hplc體內(nèi)藥物分析實用技術(shù)

1、體內(nèi)藥物分析實用技術(shù)體內(nèi)藥物分析實用技術(shù) 色譜法色譜法體內(nèi)藥物分析實用技術(shù)體內(nèi)藥物分析實用技術(shù) 本課程的主要內(nèi)容本課程的主要內(nèi)容123色譜技術(shù)的原理色譜技術(shù)的原理HPLC在治療藥物檢測中的方法學(xué)和分離技術(shù)在治療藥物檢測中的方法學(xué)和分離技術(shù) 體內(nèi)藥物分析方法應(yīng)用示例體內(nèi)藥物分析方法應(yīng)用示例第一節(jié)第一節(jié) 色譜基礎(chǔ)理論色譜基礎(chǔ)理論 色譜法色譜法 （Chromatography） 又叫層析法又叫層析法, ,其本質(zhì)是一種分離分析方法其本質(zhì)是一種分離分析方法 100多年前俄國植物學(xué)家多年前俄國植物學(xué)家Tswett分離植物色素時采用的分離植物色素時采用的實驗方法實驗方法 色譜法色譜法 薄層色譜薄層色譜 將供

2、試品溶液點樣于薄層板上，經(jīng)展開、檢視后將供試品溶液點樣于薄層板上，經(jīng)展開、檢視后得到的色譜圖，與適宜的對照物按同法所得的色譜圖得到的色譜圖，與適宜的對照物按同法所得的色譜圖作對比，用于藥品的鑒別或雜質(zhì)檢查作對比，用于藥品的鑒別或雜質(zhì)檢查 色譜法色譜法 高效液相色譜高效液相色譜 氣相色譜氣相色譜 毛細管電色譜毛細管電色譜 色譜法色譜法 色譜法原理色譜法原理 是利用混合物中各組份在不同的兩相中是利用混合物中各組份在不同的兩相中溶解溶解, ,分配分配, ,吸附吸附等化學(xué)作用性能的差異等化學(xué)作用性能的差異, ,當(dāng)兩相作相對運動時當(dāng)兩相作相對運動時, ,使各組分在兩使各組分在兩相中反復(fù)多次受到上述各作用

3、力而達到相互分離相中反復(fù)多次受到上述各作用力而達到相互分離 兩相中有一相是固定的兩相中有一相是固定的,叫作固定相叫作固定相(Stationary Phase),有一相有一相是流動的是流動的,稱為流動相稱為流動相(Mobile Phase） 相相( (Phase) ): : 物理化學(xué)術(shù)語物理化學(xué)術(shù)語, ,特指在某一系統(tǒng)中特指在某一系統(tǒng)中, ,具有相同成分及相同物具有相同成分及相同物理、化學(xué)性質(zhì)的均勻物質(zhì)部分。各相之間有明顯可分的界面理、化學(xué)性質(zhì)的均勻物質(zhì)部分。各相之間有明顯可分的界面 色譜法原理色譜法原理 固定相固定相(Stationary Phase)流動相流動相(Mobile Phase)進

4、樣進樣 (Injection)洗脫洗脫 (Elution)相互作用相互作用(Interaction)分離是一個分離是一個物理過程物理過程 色譜法的分類色譜法的分類 按流動相的物態(tài)按流動相的物態(tài) 氣相色譜氣相色譜 (Gas Chromatography, GC) 用氣體作為流動相用氣體作為流動相( (又叫載氣又叫載氣) ) 適合分析較易揮發(fā)、且化學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定的有機化合物適合分析較易揮發(fā)、且化學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定的有機化合物液相色譜液相色譜 (Liquid Chromatography, LC) 用液體作為流動相用液體作為流動相( (又叫洗脫劑又叫洗脫劑) ) 適合于分析那些用氣相色譜難以分析的物質(zhì)，如揮發(fā)適

5、合于分析那些用氣相色譜難以分析的物質(zhì)，如揮發(fā)性差、極性強、具有生物活性、熱穩(wěn)定性差的物質(zhì)。性差、極性強、具有生物活性、熱穩(wěn)定性差的物質(zhì)。 氣相色譜應(yīng)用氣相色譜應(yīng)用 環(huán)境領(lǐng)域中多環(huán)芳烴（環(huán)境領(lǐng)域中多環(huán)芳烴（PAHs）的分析（水樣品）的分析（水樣品） 液相色譜應(yīng)用液相色譜應(yīng)用 樣品中農(nóng)藥殘留的分析樣品中農(nóng)藥殘留的分析 色譜法的分類色譜法的分類 按分離過程的機理按分離過程的機理 吸附色譜吸附色譜 分配色譜分配色譜 離子交換色譜離子交換色譜 體積排除色譜體積排除色譜 親和色譜親和色譜液固吸附色譜液固吸附色譜 氣固吸附色譜氣固吸附色譜液液分配色譜液液分配色譜 氣液分配色譜氣液分配色譜各種液相色譜法的比較

