CHO細(xì)胞表達(dá)抗體

1、1會計學(xué)CHO細(xì)胞表達(dá)抗體細(xì)胞表達(dá)抗體酵母細(xì)胞哺乳動物細(xì)胞昆蟲細(xì)胞CHO 細(xì)胞細(xì)胞骨髓瘤細(xì)骨髓瘤細(xì)胞胞分泌內(nèi)源性蛋白；可用無血清培養(yǎng)DHFR缺陷型宿主細(xì)胞野生型宿主細(xì)胞DG44DUXB11CHO-K1CHO-SPcDNA3.3/Poptivec載體系統(tǒng)Life Technology公司GS基因表達(dá)系統(tǒng)基因表達(dá)系統(tǒng)瑞士的Lonza公司DHFR基因表達(dá)系基因表達(dá)系統(tǒng)統(tǒng)Life Technology公司Freedom CHO-S Kit宿主細(xì)胞：DG44質(zhì)粒：共轉(zhuǎn)染PcDNA3.3（Neo抗 性基因，￥2000）和Poptivec（DHFR標(biāo)記基因，￥3500）篩選試劑：G418（遺傳霉素）/MTX

2、 （氨甲喋呤）宿主細(xì)胞：CHO-K1SV質(zhì)粒：PEE12.4（Amp抗性，GS標(biāo)記基因，￥2000）篩選試劑：MSX（氨基亞砜蛋氨酸）宿主細(xì)胞：CHO-s Cells (cGMP-banked)質(zhì)粒：pCHO1.0（嘌呤霉素和DHFR標(biāo)記基因，￥10000）篩選試劑：Puromycin/MTX（氨甲喋呤）CHO Cell作用環(huán)節(jié)作用環(huán)節(jié)相應(yīng)策略相應(yīng)策略整合位點弱化選擇標(biāo)致基因；染色體定位篩選基因劑量弱化的可擴(kuò)增選擇標(biāo)志基因轉(zhuǎn)錄強(qiáng)啟動子、增強(qiáng)子、強(qiáng)轉(zhuǎn)錄終止信號、適宜的抗體基因結(jié)構(gòu)翻譯翻譯型增強(qiáng)子，適宜的抗體基因結(jié)構(gòu)加工組裝輕重鏈表達(dá)平衡，宿主細(xì)胞修飾分泌適宜的抗體分泌前導(dǎo)肽，適宜的抗體基因結(jié)構(gòu)其

3、他選擇適宜的宿主細(xì)胞、宿主細(xì)胞修飾，盡量去除非生產(chǎn)性克隆抗體mRNA的轉(zhuǎn)錄、轉(zhuǎn)錄效率與mRNA的穩(wěn)定性是其中最重要的因素因此，抗體的表達(dá)量很大程度上由質(zhì)粒載體的各表達(dá)調(diào)控元件及組織方式?jīng)Q定表達(dá)載體結(jié)構(gòu)組成u 骨架序列u 選擇性標(biāo)志基因選擇性標(biāo)志基因u 表達(dá)盒表達(dá)盒u 特殊的調(diào)控序列大腸桿菌復(fù)制子及抗生素抗性基因在原核細(xì)胞中大量擴(kuò)增和制備原核基因原核基因序列序列在哺乳動物中有效的轉(zhuǎn)錄啟動子、增強(qiáng)子元件、終止子PolyA序列在CHO細(xì)胞中大量表達(dá)目的蛋白真核真核基因基因序列序列抗生素類篩選標(biāo)（Neo）細(xì)胞代謝類篩選標(biāo)記(MTX MSX)篩選出穩(wěn)定表達(dá)較多抗體的細(xì)胞株篩選標(biāo)記篩選標(biāo)記選擇標(biāo)志基因選擇

