人同型半胱氨酸ELISA試劑盒說(shuō)明書

1、人同型半胱氨酸（Hey）酶聯(lián)免疫分析試劑盒使用說(shuō)明書廈門蔥嘉生物科技有限公司本試劑盒僅供研究使用檢測(cè)范圍： nmol/ml - 50 nmol/ml最低檢測(cè)限： nmol/ml特異性：本試劑盒可同時(shí)檢測(cè)天然或重組的人Hey,且與其他相關(guān)蛋白無(wú)交 叉反應(yīng)。有效期：6個(gè)月預(yù)期應(yīng)用：ELISA法定量測(cè)定人血清、血漿、細(xì)胞培養(yǎng)上淸或其它相關(guān)生物 液體中Hey含量。說(shuō)明1. 試劑盒保存：-20£ （較長(zhǎng)時(shí)間不用時(shí)）；2-8°C （頻繁使用時(shí)）。2. |X 濃洗滌液低溫保存會(huì)有鹽析出，稀釋時(shí)可在水浴中加溫助溶。4. 中、英文說(shuō)明書可能會(huì)有不一致之處，請(qǐng)以英文說(shuō)明書為準(zhǔn)。5. 剛開啟的酶

2、聯(lián)板孔中可能會(huì)含有少許水樣物質(zhì)，此為正?，F(xiàn)象，不會(huì)對(duì)實(shí) 驗(yàn)結(jié)果造成任何影響。概述同型半胱氨酸Hey又稱髙半胱氨酸，是一種含硫氨基酸，不屬于組成蛋 白質(zhì)的20種氨基酸，體內(nèi)不能合成，只能來(lái)源于蛋氨酸的分解代謝。Hey是 甲硫氨酸代謝形成的中間產(chǎn)物。，在體內(nèi)由甲硫氨酸轉(zhuǎn)甲基后生成，有兩種途 徑。再甲基化途徑：約有50%Hcy在蛋氨酸合成酶的作用下，以維生素B12為 輔因子，以N5-甲基四氫葉酸為甲基供體，發(fā)生再甲基化，重新合成蛋氨酸。 轉(zhuǎn)硫途徑：另外約50%的Hey經(jīng)轉(zhuǎn)硫途徑不可逆生成半胱氨酸和a酶丁酸， 此過(guò)程需維生素B6依賴的胱硫醯B合成酶和甲硫氨酸合成酶參與。Hey合成 和代謝途徑及其相關(guān)的

3、酶系統(tǒng)、葉酸、維生素B12和維生素B6的缺乏、MTHFR、 甲硫氨酸合成酶(MS)、CBS的缺陷都可引起高同型半胱氨酸血癥。實(shí)驗(yàn)原理用純化的抗體包被微孔板，制成固相載體，往包被抗Hey抗體的微孔中 依次加入標(biāo)本或標(biāo)準(zhǔn)品、生物素化的抗Hey抗體、HR卩標(biāo)記的親和素，經(jīng)過(guò)徹 底洗滌后用底物TMB顯色。TMB在過(guò)氧化物酶的催化下轉(zhuǎn)化成藍(lán)色，并在酸的 作用下轉(zhuǎn)化成最終的黃色。顏色的深淺和樣品中的Hey呈正相關(guān)。用酶標(biāo)儀 在450nm波長(zhǎng)下測(cè)定吸光度(0D值)，計(jì)算樣品濃度。試劑盒組成及試劑配制1. 酶聯(lián)板(Assay plate ):塊(96孔)。2. 標(biāo)準(zhǔn)品(Standard)：2瓶(凍干品)。3.

4、 樣品稀釋液(Sample Diluent):1 X20ml/瓶。4.5. 生物素標(biāo)記抗體稀釋液(Biotin-antibody Diluent)：1 X 10ml/瓶。6. 辣根過(guò)氯化物酶標(biāo)記親和素稀釋液(HRP-avidin D訂uent)：IX 10ml/瓶。7. 生物素標(biāo)記抗體(Biotin-antibody)：lX120ul/瓶(I：100)o& 辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記親和素(HRP-avidin)：lX120ul/瓶(1：100)o9. 底物溶液(TMB Substrate)：IX 10ml/瓶。10. 濃洗滌液(Wash Buffer)： lX20nd/瓶，使用時(shí)每瓶用蒸鐳水