6、各種液相色譜法的比較液固吸附色譜液固吸附色譜液液分配色譜液液分配色譜離子色譜離子色譜體積排阻色譜體積排阻色譜親和色譜親和色譜固定相固定相 全多孔固體吸全多孔固體吸附劑附劑 固定液載帶在固定液載帶在固相基體上固相基體上 高效微粒高效微粒離子交換離子交換劑劑 具有不同孔徑具有不同孔徑的多孔性凝膠的多孔性凝膠 多種不同性多種不同性能的配位體能的配位體鍵聯(lián)在固相鍵聯(lián)在固相基體上基體上 流動相流動相 不同極性有機不同極性有機溶劑溶劑 不同極性有機不同極性有機溶劑和水溶劑和水 不同不同pH值值的緩沖溶的緩沖溶液液 有機溶劑或一有機溶劑或一定定pH值的緩沖值的緩沖溶液溶液 不同不同pH值值的緩沖溶液，的緩沖

7、溶液，可加入改性可加入改性劑劑 主要應(yīng)主要應(yīng)用范圍用范圍異構(gòu)體分離、異構(gòu)體分離、族分離族分離有機化合物有機化合物離子化合離子化合物物大分子量化合大分子量化合物物 、聚合物、聚合物酶、抗體酶、抗體 按分離過程按分離過程液相色譜分離類型選擇參考表液相色譜分離類型選擇參考表 溶于水溶于水排阻色譜，水為流動相排阻色譜，水為流動相 相對分子質(zhì)量相對分子質(zhì)量 2000 不溶于水不溶于水排阻色譜，非水流動相排阻色譜，非水流動相 同系物同系物分配色譜分配色譜 不溶于水不溶于水 異構(gòu)體異構(gòu)體吸附色譜吸附色譜樣品樣品 分子大小差異分子大小差異排阻色譜排阻色譜 反相液反相液液色譜液色譜 相對分子質(zhì)量相對分子質(zhì)量 溶

8、于水，不離解溶于水，不離解 2000 排阻色譜，水為流動相排阻色譜，水為流動相 堿堿陽離子交換色譜陽離子交換色譜 溶于水，可離解溶于水，可離解 酸酸陰離子交換色譜陰離子交換色譜 溶于水，溶于水， 離子與非離子離子與非離子反相離子對色譜反相離子對色譜 高效液相色譜法高效液相色譜法 高效液相色譜法高效液相色譜法 (High performance Liquid Chromatography，HPLC) 是在經(jīng)典液相色譜法的基礎(chǔ)上，于是在經(jīng)典液相色譜法的基礎(chǔ)上，于60年代后期引年代后期引入了氣相色譜理論而迅速發(fā)展起來的。它與經(jīng)典液相入了氣相色譜理論而迅速發(fā)展起來的。它與經(jīng)典液相色譜法的區(qū)別是填料顆粒

9、小而均勻，小顆粒具有高柱色譜法的區(qū)別是填料顆粒小而均勻，小顆粒具有高柱效，但會引起高阻力，需用高壓輸送流動相效，但會引起高阻力，需用高壓輸送流動相高效液相色譜法高效液相色譜法 高效液相色譜法的特點高效液相色譜法的特點 高壓：壓力可達高壓：壓力可達150300Kg/cm2 高速：流速為高速：流速為0.1 10.0 mL/min 高效：一根柱中同時分離成份可達高效：一根柱中同時分離成份可達100種種 高靈敏度：紫外檢測器靈敏度可達高靈敏度：紫外檢測器靈敏度可達0.011ng。消耗樣品少。消耗樣品少高效液相色譜儀高效液相色譜儀 Agilent 1100 HPLC溶劑，流動相溶劑，流動相色譜泵色譜泵自

