大鼠血紅素加氧酶1表達對呼吸機相關(guān)性肺損傷時SOD、MDA的影響

1、大鼠血紅素加氧酶-1表達對呼吸機相關(guān)性肺損傷時SOD、MDA的影響【摘要】 目的 以大鼠呼吸機相關(guān)性肺損傷(VILI)為模型，用血晶素(hemin)誘導大鼠血紅素加氧酶-1(HO-1)表達，觀察VILI時超氧化物歧化酶(SOD)和丙二醛(MDA)活性變化及HO-1對SOD和MDA的影響，探討在VILI過程中的抗氧化應(yīng)激保護作用及其機制。方法 32只雄性SD大鼠隨機分成4組(每組n=8)：對照組只做氣管切開術(shù)，保留自主呼吸;模型組氣管切開后行機械通氣4 h;誘導劑組于模型制備前24 h腹腔注射血晶素40 mol/kg;抑制劑組于模型制備前24 h腹腔注射鋅原卟啉(ZnPP)10 mol/kg。機

2、械通氣4 h后處死大鼠，收集肺組織和支氣管肺泡灌洗液(BALF)標本，測定BALF中總蛋白含量，肺組織濕/干重比值(W/D)，肺組織LDH、SOD活性和MDA含量，檢測肺組織HO-1蛋白表達，光鏡下行肺組織病理學觀察。結(jié)果 與對照組相比，模型組大鼠肺組織病理損傷嚴重，肺W/D、BALF中總蛋白、LDH活性均明顯增加，VILI模型復(fù)制成功。與模型組比較，誘導劑組肺組織HO-1表達增加，肺組織病理損傷明顯減輕，SOD活性明顯增加而MDA含量明顯下降，用ZnPP抑制HO-1表達，此種保護作用消失。結(jié)論 血晶素誘導大鼠HO-1表達可以增加SOD活性，降低MDA含量，減輕肺的氧化應(yīng)激損傷，降低VILI的

3、程度。 【關(guān)鍵詞】 呼吸機相關(guān)性肺損傷;血紅素加氧酶-1;超氧化物歧化酶;丙二醛1 / 17Abstract: Objective To observe the variations in superoxide dismutase (SOD) activity and malondialdehyde (MDA) levels in ventilator-induced lung injury (VILI) and the effects of HO-1 expression on SOD and MDA with the establishment of rat model of VILI a

4、nd the induction of heme oxygenase-1 expression by hemin, and to investigate the protective effect and the underlying mechanism of anti-oxidative stress in VILI. Methods 32 male Sprague-Dawley rats were randomized into 4 groups: control group (tracheotomy only, with spontaneous breathing retained),

5、model group (tracheotomy followed by 4 h of mechanical ventilation), inducer group (intraperitoneal injection of hemin 40 mol/kg 24 h before model establishment), suppressor group (intraperitoneal injection of ZnPP 10 mol/kg 24 h before model establishment). 4 h after mechanical ventilation, the rat

6、s were sacrificed and the lung tissue and samples of bronchoalveolar lavage fluid (BALF) were collected for determination of total protein in BALF, wet-to-dry weight ratio (W/D) of lungs, LDH assaying and the activity of SOD and MDA of lung tissue, detection of lung tissue HO-1 protein expression, a

7、nd observation of histopathological changes of lungs by light microscopy. Results Compared with the control group, rats in the model group had serious lung histopathological injury and marked increase in W/D of lungs, total protein in BALF and LDH activity, respectively, which suggested the successf

8、ul establishment of VILI model. In the inducer group, as compared to the model group, HO-1 expression level increased and the lung histopathological injury was significantly attenuated, SOD activity significantly increased while MDA content significantly decreased. With the inhibition of HO-1 expres

9、sion by ZnPP, this protective effect was reversed. Conclusion Hemin-induced HO-1 expression can increase SOD activity, decrease MDA content, alleviate oxidative stress injury to lung tissues and reduce the extent of VILI.Key words: ventilator-induced lung injury; heme oxygenase-1; superoxide dismuta