4、標(biāo)志基因共擴(kuò)增基因共擴(kuò)增基因（DFHR和GS）非擴(kuò)增基因非擴(kuò)增基因（neo）當(dāng)環(huán)境中存在高濃度（MTX 、MSX）時，標(biāo)記基因可自發(fā)在染色體上擴(kuò)增拷貝數(shù)，連帶其上下游的序列一起擴(kuò)增，共擴(kuò)增序列可達(dá)上千個bp，拷貝數(shù)可增加幾百到幾千倍。對目的基因的拷貝數(shù)沒有影響，如主要用于構(gòu)建瞬時表達(dá)載體。抗體基因表達(dá)盒的組抗體基因表達(dá)盒的組織形式已較為固定，織形式已較為固定，但其中各元件的選擇但其中各元件的選擇仍有值得探討的地方仍有值得探討的地方啟動子啟動子啟動子下游有真核的核糖體進(jìn)入位點，通常為GCCGCC A/GCCAUGG+4的共有序列IRES具有較強(qiáng)的起始翻譯的能力，研究發(fā)現(xiàn)，某些動物的基因前存在類似

5、IRES的序列，可以獨立啟動翻譯，并且翻譯效率很高，可稱之為翻譯型增強(qiáng)子核糖體進(jìn)入核糖體進(jìn)入位點位點影響mRNA的有效合成和穩(wěn)定性，提高胞漿中能進(jìn)行有效翻譯的 mRNA濃度，提高表達(dá)水平。使用廣泛的有BGH polyA site，轉(zhuǎn)錄終止作用強(qiáng)于SV40.轉(zhuǎn)錄終止信轉(zhuǎn)錄終止信號和號和PolyA加尾信號加尾信號啟動子和相應(yīng)的增強(qiáng)子是最關(guān)鍵的元件真核啟動子含有TATA盒（確定轉(zhuǎn)錄起始位點）和下游富含GC的序列（決定轉(zhuǎn)錄起始頻率）常用的CHO細(xì)胞表達(dá)啟動子的轉(zhuǎn)錄活性依次為C M V 啟 動 子 SV40 啟動子 LTR啟動子 PcDNA3.3/Poptivec載體系統(tǒng)GS系統(tǒng)DHFR系統(tǒng) 常用常用的

6、較早的商業(yè)的較早的商業(yè)化載體系統(tǒng)化載體系統(tǒng)適用于適用于DHFR缺陷缺陷細(xì)胞，但是有報道細(xì)胞，但是有報道CHO（DHFR-)細(xì)細(xì)胞，很難馴化，生胞，很難馴化，生長也長也不好。不好。DHFR系統(tǒng)表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)水平雖較水平雖較GS系系統(tǒng)低，但細(xì)胞統(tǒng)低，但細(xì)胞生長穩(wěn)定生長穩(wěn)定新近發(fā)展的更新近發(fā)展的更有效的有效的系統(tǒng)系統(tǒng)具有具有更高的擴(kuò)更高的擴(kuò)增增效率，效率，但細(xì)但細(xì)胞長期連續(xù)培胞長期連續(xù)培養(yǎng)時，生長狀養(yǎng)時，生長狀況不佳。況不佳。 將右圖質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染將右圖質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染CHO（DHFR-）u 宿主菌須在含有GHT（甘氨酸、次黃嘌呤、胸腺嘧啶）的培養(yǎng)基中生長u 重組質(zhì)粒Poptivec-target整合到宿主菌染

7、色體組上后的陽性菌可在不含GHT的培養(yǎng)基中生長。u 進(jìn)一步用G418和MTX篩選，在MTX濃度選擇壓力下，dhfr基因與其共轉(zhuǎn)染的目的基因一起擴(kuò)增，提高目的蛋白表達(dá)。Sigma、藥明康德等公司都在自己構(gòu)建載體使用（只要知道載體的幾個原件可以自己全部合成）宿主細(xì)胞：CHO-K1質(zhì)粒：PEE12.4篩選試劑：MSX（氨基亞砜蛋氨酸）瑞士的瑞士的Lonza公司公司 1992年，Bebbington等首次使用GS基因細(xì)胞系統(tǒng)表達(dá)重組抗體 PEE12.4PEE12.4412.4GS宿主宿主：CHO-S Cell （cGMP-banked）培液培液：CD-FortiCHO Medium 限制性內(nèi)切酶限制性

