22q11.2微缺失伴先天性心臟病的診斷技術研究

1、    22q11.2微缺失伴先天性心臟病的診斷技術研究    蔣華景+陳靜+林麗璇摘要目的 探討熒光原位雜交技術（fish）聯(lián)合超聲心動圖對診斷22q 11.2微缺失伴先天性心臟病的臨床價值。方法 于2013年1月2014年12月選擇62名具有高危妊娠指征的孕婦，應用fish技術檢測22q 11.2微缺失，并以超聲心動圖明確診斷。結果fish檢出5例22q 11.2微缺失，超聲心動圖檢查結果3例為法洛四聯(lián)癥，2例為室間隔缺損。57例無22q 11.2微缺失的胎兒超聲心動圖檢查結果三尖瓣輕度反流2例、肺動脈狹窄2例、動脈導管未閉1例。22q 11.2微缺

2、失組與無微缺失組胎兒超聲心動圖表現(xiàn)異常率分別為100.00%和8.77%，差異有統(tǒng)計學意義（2=28.28，p關鍵詞熒光原位雜交技術；超聲心動圖；22q 11.2微缺失；先天性心臟病 714.43+1 a 1674-4721（2017）05（c）-0062-04abstractobjective to discuss the clinical value of fluorescence in situ hybridization （fish） combined with ultrasonic cardiogram on 22q 11.2 microdeletion accompanied wi

3、th congenital heart disease （chd）.methods a total of 62 high risk pregnant women from january 2013 to december 2014 were chosen.the fish technique was applied to detect 22q 11.2 microdeletion，and ultrasonic cardiogram was used to diagnose clearly.results five fetuses with 22q 11.2 microdeletion were

4、 detected，from whom 3 fetuses were diagnosed as tetralogy of fallot，and 2 fetuses were diagnosed as ventricular septal defect.the ultrasonic cardiogram showed that 2 fetuses with tricuspid regurgitation slightly，2 fetuses with pulmonary stenosis and 1 fetus with patent ductus arteriosus were detecte

5、d in 57 fetuses without 22q 11.2 microdeletion.abnormality rate in group with 22q 11.2 microdeletion and group without 22q 11.2 microdeletion was 100.00% and 8.77% respectively，and difference was statistically significant （2=28.28，p<0.01）.conclusion detecting 22q 11.2 microdeletion with fish tech

6、nique and diagnosing clearly chd with ultrasonic cardiogram has high clinical application value and it is worthy of clinical promotion and application.key wordsfluorescence in situ hybridization；ultrasonic cardiogram；22q 11.2 microdeletion；congenital heart disease先天性心臟?。╟ongenital heart disease，chd）

7、是臨床常見的胎兒先天性畸形，發(fā)病率為活產嬰兒的381，也是目前嬰幼兒死亡的主要病因之一。chd的發(fā)病受遺傳和環(huán)境等多種因素影響，目前研究表明，染色體22q 11.2微缺失與chd關系密切，22q 11.2微缺失可以引發(fā)心臟缺陷，同時伴有唇裂/腭裂、胸腺發(fā)育不良、面容異常等先天畸形，因此被稱為22q 11.2微缺失綜合征。22q 11.2微缺失綜合征作為人類最常見的染色體缺失綜合征之一，發(fā)病率為1/4 0001/6 0002，且75%80%的22q 11.2微缺失微缺失病例可合并各種類型的chd3-5。本研究采用熒光原位雜交（fluorescence in situ hybridization，

8、fish）技術，對臨床疑似妊娠22q 11.2微缺失綜合征胎兒的高危孕婦進行產前檢測22q 11.2基因微缺失，并以彩色超聲心動圖明確診斷，旨在對胎兒進行早期干預，并提高22q 11.2微缺失伴先天性心臟病的診斷技術。1對象與方法1.1研究對象選擇2013年1月2014年12月在本院產前檢查并檢測22q 11.2微缺失的高危孕婦62例，孕婦年齡2843歲，平均（36.35±4.62）歲，胎齡1333周，平均（23.64±4.28）周。根據妊娠周數，1114周行絨毛穿刺3例，1724周行羊膜腔穿刺23例，>24周行臍帶血穿刺36例。62名孕婦以往均引產或分娩過chd或唇