5、稀釋25 倍。11. 終止液(Stop Solution)：IX 10ml/瓶(2NH2S04)o需要而未提供的試劑和器材1. 標(biāo)準(zhǔn)規(guī)格酶標(biāo)儀2. 髙速離心機(jī)3. 電熱恒溫培養(yǎng)箱4. 干凈的試管和Eppendof管6. 系列可調(diào)節(jié)移液器及吸頭，一次檢測(cè)樣品較多時(shí)，最好用多通道移液器6.蒸館水，容量瓶等標(biāo)本的采集及保存1. 血清：全血標(biāo)本請(qǐng)于室溫放置2小時(shí)或4*過(guò)夜后于1000 x g離心20分 鐘，取上清即可檢測(cè)，或?qū)?biāo)本放于-20£或-8(TC保存，但應(yīng)避免反復(fù)凍 融。2. 血漿：可用EDTA或肝素作為抗凝劑，標(biāo)本采集后30分鐘內(nèi)于2 - 8° C 1000 x g離心1

6、5分鐘，或?qū)?biāo)本放于-2(TC或-8(TC保存，但應(yīng)避免反復(fù) 凍融。3. 細(xì)胞培養(yǎng)物上清或其它生物標(biāo)本：請(qǐng)1000 xg離心20分鐘，取上清即可 檢測(cè)，或?qū)?biāo)本放于-2(rc或-8CTC保存，但應(yīng)避免反復(fù)凍融。注：標(biāo)本溶血會(huì)影響最后檢測(cè)結(jié)果，因此溶血標(biāo)本不宜進(jìn)行此項(xiàng)檢測(cè)。 標(biāo)本的稀釋原則：首先通過(guò)文獻(xiàn)檢索的方式了解待測(cè)樣本的大致含量，確定適當(dāng)?shù)南♂尡稊?shù)。 只有稀釋至標(biāo)準(zhǔn)曲線的范圍內(nèi)，檢測(cè)的結(jié)果才是準(zhǔn)確的。稀釋的過(guò)程中，應(yīng) 做好詳細(xì)的記錄。最后計(jì)算濃度時(shí)，稀釋了 “N”倍，標(biāo)本的濃度應(yīng)再乘以“N” o標(biāo)準(zhǔn)品的稀釋原則：2瓶，每瓶臨用前以樣品稀釋液稀釋至1H11,蓋好后 靜置10分鐘以上，然后反復(fù)

7、顛倒/搓動(dòng)以助溶解，其濃度為50 n mol/ml,做 系列倍比稀釋后，分別稀釋 50 nmol/ml, 25 nmol/ml, n mol/ml, n mol/ml, nmol/ml, nmol/ml, nmol/ml.,樣品稀釋液直接作為標(biāo)準(zhǔn)濃度0 nmol/ml, 臨用前15分鐘內(nèi)配制。I如配制25 nmol/ml 1標(biāo)準(zhǔn)品：取(不要少于)50 nmol/ml的上述標(biāo)準(zhǔn)品加入 含樣品稀釋液的Eppendorf管中，混勻即可，其余濃度以此類推。生物素標(biāo)記抗體的稀釋原則：臨用前以生物素標(biāo)記抗體稀釋液稀釋，稀釋前根據(jù)預(yù)先計(jì)算好的每次實(shí)驗(yàn)所 需的總量配制(每孔lOOul),實(shí)際配制時(shí)應(yīng)多配制。如

8、10ul生物素標(biāo)記抗體 加990ul生物素標(biāo)記抗體稀釋液的比例配制，輕輕混勻，在使用前一小時(shí)內(nèi) 配制。辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記親和素的稀釋原則：臨用前以辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記親和素稀釋液稀釋，稀釋前根據(jù)預(yù)先計(jì)算好的 每次實(shí)驗(yàn)所需的總量配制（每孔lOOul）,實(shí)際配制時(shí)應(yīng)多配制。如10ul辣根 過(guò)氧化物酶標(biāo)記親和素加990ul辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記親和素稀釋液的比例配 制，輕輕混勻，在使用前一小時(shí)內(nèi)配制。操作步驟實(shí)驗(yàn)開始前，請(qǐng)?zhí)崆芭渲煤盟性噭?，試劑或樣品稀釋時(shí)，均需混勻，混勻 時(shí)盡量避免起泡。每次檢測(cè)都應(yīng)該做標(biāo)準(zhǔn)曲線。如樣品濃度過(guò)高時(shí)，用樣品 稀釋液進(jìn)行稀釋，以使樣品符合試劑盒的檢測(cè)范圍。1. 加樣：分別設(shè)