8、內(nèi)切酶： AvrII/BstZ17I ，EcoRV /Pacl線性化酶線性化酶：NruI轉(zhuǎn)化轉(zhuǎn)化：Neon electroporation Transfection篩選試劑篩選試劑：Puromycin/MTX篩選方法篩選方法：兩輪加壓篩選單單克隆篩選克隆篩選：有限稀釋法u 四氫葉酸是一碳單位的載體，在核苷酸的合成中起到重要作用。u 當(dāng)葉酸類似物MTX不可逆結(jié)合后，阻止四氫葉酸合成。細(xì)胞必須產(chǎn)生更多的DHFR才能維持細(xì)胞代謝。DHFR（二氫葉酸還原酶）篩選原理u 小梯度多次加壓有利于最終得到穩(wěn)定的高表達(dá)細(xì)胞株。u 大幅度加壓可以在短期內(nèi)得到高表達(dá)克隆株細(xì)胞，但是細(xì)胞株表達(dá)不穩(wěn)定，在撤掉篩選壓力后

9、，表達(dá)水平往往下降。THEENDTHANK YOU ！分泌內(nèi)源性蛋白；可用無血清培養(yǎng)DHFR缺陷型宿主細(xì)胞野生型宿主細(xì)胞DG44DUXB11CHO-K1CHO-SPcDNA3.3/Poptivec載體系統(tǒng)Life Technology公司GS基因表達(dá)系統(tǒng)基因表達(dá)系統(tǒng)瑞士的Lonza公司DHFR基因表達(dá)系基因表達(dá)系統(tǒng)統(tǒng)Life Technology公司Freedom CHO-S Kit宿主細(xì)胞：DG44質(zhì)粒：共轉(zhuǎn)染PcDNA3.3（Neo抗 性基因，￥2000）和Poptivec（DHFR標(biāo)記基因，￥3500）篩選試劑：G418（遺傳霉素）/MTX （氨甲喋呤）宿主細(xì)胞：CHO-K1SV質(zhì)粒：P

10、EE12.4（Amp抗性，GS標(biāo)記基因，￥2000）篩選試劑：MSX（氨基亞砜蛋氨酸）宿主細(xì)胞：CHO-s Cells (cGMP-banked)質(zhì)粒：pCHO1.0（嘌呤霉素和DHFR標(biāo)記基因，￥10000）篩選試劑：Puromycin/MTX（氨甲喋呤）CHO Cell表達(dá)載體結(jié)構(gòu)組成u 骨架序列u 選擇性標(biāo)志基因選擇性標(biāo)志基因u 表達(dá)盒表達(dá)盒u 特殊的調(diào)控序列大腸桿菌復(fù)制子及抗生素抗性基因在原核細(xì)胞中大量擴(kuò)增和制備原核基因原核基因序列序列在哺乳動物中有效的轉(zhuǎn)錄啟動子、增強(qiáng)子元件、終止子PolyA序列在CHO細(xì)胞中大量表達(dá)目的蛋白真核真核基因基因序列序列抗生素類篩選標(biāo)（Neo）細(xì)胞代謝類篩選標(biāo)記(MTX MSX)篩選出穩(wěn)定表達(dá)較多抗體的細(xì)胞株篩選標(biāo)記篩選標(biāo)記 將右圖質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染將右圖質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染CHO（DHFR-）u 宿主菌須在含有GHT（甘氨酸、次黃嘌呤、胸腺嘧啶）的培養(yǎng)基中生長u 重組質(zhì)粒Poptivec-target整合到宿主菌染色體組上后的陽性菌可在不含GHT的培養(yǎng)基中生長。u 進(jìn)一步用G418和MTX篩選，在MTX濃度選擇壓力下，dhfr