Sci USA, 2003,100(25):1518415189.4 Shinozaki Y,Sato Y,Koizumi S,et al. Retinoic acids acting through retinoid receptors protect hippocampal neuro

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