色譜分析（中國藥科大學(xué)） 第2章 色譜法的基本參數(shù)及理論

1、.第二章 色譜法的基本參數(shù)及理論一、色譜分離與保留作用色譜的保留作用：在色譜系統(tǒng)中，當(dāng)樣品混合物被流動相帶入柱內(nèi)后，便在固定相與流動相之間不斷地進(jìn)行分配平衡。不同的化合物由于他們之間理化性質(zhì)的差異，在兩相中存在量的比值也各不相同。固定相中存在量多的化合物，沖出柱子所需消耗流動相的量就多，較慢地被從色譜柱中被洗脫出來。流動相中存在的比例大的化合物，沖洗出柱子所需消耗流動相的量就少，較快地被從色譜柱中被洗脫出來。這種現(xiàn)象就稱為色譜的保留作用。圖 2-1 色譜分離示意圖樣品組分在兩相間分配平衡時，其在兩相中存在量的比值稱為容量因子(capacity factor) k，又稱分配比（partion r

2、atio）或分配容量。k = 式中，Ms：組分在固定相中的量，MM：組分在流動相中的量。在固定相中的量為零的化合物，其k=0，這些組分被稱為在該色譜條件下的非保留物質(zhì)。容量因子（分配比）可通過實驗計算：k = 。即k為組分在固定相中消耗的時間與其在流動相中消耗的時間之比。樣品組分在兩相中分配平衡時，其在固定相和流動相中的濃度比稱為分配系數(shù)（partion factor），分配系數(shù)以K表示。其公式如下：K = = k· 式中，Ms/Vs為樣品組分在固定相中的濃度，Mm/Vm為樣品組分在流動相中的濃度。分配系數(shù)大的組分保留時間長（色譜的保留作用強(qiáng)），分配系數(shù)小的組分保留時間短（色譜的保留

3、作用弱）。K = k· = k· 式中 = 稱為相比率，即色譜柱中流動相體積與固定相體積之比。例在毛細(xì)管GC中壁涂空心柱的相比為： = = = 式中r為毛細(xì)管柱橫截面的半徑，df為柱內(nèi)壁固定液的膜厚。二、保留值1. 保留時間與保留體積保留時間（tR）：從進(jìn)樣到柱后出現(xiàn)濃度最大值所需的時間。保留體積（VR）：從進(jìn)樣到柱后出現(xiàn)濃度最大值所需消耗流動相的體積。VR = tR·Fc (Fc為流動相的流速)實驗中Fc值的求法： HPLC直接從儀器讀取 GC采用皂膜流量計在柱后測得 柱后載氣肥皂液1020302. 死時間（tM）和死體積（VM）t M：不保留物質(zhì)從進(jìn)樣開始到柱

4、后出現(xiàn)濃度最大值所需時間。VM：不保留物質(zhì)從進(jìn)樣開始到柱后出現(xiàn)濃度最大值所需消耗流動相的體積。在以甲醇-水系統(tǒng)為流動相的反相HPLC中，甲醇峰的保留時間可近似看作死時間。在GC中，空氣峰（GC-ECD中）的保留時間和甲烷峰（GC-FID中）的保留時間可近似看作死時間。（1） GC中tM的準(zhǔn)確求算方法：tM = 式中tR（n+i）、tR（n）、tR（n-i）為同系物（如正構(gòu)烷烴）中間隔碳原子數(shù)相等的組分的保留時間。Cn Cn-i = Cn+i Cn（2） HPLC中tM的測法：將流動相中溶劑峰峰的保留時間可近似看作死時間。3. 調(diào)整保留時間（tR）和調(diào)整保留體積（VR）tR為扣除死時間的保留值t

5、R = tR - tM VR = VR VM k = tR/ tM4. 相對保留值（relative retention volume）相對保留值1,2為被測組分的調(diào)整保留時間tR1與標(biāo)準(zhǔn)物的調(diào)整保留時間tR2之比。其公式如下：1,2 = = = = （k = tR/ tM）式中腳注號1表示被測物，2表示標(biāo)準(zhǔn)物。采用相對保留值，是為了消除某些操作條件，如流速和固定液流失等對保留值的影響。相對保留值中標(biāo)準(zhǔn)物可以是被測樣品中的某一組分，也可以是人為地加入的某一化合物。1,2僅為柱溫、固定液性質(zhì)的函數(shù)，而與其他實驗條件無關(guān)。1,2作為定性指標(biāo)的缺點是標(biāo)準(zhǔn)物不統(tǒng)一，其數(shù)值隨標(biāo)準(zhǔn)物的不同而不同。5. 保