10、動進樣器自動進樣器柱溫箱及柱溫箱及色譜柱色譜柱檢測器檢測器數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)流動相流動相 泵色色譜譜柱柱檢測檢測器器 輸輸液液系統(tǒng)系統(tǒng)分離分離系統(tǒng)系統(tǒng) 檢測檢測系統(tǒng)系統(tǒng)記錄記錄系統(tǒng)系統(tǒng)AEGBCDF進樣閥進樣閥進樣進樣系統(tǒng)系統(tǒng) 輸液系統(tǒng)輸液系統(tǒng)(1) (1) 高壓輸液泵高壓輸液泵l 主要部件之一，壓力：主要部件之一，壓力：150350105 Pa。l 應(yīng)具有壓力平穩(wěn)、脈沖小、流量穩(wěn)定可調(diào)、耐腐蝕等特性應(yīng)具有壓力平穩(wěn)、脈沖小、流量穩(wěn)定可調(diào)、耐腐蝕等特性l 輸液泵的穩(wěn)定性直接關(guān)系到分析結(jié)果的重復(fù)性和準(zhǔn)確性輸液泵的穩(wěn)定性直接關(guān)系到分析結(jié)果的重復(fù)性和準(zhǔn)確性 輸液系統(tǒng)輸液系統(tǒng)(2)梯度淋洗裝置梯度

11、淋洗裝置l外梯度（高壓梯度）外梯度（高壓梯度） l內(nèi)梯度（低壓梯度）內(nèi)梯度（低壓梯度） 進樣裝置進樣裝置 流路中為高壓力工作狀態(tài)，流路中為高壓力工作狀態(tài)， 通常使用耐高壓的六通閥通常使用耐高壓的六通閥進樣裝置進樣裝置 分離系統(tǒng)分離系統(tǒng) 分離系統(tǒng)的主要元件是色譜柱，它是色譜分離分離系統(tǒng)的主要元件是色譜柱，它是色譜分離過程中存放固定相的場所過程中存放固定相的場所symmetry C18 5m 4.6 250mm ColumnFLOW液固吸附色液固吸附色譜法譜法 液固吸附色液固吸附色譜譜 固定相通常是活性硅膠、氧化鋁、活性炭、聚乙烯、固定相通常是活性硅膠、氧化鋁、活性炭、聚乙烯、聚酰胺等固體吸附劑，

12、活性硅膠最常用聚酰胺等固體吸附劑，活性硅膠最常用 選擇流動相的基本原則選擇流動相的基本原則: :極性大的試樣用極性較強的流極性大的試樣用極性較強的流動相，極性小的則用低極性流動相動相，極性小的則用低極性流動相 吸附色譜是分離吸附色譜是分離幾何異構(gòu)體幾何異構(gòu)體的有效手段；不同的官能的有效手段；不同的官能團具有不同的吸附能，因此，吸附色譜可按團具有不同的吸附能，因此，吸附色譜可按族族分離化合物分離化合物高效液相色譜的固定相高效液相色譜的固定相液液分配色譜法固定相：液液分配色譜法固定相：固定液固定液載帶在載帶在固相基體固相基體上上 固相基體固相基體表面多孔型表面多孔型 基體是實心玻璃球，在玻璃球外面

13、覆蓋一層多孔活性基體是實心玻璃球，在玻璃球外面覆蓋一層多孔活性材料，相對死體積小，出峰迅速、柱效亦高；顆粒較大，材料，相對死體積小，出峰迅速、柱效亦高；顆粒較大，較適合做常規(guī)分析，最大允許量受到限制。較適合做常規(guī)分析，最大允許量受到限制。 全多孔型全多孔型 由直徑為由直徑為10nm的硅膠微粒凝聚而成。這類固定相由于的硅膠微粒凝聚而成。這類固定相由于顆粒很細（顆粒很細（510 m），孔仍然較淺，傳質(zhì)速率快，易實），孔仍然較淺，傳質(zhì)速率快，易實現(xiàn)高效、高速。特別適合復(fù)雜混合物分離及衡量分析?，F(xiàn)高效、高速。特別適合復(fù)雜混合物分離及衡量分析。液液分配色譜法液液分配色譜法 液液分配色譜法的固定液液液分配

14、色譜法的固定液 由于液相色譜中，流動相參與選擇作用，流動相極由于液相色譜中，流動相參與選擇作用，流動相極性的微小變化，都會使組分的保留值出現(xiàn)較大的差異。因性的微小變化，都會使組分的保留值出現(xiàn)較大的差異。因此，液相色譜中，只需幾種不同極性的固定液即可。如此，液相色譜中，只需幾種不同極性的固定液即可。如 ， 氧二丙腈（氧二丙腈（ODPN），聚乙二醇（），聚乙二醇（PEG），），十八烷十八烷（ODS , C18）和角鯊?fù)楣潭ㄒ旱群徒酋復(fù)楣潭ㄒ旱然瘜W(xué)鍵合固定相化學(xué)鍵合固定相: : 目前應(yīng)用最廣、性能最佳的固定相；目前應(yīng)用最廣、性能最佳的固定相；液液分配色譜法液液分配色譜法 液液色譜法按固定相和流動相的