10、se; malondialdehyde血紅素加氧酶(heme oxygenase，HO)是血紅素催化降解的限速酶，可在NADPH 和細胞色素P-450還原酶及分子氧作用下，催化血紅素降解為膽綠素、CO和鐵。迄今為止,已發(fā)現(xiàn)3種HO的同工酶：HO-1、HO-2、HO-3,分別由不同基因所編碼。其中HO-1是生物體內(nèi)最易被誘導的抗氧化酶類，具有很強的抗氧化應(yīng)激效應(yīng)，其本身及代謝產(chǎn)物均具有調(diào)節(jié)抗氧化酶、拮抗氧化損傷等功能1。研究表明，急性肺損傷/急性呼吸窘迫綜合征(ALI/ARDS)時，機體氧化/抗氧化平衡失常，機體處于氧化應(yīng)激狀態(tài)，HO-1在肺內(nèi)被應(yīng)激刺激穩(wěn)定表達 ,對于維持氧化損傷時機體自身穩(wěn)定

11、起了重要作用。但HO-1對呼吸機相關(guān)性肺損傷(ventilator-induced lung injury ,VILI)是否具有保護作用研究較少。本研究以大鼠VILI為模型，用血晶素(hemin)誘導大鼠HO-1表達，觀察VILI時超氧化物歧化酶(SOD)活性和丙二醛(MDA)含量變化及HO-1對SOD和MDA的影響，探討HO-1對VILI的抗氧化應(yīng)激作用及機制。1 材料和方法1.1 材料1.1.1 試劑與儀器 HO-1誘導劑血晶素和HO-1抑制劑鋅原卟啉(ZnPP)購自Sigma公司;考馬斯亮藍蛋白測定試劑盒、SOD試劑盒、MDA試劑盒和乳酸脫氫酶(LDH)試劑盒購自南京建成生物工程研究所;

12、HO-1多克隆抗體、SABC試劑盒購自武漢博士德生物工程有限公司;其他試劑均為國產(chǎn)分析純。DH-150型小動物呼吸機購自浙江大學醫(yī)學儀器廠。1.1.2 實驗動物 清潔級雄性SD大鼠，體重250300 g，由中國科學院上海實驗動物中心提供。1.2 方法1.2.1 分組 32只大鼠隨機分為4組，每組8只。對照組(C組)：只做氣管切開術(shù)，保留自主呼吸。模型組(M組)：氣管切開后行機械通氣4 h，呼吸機參數(shù)設(shè)置：潮氣量(VT)30 ml/kg;呼吸頻率(RR)40次/min ;吸呼比(IE)=13;吸入氧濃度(FiO2 )21%。誘導劑組(H組)：模型制備前24 h腹腔注射血晶素40 mol/kg。抑

13、制劑組(Z組)：模型制備前24 h腹腔注射ZnPP 10 mol/kg。1.2.2 VILI模型 大鼠術(shù)前禁食12 h，自由飲水，稱重后10%水合氯醛(300 mg/kg)腹腔內(nèi)注射麻醉。仰臥位固定，常規(guī)消毒后行氣管切開并插入自制氣管導管，接小動物呼吸機開始機械通氣。呼吸機參數(shù)設(shè)置：VT 30 ml/kg;RR 40次/min;IE=13;FiO2 21%，通氣時間4 h。1.2.3 標本采集 通氣4 h后，腹主動脈放血處死大鼠，迅速開胸結(jié)扎右側(cè)肺門。以4生理鹽水行左支氣管肺泡灌洗,每次灌洗量為2 ml,共灌洗3次，回收率>85%。收集支氣管肺泡灌洗液(BALF),3 000 r

14、/min離心10 min,取上清液-70保存。取右肺上葉組織,10%甲醛固定 24 h ,梯度乙醇脫水 ,二甲苯透明,石蠟包埋，用作病理學檢查及免疫組化檢測。取右肺中葉100 mg(濕重),加入4生理鹽水1 ml,冰浴下制成10%的肺組織勻漿,4，3 000 r/min離心10 min,取上清液-70保存。1.2.4 檢測指標及方法1.2.4.1 病理學觀察 蘇木精-伊紅染色,光鏡下對比觀察肺組織病理學特征性變化及程度。1.2.4.2 BALF中總蛋白含量 取BALF上清液，采用考馬斯亮藍染色法,通過測定樣本光密度計算蛋白含量。所有操作均嚴格按照試劑盒說明進行。1.2.4.3 肺W/D測定 取