6、留指數(shù)（用于GC）保留指數(shù)（retention index）又稱為柯瓦指數(shù)（Kovats index），是使用最廣泛并被國際上公認(rèn)的定性指標(biāo)，它具有重現(xiàn)性好（精度可達(dá)±0.1指數(shù)單位），標(biāo)準(zhǔn)物統(tǒng)一及溫度系數(shù)小等優(yōu)點。鑒于相對保留值存在標(biāo)準(zhǔn)物不統(tǒng)一，測量精度不夠高等問題。Kovats提出了統(tǒng)一用正構(gòu)烷烴系列作為標(biāo)準(zhǔn)物。把保留指數(shù)定義為：I x = 100 + 100N式中：I x為被測物的保留指數(shù) tRx為被測物的調(diào)整保留時間 N為正構(gòu)烷烴的碳原子數(shù)，如正己烷的N = 6 tRN及tR（N+1）分別為具有N個碳原子及（N+1）個碳原子的正構(gòu)烷烴的調(diào)整保留時間。（1）保留指數(shù)的定義及公式

7、來源保留指數(shù)：I（國際公認(rèn)，用于GC中鑒定，定性），相對值，用一系列正構(gòu)烷烴為基準(zhǔn)物。令正構(gòu)烷烴的保留指數(shù)為I = 100N（N為正構(gòu)烷烴的碳數(shù)）。被測物的保留指數(shù)Ix可用內(nèi)插法算出。內(nèi)插法的理論基礎(chǔ)為：正構(gòu)烷烴調(diào)整保留時間的對數(shù)（lg tR）與其相應(yīng)的碳數(shù)成線性關(guān)系。l g tR = a N + b (1)設(shè)待測物x，其調(diào)整保留時間為tRx ，兩正構(gòu)烷烴n CN 及n CN+n的碳數(shù)分別為N和N+n，其調(diào)整保留時間分別為tRN及tR（N+n） 。tRN tRx tR（N+n）tRNtRXtR(N+n)設(shè)待測物x相當(dāng)于正構(gòu)烷的碳數(shù)為nx根據(jù)(1)式，則： lg tR(N+n) = a (N+n

8、) + b (2) lg tRx = a nx + b (3) lg tRN = a N +b (4)(2) - (4) lg tR(N+n) - lg tRN = a·n (5)(3) - (4) lg tRx - lg tRN = a (nx N) (6)(6)/(5) = nx = N + n·故待測物x的保留指數(shù)如下：Ix = 100 nx = 100 N + 100 n·當(dāng)相鄰兩個正構(gòu)烷烴的碳數(shù)差值n = 1時，則 Ix = 100 N + 100·（2）保留指數(shù)的特點 保留指數(shù)僅與固定相的性質(zhì)及柱溫有關(guān)，與其他實驗條件無關(guān)，因此定性準(zhǔn)確度比t

9、R等保留值準(zhǔn)確。習(xí)慣上將測定時的柱溫寫在I符號的下角，所用固定相寫在I符號的上角。例如I，即采用SE-30為固定相，柱溫在150進(jìn)行測試所得的保留指數(shù)。 同系物的保留指數(shù)與碳數(shù)呈線性關(guān)系。同系物中，相同的取代基有相同的保留指數(shù)增量。例：正構(gòu)烷及正構(gòu)醇的Ix Nc曲線如下：醇Ix=100Nc+b醇烷Ix=100Nc+b烷IxNcb烷=0兩線平行b醇 b 烷 = 0，即相同碳數(shù)的正構(gòu)醇總是比相同碳數(shù)的正構(gòu)烷的Ix 高，且高出的值為一定值，即b醇。b醇為醇羥基（-OH）對保留指數(shù)做出的貢獻(xiàn)。也即-OH使得醇類的色譜保留大于烷類（相同碳數(shù)時）。三、保留值與容量因子及分配系數(shù)的關(guān)系1. 保留值與容量因子

10、k t R = tM（1 + k）由此可見容量因子k大的組分其保留時間長。例：在某色譜系統(tǒng)中，系統(tǒng)的死時間為0.5，某樣品組分在該系統(tǒng)中的容量因子為5，問該組分進(jìn)樣后需多長時間可出峰。解：tR = tM（1 + k） = 0.5（1+5） = 3 min2. 保留值與分配系數(shù) tR = tM（1 + k） = tM（1 + K·VS/ VM）可見，（1）K 大 tR 大。（2）在相同色譜條件下，如兩組分的K值相同，則色譜峰重合；差別越大，色譜峰分離度越大。四、塔板理論（plate theory）為了研究色譜峰形狀及評價柱效，建立了塔板理論。將色譜柱假想成由許多塔板所組成，在每個塔板上