15、極性不同可分為正相液液色譜法按固定相和流動相的極性不同可分為正相色譜法色譜法( (NPC) )和反相色譜法和反相色譜法( (RPC) )。 正相色譜正相色譜：流動相極性：流動相極性固定相極性固定相極性 正相柱也稱極性柱正相柱也稱極性柱 反相色譜反相色譜：流動相極性：流動相極性固定液極性固定液極性 反相柱也稱非極性柱反相柱也稱非極性柱 組分在兩種類型分離柱上的出峰順序相反組分在兩種類型分離柱上的出峰順序相反 正已烷聚乙二醇正已烷聚乙二醇水、甲醇水、甲醇 C18液相色譜分離模式液相色譜分離模式正相色譜法正相色譜法 采用極性固定相采用極性固定相( (如聚乙二醇、氨基與腈基鍵合相如聚乙二醇、氨基與腈基

16、鍵合相) )；流動相為相對非極性的疏水性溶劑流動相為相對非極性的疏水性溶劑( (烷烴類如正已烷、烷烴類如正已烷、環(huán)已烷），常加入乙醇、異丙醇、四氫呋喃、三氯甲烷環(huán)已烷），常加入乙醇、異丙醇、四氫呋喃、三氯甲烷等以調(diào)節(jié)組分的保留時間等以調(diào)節(jié)組分的保留時間 常用于分離常用于分離的化合物的化合物( (如酚類、如酚類、胺類、羰基類及氨基酸類等）胺類、羰基類及氨基酸類等） 液相色譜分離模式液相色譜分離模式 反相色譜法反相色譜法 一般用非極性固定相（如一般用非極性固定相（如C18、C8） 流動相為水或緩沖液，常加入甲醇、乙腈、異丙醇、流動相為水或緩沖液，常加入甲醇、乙腈、異丙醇、丙酮、四氫呋喃等與水互溶的

17、有機溶劑以調(diào)節(jié)保留時間丙酮、四氫呋喃等與水互溶的有機溶劑以調(diào)節(jié)保留時間 適用于分離適用于分離的化合物。的化合物。RPC在現(xiàn)代在現(xiàn)代液相色譜中應(yīng)用最為廣泛，據(jù)統(tǒng)計，它占整個液相色譜中應(yīng)用最為廣泛，據(jù)統(tǒng)計，它占整個HPLC應(yīng)用應(yīng)用的的80%左右左右液相色譜的流動相液相色譜的流動相常用溶劑的極性順序常用溶劑的極性順序 ( (最大最大) ) 乙腈乙腈 甲醇甲醇 二氧六環(huán)二氧六環(huán) 四氫呋喃四氫呋喃 正丁醇正丁醇 乙酸乙酯乙酸乙酯 乙醚乙醚 異丙醇異丙醇 二氯甲烷二氯甲烷 氯仿氯仿 四氯化碳四氯化碳 環(huán)己烷環(huán)己烷 正己烷正己烷 ( (最小最小) ) 在選擇溶劑時，溶劑的極性是選擇的重要依據(jù)在選擇溶劑時，溶

18、劑的極性是選擇的重要依據(jù)液相色譜的流動相液相色譜的流動相 對流動相溶劑的要求對流動相溶劑的要求 粘度小（粘度?。?cp) 沸點低沸點低 純度高純度高 價格低廉價格低廉 考慮檢測器的通用性考慮檢測器的通用性 毒性低，氣味小毒性低，氣味小 對樣品有足夠的溶解能力對樣品有足夠的溶解能力 液相色譜分離模式液相色譜分離模式 離子對色譜離子對色譜 把離子對試劑加入流動相中，被分析的樣品離子與把離子對試劑加入流動相中，被分析的樣品離子與離子對試劑生成不帶荷電的中性離子對，使分配系數(shù)增加，離子對試劑生成不帶荷電的中性離子對，使分配系數(shù)增加，改善分離效果改善分離效果 離子抑制色譜離子抑制色譜 通過調(diào)節(jié)流動相的通

19、過調(diào)節(jié)流動相的pH值，抑制樣品組分的解離，增值，抑制樣品組分的解離，增加它在固定相中的溶解度，以達到分離有機弱酸、弱堿的加它在固定相中的溶解度，以達到分離有機弱酸、弱堿的目的目的 檢測系統(tǒng)檢測系統(tǒng) 常用的檢測器常用的檢測器 紫外吸收檢測器（紫外吸收檢測器（UVD） 示差示差折光檢測器（折光檢測器（RID） 熒光檢測器（熒光檢測器（FD） 蒸發(fā)光散射檢測器（蒸發(fā)光散射檢測器（ELSD） 檢測系統(tǒng)檢測系統(tǒng) 檢測器的性能指標(biāo)檢測器的性能指標(biāo) （1）噪聲）噪聲 （2）基線漂移）基線漂移 （3）靈敏度）靈敏度 （4）線性范圍）線性范圍 （5）檢測器的池體積）檢測器的池體積 紫外檢測器紫外檢測器 原理原理