15、右肺下葉,稱濕重后置80恒溫箱烘烤至肺干重恒定,稱干重,計算肺濕/干重比值(W/D)。1.2.4.4 LDH測定 取肺組織勻漿上清液，通過比色法求出酶活力。所有操作均嚴格按照試劑盒說明進行。1.2.4.5 肺組織MDA和SOD測定 取肺組織勻漿上清液，分別采用黃嘌呤氧化酶法和硫代巴比妥酸法，所有操作均嚴格按照試劑盒說明進行。1.2.4.6 HO-1蛋白表達檢測 石蠟包埋切片以4 m 厚切片,分別按免疫組化SABC法，DAB顯色,封片鏡檢,棕黃色顆粒為陽性產(chǎn)物。采用Image-Pro Plus 6.0 高清晰度彩色病理圖像分析系統(tǒng)進行處理，每標本隨機選取5個不重疊的視野,測定免疫組化反應(yīng)陽性顆粒

16、的平均光密度值(D值),并計算5個視野D值的均值,半定量分析HO-1蛋白表達。1.3 統(tǒng)計學處理 以SPSS 13.0統(tǒng)計學軟件包進行統(tǒng)計學處理。計量資料以±s表示。組間比較采用單因素方差分析,兩兩比較采用q檢驗，P<0.05為差異有顯著性。2 結(jié) 果2.1 病理學改變 C組肺無明顯病理學改變，肺組織結(jié)構(gòu)清晰，肺泡壁薄，肺泡內(nèi)未見出血、水腫，肺泡間隔正常。M組肺組織病理學改變明顯，肺組織結(jié)構(gòu)破環(huán)嚴重，肺泡壁增厚，肺泡腔內(nèi)可見大量紅細胞，肺泡間隔明顯增厚，大量炎癥細胞聚集。與M組比較， H組肺組織病理學改變明顯減輕，肺泡間隔一定程度增厚，炎癥細胞減少，肺泡腔內(nèi)未見明顯出血

17、及水腫。Z組與M組比較未見明顯改變。見圖1。圖1 各組肺組織病理學變化(蘇木精-伊紅染色，×400)A. C組;B. M組;C. H組;D. Z組2.2 肺W/D、BALF中總蛋白含量和肺組織勻漿LDH含量變化 與C組比較，M組W/D、BALF總蛋白含量和LDH含量明顯升高(P<0.01)。與M組比較，H組W/D及BALF總蛋白含量均降低(P<0.05)。與M組比較，H組LDH含量雖降低，但差異無顯著性(P>0.05);抑制劑Z組與M組比較差異無顯著性(P>0.05)。見表1。2.3 肺組織勻漿SOD活性和MDA含量變化 與C組

18、比較，M組SOD活性明顯降低(P<0.01)。與M組比較，H組SOD含量升高(P<0.05);抑制劑Z組與M組比較差異無顯著性(P>0.05)。與C組比較，M組MDA含量明顯升高(P<0.01)。與M組比較，H組MDA含量降低(P<0.05);抑制劑Z組MDA含量與M組比較差異無顯著性(P>0.05)。見表1。表1 各組肺W/D、BALF總蛋白、MDA、SOD、LDH含量變化與C組比較：*P<0.01;與M組比較：#P<0.052.4 肺組織中HO-1的表達 C組肺組織中偶見棕黃色顆

19、粒表達;M組肺泡巨噬細胞及肺間質(zhì)浸潤的炎性細胞胞質(zhì)均可見微弱陽性顆粒表達;H組HO-1棕黃色顆粒呈陽性表達，而Z組陽性表達極低。見圖2。免疫組化半定量結(jié)果顯示，M組HO-1陽性表達大于C組，H組HO-1陽性表達大于M組(P<0.05);而Z組與C組比較HO-1陽性表達差異無顯著性(P>0.05)。見表2。3 討 論目前，呼吸機的應(yīng)用已成為搶救危重病患者最重要的儀器設(shè)備之一，但機械通氣本身卻可以引起或加重肺損傷，即VILI。本實驗設(shè)計是參考武慶平等2大鼠大潮氣量機械通氣致肺損傷實驗?zāi)Ｐ?，模擬臨床上ALI/ARDS患者需要大潮氣量機械通氣以及此類患者可能會發(fā)生“嬰兒肺”