11、，組分在兩相間達(dá)成一次平衡。 經(jīng)多次分配平衡后，各組分由于分配系數(shù)不同而彼此分離。當(dāng)塔板數(shù)足夠多時，色譜流出曲線可用高斯（Gaussian）分布表示：C = ·e 式中C為時間t時組分的濃度，W為被分離組分的重量，tR為對應(yīng)于濃度極大點時的時間（即保留時間），為標(biāo)準(zhǔn)偏差。此方程的圖形如下所示：（一）峰高及峰寬度峰高h(yuǎn)為濃度極大值，即圖中的AB。峰寬度可用以下三種方法表示：標(biāo)準(zhǔn)偏差：即圖曲線拐點處寬度的一半，即EF的一半。半高峰寬Wh/2：（半峰寬，半寬度）即峰高一半處的寬度，如圖中的GH，符號，Wh/2 = 2.354。峰寬Wb：從峰兩邊的拐點作切線與基線相交部分的寬度（I J），又

12、稱基線寬度。Wb = 4。（二）理論板數(shù)與板高柱效可用理論板數(shù)來表示，計算公式如下：n = 柱效通常用單位柱長的理論板數(shù)來表達(dá)，即每米的理論板數(shù)（n/L）。柱效也可以用相當(dāng)于一個理論塔板的高度表示，即：H = L/n該式的意義是一個理論板所占據(jù)的柱長，以毫米（mm）為單位。由于死時間的存在，n和H不能確切地反映柱效，尤其是對那些出峰早的組分，因此又提出了有效的塔板數(shù)及有效板高的概念。 = · = N·(Heff = 五、速率理論塔板理論對評價柱效是有用的，但沒有討論影響柱效的因素。Van Deemter等考察了多種影響柱效的因素，導(dǎo)出了如下關(guān)系式（Van Deemter曲線

13、方程）：H = A + B/ + C （1）式中，H為板高，為流動相的線速度。Van Deemter曲線方程描述了色譜峰柱內(nèi)展寬的三種因素：渦流擴(kuò)散項A；縱向擴(kuò)散項（或稱分子擴(kuò)散項）B/；傳質(zhì)速率項C 。1、 渦流擴(kuò)散項A = 2 dp （2）式中， 為柱填充不規(guī)則因子；dp為填充物的平均顆粒直徑。若柱子填裝的不均勻或填料顆粒直徑不均勻，流動相流過時就會由于流速不同而形成渦流擴(kuò)散，使峰展寬。dp A ，n，峰展寬填充不均勻 A ，n，峰展寬2、 縱向擴(kuò)散項（分子擴(kuò)散項）試樣分子在色譜柱內(nèi)被流動相帶向前時，由分子本身運動引起的軸向擴(kuò)散也會引起峰展寬。 = （3）式中，Dg為樣品組分在流動相中的擴(kuò)

14、散系數(shù)，為彎曲因子（亦稱曲折性校正因子）， 1。 Dg B/ H ，n , 峰展寬Dg與組分的性質(zhì)，流動相的性質(zhì)、溫度、壓力等有關(guān)。在GC中：增加載氣密度，即增加壓力及載氣分子量，可以降低Dg 。在HPLC中：分子在液體中的擴(kuò)散系數(shù)比在氣體中要小45個數(shù)量級，而流動相的線速度 10 mm/s。故在HPLC中B/很小，縱向擴(kuò)散可忽略不計。 彎曲因子柱中填料的存在阻礙了分子擴(kuò)散，故（3）式中引入曲折性校正因子 ， 1，空心毛細(xì)管柱 = 1 。 流動相流速 B/ H ，n , 峰展寬。3、傳質(zhì)速率項C （又稱傳質(zhì)阻力項）試樣分子被流動相帶著經(jīng)過色譜柱時，分子不斷的由流動相進(jìn)入固定相，同時又從固定相不

15、斷進(jìn)入到流動相。在這一過程中，由于傳質(zhì)速率不是很快，而流動相卻有相當(dāng)?shù)牧魉?，因此在兩相的界面難以達(dá)到真正的快速平衡，這就造成了流動相中試樣的分子較固定相中的試樣分子略微跑的快一點，這就引起了峰展寬。 實際濃度平衡濃度界面流動相固定相流動相流動方向C = · + · 流動相中的傳質(zhì)阻力 固定相中的傳質(zhì)阻力和分別為常數(shù)；dp為固定相的粒徑；df為固定相的膜厚；Dm為組分在流動相中的擴(kuò)散系數(shù)；Ds為組分在固定相中的擴(kuò)散系數(shù)。有關(guān)傳質(zhì)速率項C ： 在GC中：C = ···µ + 0.01·式中DL即DS，Dg即Dm = 0.01 =