9、腭裂等面部畸形胎兒。所有研究對象均簽署知情同意書，研究獲醫(yī)院倫理委員會批準。 1.2 試劑與儀器fish診斷試劑盒（購自北京金菩嘉醫(yī)療科技有限公司），膠原酶b、rnase a酶、胃蛋白酶（均購自美國sigma公司）。國產長風恒溫水浴箱、奧林巴斯bx51型熒光顯微鏡。1.3 fish檢測根據孕齡取羊水10 ml、臍血2 ml或絨毛34枝，采用fish診斷試劑盒，對標本22號染色體tuple1基因的微缺失進行檢測。glp tuple1/glp arsa為待檢測的基因，tuple1：22q 11和arsa：22q 13為探針的位點，其熒光信號分別為桔紅色和綠色，彼此互為內對照探針。嚴格按試劑盒說明進

10、行操作，分別進行滴片、干燥、變性、雜交、后洗、染色和鏡檢等操作。如果tuplel探針與22q 11.21成功雜交，顯示桔紅色的熒光信號（四甲基羅丹明）；如果arsa基因探針與22q 13.31成功雜交，則出現(xiàn)綠色的熒光信號（細胞綠）。tuple1和arsa基因互為內對照。在奧林巴斯bx51型熒光顯微鏡下對雜交信號進行觀察，使用fish videotest 2.0軟件分析。fish信號的評價規(guī)則：有效標本為細胞膜完整且細胞雜交率80%，對每份樣本隨機分析100個處于分裂中期狀態(tài)的細胞，22號染色體在細胞內呈綠色熒光，如果22q 11無缺失，22號染色體上應該還可顯示2個桔紅色熒光信號；如果只有1

11、個桔紅色熒光信號，提示22q 11.2存在微缺失。若熒光信號正常的細胞90%，則胎兒染色體可診斷正常；若熒光信號異常的分裂狀態(tài)細胞>60%，fish檢查結果陽性，提示胎兒存在22q 11.2微缺失。1.4超聲心動圖檢查參照“isuog 胎兒心臟篩查指南”6，超聲診斷儀為ge e8型。確認胎兒心臟方位后，在胎兒腹部橫切面，依據下腔靜脈、胃、腹主動脈等結構對心臟位置是否正常進行判斷；然后用超聲心動圖對胎兒三血管氣管的橫截面、三血管的橫截面、左右室流出道的橫截面及四腔心橫截面篩查胎兒chd。1.5統(tǒng)計學方法數據采用spss 18.0統(tǒng)計學軟件進行分析，計數資料采用2檢驗，并采用配對mcnema

12、r檢驗比較兩種診斷方法的差異，以p<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。2結果2.1 fish 法檢測22q 11.2微缺失結果62例高危孕婦中，共57例fish檢測結果為>90%的細胞內有2個綠色熒光、2個桔紅色熒光信號，提示22q 11.2無微缺失。5例有60%以上細胞出現(xiàn)了2個綠色熒光、1個桔紅色熒光信號，提示存在22q 11.2微缺失。2.2 超聲心動圖結果5例22q 11.2微缺失胎兒超聲心動圖檢查結果3例為法洛四聯(lián)癥（圖1），2例為室間隔缺損。而57例無22q 11.2微缺失的胎兒超聲心動圖檢查結果三尖瓣輕度反流2例、肺動脈狹窄2例、動脈導管未閉1例，22q 11.2微缺失胎兒

13、超聲心動圖表現(xiàn)為100.00%異常，而無22q 11.2微缺失的胎兒超聲心動圖表現(xiàn)異常率為8.77%，兩組差異有統(tǒng)計學意義（2=28.28，p<0.01）（表1）。fish和超聲心動圖診斷結果的配對2檢驗顯示2種方法對胎兒心臟異常診斷的差異無統(tǒng)計學意義（2=5.00，p=0.06）（表2）。在fish檢測結果和超聲心動圖結果出來后，對于確診為法洛四聯(lián)癥的3例胎兒，在孕婦及其家屬同意的情況下行引產手術，其他胎兒在征得孕婦及其家屬的同意下均活產，隨訪結局情況見表3。3討論chd的發(fā)病率近年來呈增高趨勢，但其發(fā)病機制目前仍未完全明了。大部分觀點認為chd是受遺傳和環(huán)境影響的多基因遺傳病，其中染