9、空白孔、標(biāo)準(zhǔn)孔、待測(cè)樣品孔。空白孔加樣品稀釋液lOOul, 余孔分別加標(biāo)準(zhǔn)品或待測(cè)樣品lOOul,注意不要有氣泡，加樣將樣品加于 酶標(biāo)板孔底部，盡量不觸及孔壁，輕輕晃動(dòng)混勻，酶標(biāo)板加上蓋或覆膜， 37工反應(yīng)120分鐘。為保證實(shí)驗(yàn)結(jié)果有效性，每次實(shí)驗(yàn)請(qǐng)使用新的標(biāo)準(zhǔn)品溶液。2. 棄去液體，甩干，不用洗滌。每孔加生物素標(biāo)記抗體工作液100ul （取 lul生物素標(biāo)記抗體加99ul生物素標(biāo)記抗體稀釋液的比例配制，輕輕混 勻，在使用前一小時(shí)內(nèi)配制），379,60分鐘。3. 溫育60分鐘后，棄去孔內(nèi)液體，甩干，洗板3次，每次浸泡1-2分鐘， 200ul/每孔，甩干。4. s 每孔加辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記親和素

10、工作液（同生物素標(biāo)記抗體工作液） 100ul, 37°C, 60 分鐘。6. 溫育60分鐘后，棄去孔內(nèi)液體，甩干，洗板5次，每次浸泡1-2分鐘， 200ul/每孔，甩干。7. 依序每孔加底物溶液90ul, 37X2避光顯色（30分鐘內(nèi)，此時(shí)肉眼可見標(biāo) 準(zhǔn)品的前3-4孔有明顯的梯度藍(lán)色，后3-4孔梯度不明顯，即可終止）。& 依序每孔加終止溶液50ul,終止反應(yīng)（此時(shí)藍(lán)色立轉(zhuǎn)黃色）。終止液的加 入順序應(yīng)盡量與底物液的加入順序相同。為了保證實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性，底 物反應(yīng)時(shí)間到后應(yīng)盡快加入終止液。9.用酶聯(lián)儀在450nm波長(zhǎng)依序測(cè)量各孔的光密度（0D值）。在加終止液后 15分鐘以內(nèi)進(jìn)行

11、檢測(cè)。實(shí)驗(yàn)備注1. 用戶在初次使用試劑盒時(shí)，應(yīng)將各種試劑管離心數(shù)分鐘，以便試劑集中到 管底。2. 每次實(shí)驗(yàn)留一孔作為空白調(diào)零孔，該孔不加任何試劑，只是最后加底物溶 液及2N H2S04o測(cè)量時(shí)先用此孔調(diào)0D值至零。3. 為防止樣品蒸發(fā)，試驗(yàn)時(shí)將反應(yīng)板放于鋪有濕布的密閉盒內(nèi)，酶標(biāo)板加上 蓋或覆膜。4. 未使用完的酶標(biāo)板或者試劑，請(qǐng)于2-8£保存。標(biāo)準(zhǔn)品、生物素標(biāo)記抗體 工作液、辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記親和素工作液請(qǐng)依據(jù)所需的量配置使用。請(qǐng) 勿重復(fù)使用已稀釋過(guò)的標(biāo)準(zhǔn)品、生物素標(biāo)記抗體工作液或、辣根過(guò)氧化物 酶標(biāo)記親和素工作液。5. 建議檢測(cè)樣品時(shí)均設(shè)雙孔測(cè)定，以保證檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性。洗板方法手

12、工洗板方法：吸去（不可觸及板壁）或甩掉酶標(biāo)板內(nèi)的液體；在實(shí)驗(yàn)臺(tái)上 鋪墊幾層吸水紙，酶標(biāo)板朝下用力拍幾次；將推薦的洗滌緩沖液至少注入孔 內(nèi)，浸泡1-2分鐘。根據(jù)需要，重復(fù)此過(guò)程數(shù)次。自動(dòng)洗板：如果有自動(dòng)洗板機(jī)，應(yīng)在熟練使用后再用到正式實(shí)驗(yàn)過(guò)程中。計(jì)算以標(biāo)準(zhǔn)物的濃度為橫坐標(biāo)（對(duì)數(shù)坐標(biāo)），0D值為縱坐標(biāo)（普通坐標(biāo)），在半對(duì) 數(shù)坐標(biāo)紙上繪出標(biāo)準(zhǔn)曲線，根據(jù)樣品的0D值由標(biāo)準(zhǔn)曲線查出相應(yīng)的濃度；再 乘以稀釋倍數(shù)；或用標(biāo)準(zhǔn)物的濃度與0D值計(jì)算出標(biāo)準(zhǔn)曲線的直線回歸方程式, 將樣品的0D值代入方程式，計(jì)算出樣品濃度，再乘以稀釋倍數(shù)，即為樣品的 實(shí)際濃度。注意事項(xiàng)1. 當(dāng)混合蛋白溶液時(shí)應(yīng)盡量輕緩，避免起泡。2. 洗滌過(guò)