16、 · 在HPLC中：C = + + ：固定相微孔內(nèi)的流動相，稱為滯留區(qū)流動相，它是不流動的，固定相的微孔越小越深，傳質(zhì)速率就越慢，峰展寬也就越大。式中， + = ， = Golay方程：對于毛細(xì)管柱，方程H = A + B/ + C 中，A 項不存在。Golay方程：H = B/ + C ，毛細(xì)管柱 = 1，故B = 2Dg(1) df C ，H ，n ,峰展寬。70年代80年代，GC中固定液的涂布量一般為10 20% 減小df 現(xiàn)在GC中固定液的涂布量多用1 5%(2) Ds，Dm H , n (3) C 將H對作圖，可得Van Deemter曲線：當(dāng)為最佳流動相流速opt時，C

17、opt = ，即 opt = ，但實際工作中為了節(jié)省時間，故采用的實際 opt 。Van Deemter 方程告訴我們：（1）要提高柱效，可 減小填料粒徑； 提高填裝均勻性； 減小固定液膜厚。（2）改變流速可獲得最佳柱效。六、引起峰展寬的柱外因素引起峰展寬的柱外因素主要為死體積。因此，降低柱外效應(yīng)對板高的影響，可以從如下幾方面著手：1. 盡量減小連接管線的長度。2. 采用細(xì)內(nèi)徑的管線為連接線。3. 采用小死體積的檢測器。4. 進(jìn)樣技術(shù)、方式也會引起峰展寬。5. 進(jìn)樣體積也是引起峰展寬的柱外因素之一，體積 峰展寬。七、分離度及其影響因素1、分離度（Resolution）分離度(R)用以衡量相鄰峰

18、的分離情況，由下式計算R = = （注：W = 4，W1/2 = 2.354）式中tR1及tR2分別為組分1、2的保留時間，W1及W2分別為組分1、2的峰寬。W1/2（1），W1/2（2）分別為組分1、2的半峰寬。12W1W212tR1tR2對于兩個等面積峰，R = 1.5，稱基線分離，兩組分達(dá)99.7%的分離。又稱6分離） R = 1，稱基本分離，兩組分達(dá)98%的分離。（又稱4分離） R = 1.25，達(dá)99.2%的分離。實際工作中，中華人民共和國藥典要求“除另有規(guī)定，分離度應(yīng)大于1.5”。3、 影響分離度的因素由上式可知，分離度不僅取決于兩組分的保留時間，也取決于其對應(yīng)色譜峰的寬度。相同的

19、分離度在高效或低效色譜系統(tǒng)中均可達(dá)到，因為，R與以下參數(shù)有關(guān)：R = k對R的貢獻(xiàn)：R k增加，R增加 當(dāng)k= 5 6時已足夠，對分離度的貢獻(xiàn)已基本上達(dá)到最大，再增加對分離度已無多大貢獻(xiàn)。上式稱“分離度方程”，式中n為理論塔板數(shù)，表示柱效；稱分離因子（表示分離選擇性）， = = k1， k2分別為兩組分的容量因子。分離因子（）：代表兩組分在相同色譜條件下的分離選擇性。在GC中：（1）填充柱分離 低柱效（n）高分離因子（）（2）毛細(xì)管分離高柱效（n）低分離因子（） GC中，對于填充柱，其柱效低，因而為了達(dá)到預(yù)期的分離度，選擇性是最重要的因素，因此，在填充柱GC色譜中，需提供許多種性質(zhì)不同的固定相

20、供選擇。而在高效毛細(xì)管GC中，只需使用幾種固定相就可分離復(fù)雜的混合物。4、 改善分離的一般原則：（1） 增加tR（= tR2 - tR1）（a） 增加柱長（b） 增加固定相的量（c） 選擇分離因子較大的色譜條件 . 降低柱溫 . 選擇不同的固定相（填充柱GC中常用） . 選擇不同的流動相（HPLC中常用）改善分離（a）、（b）、（c）三種措施的理論基礎(chǔ)如下：（a）增加柱長由公式R = 可以推導(dǎo)出對于長度不同的同一種色譜柱： = = （L1、L2分別為兩根柱的長度）R2 = R1 ·可見，增加柱長L2，（ ），可提高分離度（R2）。（b）增加固定相的量增加固定相的量，則k2 R （c）