20、3 ,即采用小潮氣量通氣，但由于局部肺不張等原因在肺其他部位也會產(chǎn)生像大潮氣量通氣引起的肺損傷。肺W/D、BALF中總蛋白含量可反映肺水腫的程度，肺組織勻漿上清中LDH的活性可反映肺組織細胞的損傷程度。本研究結(jié)果顯示，與C組相比，M組大鼠肺組織病理損傷嚴重，肺W/D、 BALF中總蛋白含量、LDH活性均較C組明顯增加， VILI模型復(fù)制成功。本實驗選擇血晶素作為HO的誘導劑，因血晶素既是HO的底物，同時又是HO的促進劑，能增強HO的活性。結(jié)果顯示，血晶素可以誘導肺組織HO-1的表達，降低肺組織水腫程度，減輕肺組織病理損傷，對肺組織發(fā)揮一定保護作用，而給予HO-1抑制劑ZnPP后，此種保護作用消

21、失，說明HO-1直接參與了對VILI的保護作用。MDA和SOD可準確地評定肺內(nèi)的氧化-抗氧化狀態(tài)。MDA含量增加和SOD活性降低表明其脂質(zhì)過氧化程度增加，組織損傷加重，反之則說明組織得到保護。本研究結(jié)果顯示，與M組比較，H組MDA下降而SOD活性增加，呼吸機所致肺損傷程度明顯減輕，而給予HO-1的抑制劑ZnPP后,這些保護作用消失，提示HO-1可以減輕肺內(nèi)氧化應(yīng)激和氧化損傷，增強機體的抗氧化能力。石纓等4也發(fā)現(xiàn)HO-1過表達可通過提高SOD活性和降低MDA含量以增強肺組織抵抗氧化應(yīng)激損傷的能力，降低犬肺移植后的損傷。研究表明VILI本質(zhì)上是一種生物傷5，致病機制之一可能是由于過度的機械刺激引起

22、肺細胞內(nèi)氧化應(yīng)激，導致氧化-抗氧化系統(tǒng)失衡;從而激活多種和炎癥密切相關(guān)的信號轉(zhuǎn)導通路,使各種致炎因子和氧化物質(zhì)表達增多6-7,抗氧化物質(zhì)減少，引起炎性細胞在肺組織“募集”,從而造成肺損傷8。而HO-1能直接上調(diào)抗氧化酶的產(chǎn)生，直接增強機體的抗氧化能力9，對抗VILI導致的氧化應(yīng)激損傷。ZnPP抑制HO-1的表達及活性，一方面使體內(nèi)血紅素蓄積，氧自由基生成增多，另一方面又減少具有抗氧化作用產(chǎn)物的生成，降低HO-1的抗氧化酶活性，必將加重肺損傷10-11。本實驗證實，VILI可以引起肺組織內(nèi)氧化應(yīng)激損傷， 血晶素可以誘導大鼠HO-1表達，通過增加SOD活性，降低MDA含量發(fā)揮機體抗氧化應(yīng)激效應(yīng)，對

23、VILI起到一定保護作用?！緟⒖嘉墨I】 1 Morse D, Sethi J. Carbon monoxide and human disease J. Antioxid Redox Signal, 2002, 4 (2): 331-338.2 武慶平，劉萍，王立奎，等.不同潮氣量通氣對大鼠呼吸機相關(guān)性肺損傷模型的影響J.華中科技大學學報:醫(yī)學版,2006,35(4):511-515.3 Gattinoni L, Carlesso E, Cadringher P, et al. Physical and biological triggers of ventilator-induced lun

24、g injury and its prevention J. Eur Respir J, 2003, 22(Suppl 47):15s-25s.4 石纓,畢建立,宋志鴻,等.血紅素加氧酶-1對模擬移植后犬肺功能的影響J. 中國組織工程研究與臨床康復(fù), 2008, 12(18): 3432-3436.5 Halbertsma F, Vaneker M, Scheffer G, et al. Cytokines and biotrauma in ventilator-induced lung injury: a critical review of the literature J. Neth J Med, 2005, 63 (10