14、色體畸變是出現(xiàn)chd的主要病因，胎兒發(fā)育過程中極輕微的染色體畸變也能使附近的基因出現(xiàn)異常，并使心臟以及心外器官的發(fā)育受到影響，從而出現(xiàn)chd和心畸形。而22q11.2微缺失綜合征是目前少數得到確認的致chd的染色體畸變之一。hartman等7的研究顯示chd患兒中22q 11.2微缺失的發(fā)生率為12.2%。22q 11.2微缺失主要為染色體減數分裂之后重組時發(fā)生的異常與不對稱導致，微缺失大小為1.53 mb，缺失區(qū)域處于d22s306/308與d22s427/1638間?；町a兒中22q 11.2的發(fā)生率約為1/4 0008。22q 11.2微缺失綜合征已經被確認為除外唐氏綜合征的導致chd的最

15、為多見的遺傳因素。22q 11.2微缺失綜合征患者臨床表現(xiàn)為chd、唇腭裂、面部畸形、免疫缺陷等，而chd中發(fā)生率較高的主要為法洛四聯(lián)征、主動脈弓離斷、室間隔缺損、共同動脈干等，患兒的生長發(fā)育、學習認知能力都會出現(xiàn)異?；蜻t緩9-11，對其預后和生活質量帶來嚴重的不利影響。研究顯示22q 11.2微缺失綜合征的主要致病基因為tuple1基因，它的畸變或缺失是引起chd的主要原因之一12。fish技術通過特異性探針與細胞雜交對tuple1基因進行檢測，能對胎兒是否發(fā)生22q 11.2 微缺失進行準確的診斷。fish檢測不需要細胞培養(yǎng)，能適用于細胞周期的各個時期，具有標本采集后可立即檢測的優(yōu)點，能在

16、染色體原位顯色，定位精準直觀，結果判斷時只需對細胞進行計數、辨認是否有雜交信號，具有高度的靈敏性和特異度，成為臨床染色體微缺失檢測的金標準之一13。染色體異常與胎兒的發(fā)育畸形，特別是chd的發(fā)生密切相關。心臟超聲檢查能夠清晰直觀地顯示胎兒心臟圖像，通過將胎兒心臟的掃查切面從四腔心切面擴展到更多的標準切面，使心臟畸形的檢出率大為提高，因此超聲心動圖是診斷胎兒chd的可靠方法14-15。染色體畸變常伴基因異常或缺失，因此，心臟畸形或心外畸形較為多發(fā)。研究顯示chd胎兒的染色體異常發(fā)生率為25%30%，而當合并有心外畸形時染色體異常發(fā)生率可高達40%16。通過產前的fish檢查對胎兒進行22q 11

17、.2微缺失的檢測，并結合心臟超聲影像學檢查，對提高chd的產前診斷有顯著的臨床意義。本研究對62例高危孕婦進行fish檢測，檢出5例22q 11.2微缺失，22q 11.2微缺失胎兒的超聲心動圖均顯示有心臟畸形，其中法洛四聯(lián)癥3例，室間隔缺損2例；而57例無22q 11.2微缺失的胎兒超聲心動圖檢查心臟畸形率為8.77%，兩組差異有統(tǒng)計學意義，說明22q 11.2微缺失與胎兒chd的發(fā)生有較大的相關性，與閆亞妮等17的研究相似，同時也提示chd是環(huán)境因素與多基因遺傳共同影響的結果，chd的病因還需更深入的研究。應用fish技術檢測22q 11.2微缺失，所需樣本量少、且操作簡便，具有靈敏度高、

18、特異性強的特點。隨著標記技術和探針制備的發(fā)展，fish技術對臨床胎兒chd檢測的應用價值將進一步得到體現(xiàn)16。 本研究顯示，對高危孕婦進行fish檢測以篩查22q 11.2微缺失，并結合超聲心動圖檢查以明確診斷，以減少和避免22q 11.2微缺失綜合征的患兒出生，降低圍生兒病死率，提升人口素質，值得臨床進一步推廣應用。參考文獻1肖蕾，王玲.產前超聲診斷胎兒先天性心臟病的研究進展j.安徽醫(yī)藥，2013，17（8）：1416-1417.2zhang y，zhi z，jiang t，et al.spherical mesoporous silica nanoparticlesfor loading

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