21、降低柱溫對分離因子而言： = （Tb2 - Tb1）+ c式中，Tc為柱溫，Tb1和Tb2分別為組分1、2的沸點，c為常數(shù)，R為熱力學(xué)常數(shù)?？梢?，Tc R 。（2）減小譜帶寬度（峰寬）W 提高柱效，減小塔板高度（a） 使用顆粒更細(xì)的填料（b） 更小心、均勻的填充色譜柱 減小色譜系統(tǒng)的死體積如在填充經(jīng)典的制備柱（植化中用）時，經(jīng)常采用濕法裝柱。柱子裝好后一般要在流動相流動的情況下給出足夠的時間（24 48 h），讓固定相柱面不再沉降后，才能上樣品。 減小進(jìn)樣量八、系統(tǒng)適應(yīng)性試驗（System suitability test）用規(guī)定的對照品對儀器進(jìn)行試驗和調(diào)整，應(yīng)達(dá)到規(guī)定的要求；或規(guī)定分析狀態(tài)下

22、色譜柱的最小理論塔板數(shù)、分離度、重復(fù)性和拖尾因子。1、 色譜柱的理論塔板數(shù)（n）在選定的條件下，用對照品或內(nèi)標(biāo)計算色譜柱的理論塔板數(shù)，n = 5.54（2，若達(dá)不到規(guī)定的理論塔板數(shù)，則需更換色譜柱。2、 分離度定量分析時，為便于準(zhǔn)確測量，要求定量峰與其他峰或內(nèi)標(biāo)峰之間有較好的分離度。計算公式 R = ，除另有規(guī)定，R應(yīng)大于1.5。3、 拖尾因子（tailing factor）為保證測量精度，特別當(dāng)采用峰高法測量時，應(yīng)檢查待測物峰的拖尾因子（T）是否符合該品種項下的規(guī)定，或不同濃度進(jìn)樣的校正因子誤差是否符合要求。計算公式：T = 式中，W0.05 為0.05峰高處的峰寬，d1為峰高極大至峰前沿之

23、間的距離。除另有規(guī)定，T應(yīng)在0.95 1.05之間。對稱峰T = 1，拖尾峰T 1，前沿峰T 1。4、 重復(fù)性取各品種項下的對照品溶液，連續(xù)進(jìn)樣5次，除另有規(guī)定外，其峰面積測量值的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差應(yīng)不大于2.0%。也可按各品種校正因子測定項下，配制80%，100%和120%的對照品溶液，加入規(guī)定量的內(nèi)標(biāo)溶液，配成3種不同濃度的溶液，分別進(jìn)樣3次，計算平均校正因子，其相對標(biāo)準(zhǔn)偏差不應(yīng)大于2.0%。九、測定法定量測定時，可根據(jù)具體情況采用峰面積法或峰高法。測定雜質(zhì)含量時，須采用峰面積法。1、內(nèi)標(biāo)法加校正因子測定含量按各品種項下規(guī)定，配成含內(nèi)標(biāo)的校正因子測定用對照溶液，進(jìn)樣分析，計算校正因子：校正因子f

24、 = 式中：AS為內(nèi)標(biāo)的峰面積或峰高，AR為對照品的峰面積或峰高。CS為內(nèi)標(biāo)的濃度，CR為對照品的濃度。再取各品種項下，含有內(nèi)標(biāo)的供試品溶液進(jìn)樣分析。計算含量：含量（Cx）= f·式中，AX為供試品（或雜質(zhì)）峰面積或峰高；Cx為供試品（或雜質(zhì)）的濃度。f、AS、CS的意義同上。2、外標(biāo)法測定含量按各品種項下配制對照品溶液和供試品溶液，進(jìn)樣分析，計算含量：Cx = CR·， 式中符號意義同上。3、面積歸一化法該方法是測量各物質(zhì)峰的面積和色譜圖上除溶劑色譜峰以外的總色譜峰面積，計算各峰面積占總峰面積的百分率即得。該方法誤差大（因為各物質(zhì)在檢測器上的響應(yīng)不一定相同），只能粗略的考察供試品中各物質(zhì)的含量，一般不用于微量雜質(zhì)的檢查。4、標(biāo)準(zhǔn)曲線法采用5個以上濃度點制備隨行標(biāo)準(zhǔn)曲線，將待測樣品的響應(yīng)值代入標(biāo)準(zhǔn)曲線，計算含量。該方法主要用于各樣品中待測物濃度相差很大時采用，如生物樣品中待測物的高濃度樣品與低