20、：用特定波長的紫外光照射樣品池，通過檢測：用特定波長的紫外光照射樣品池，通過檢測透光率透光率的變化來測定樣品濃度的檢測器。它具有波長固定，波長可變的變化來測定樣品濃度的檢測器。它具有波長固定，波長可變和光二極管陣列三種類型和光二極管陣列三種類型 特點：特點： 靈敏度較高靈敏度較高（10-9g） ，線形范圍寬，線形范圍寬 流通池可做的很?。魍ǔ乜勺龅暮苄。?mm 10mm ，容積，容積8L） 對流動相的流速和溫度變化不敏感對流動相的流速和溫度變化不敏感 對于紫外吸收檢測器，應(yīng)注意選用檢測波長比溶劑的紫對于紫外吸收檢測器，應(yīng)注意選用檢測波長比溶劑的紫外截止波長要長外截止波長要長 紫外檢測器紫外檢

21、測器 紫外檢測器的溶劑影響紫外檢測器的溶劑影響 不同種類溶劑及溶劑的質(zhì)量好壞對截止波長有影響不同種類溶劑及溶劑的質(zhì)量好壞對截止波長有影響 檢測波長選擇實例檢測波長選擇實例檢測波長通常選擇其最大吸收波長檢測波長通常選擇其最大吸收波長測定波長測定波長 由于很多成分在低波長均具有紫外吸收，故為避免干擾，由于很多成分在低波長均具有紫外吸收，故為避免干擾，通常不宜選低波長做測定波長通常不宜選低波長做測定波長光電二極管陣列檢測器光電二極管陣列檢測器 1024個二極管陣列，各檢測特定波長，計算機快速處理，個二極管陣列，各檢測特定波長，計算機快速處理，三維立體譜圖，如圖所示三維立體譜圖，如圖所示 紫外檢測器的

22、重要進展紫外檢測器的重要進展 熒光檢測器熒光檢測器原理原理：許多有機化合物，特別是芳香族化合物、被一許多有機化合物，特別是芳香族化合物、被一定強度和波長的紫外光照射后，發(fā)射出較激發(fā)光波長要長定強度和波長的紫外光照射后，發(fā)射出較激發(fā)光波長要長的熒光?；蚩梢耘c發(fā)熒光物質(zhì)反應(yīng)衍生化后檢測的熒光?；蚩梢耘c發(fā)熒光物質(zhì)反應(yīng)衍生化后檢測 特點：特點： 有非常高的靈敏度和良好的選擇性，靈敏度有非常高的靈敏度和良好的選擇性，靈敏度要比紫外檢測法高要比紫外檢測法高2 3個數(shù)量級（個數(shù)量級（10-12g） ，特別適合于藥，特別適合于藥物和生物化學(xué)樣品的分析物和生物化學(xué)樣品的分析熒光檢測器熒光檢測器不同檢測器的靈敏度

23、不同不同檢測器的靈敏度不同 示差折光檢測器示差折光檢測器 可連續(xù)檢測參比池和樣品池中流動相之間的折光指數(shù)差可連續(xù)檢測參比池和樣品池中流動相之間的折光指數(shù)差值。差值與濃度呈正比值。差值與濃度呈正比u 通用型檢測器（每種物質(zhì)具有不同的折光指數(shù)）通用型檢測器（每種物質(zhì)具有不同的折光指數(shù)）u 溫度變化要保持在溫度變化要保持在0.001、靈敏度低（、靈敏度低（10-6g）、）、 不能用于梯度洗脫不能用于梯度洗脫 蒸發(fā)光散射檢測器蒸發(fā)光散射檢測器原理原理：通過檢測：通過檢測光散射光散射程度而測定溶質(zhì)濃度的檢測器。光被散程度而測定溶質(zhì)濃度的檢測器。光被散射的程度取決于溶質(zhì)顆粒的大小與數(shù)量射的程度取決于溶質(zhì)顆

24、粒的大小與數(shù)量特點特點：通用型檢測器，消除了溶劑的干擾，不受溫度變化影響，通用型檢測器，消除了溶劑的干擾，不受溫度變化影響，靈敏度高靈敏度高 適合于無紫外吸收、無電活性和不發(fā)熒光的樣品的檢測適合于無紫外吸收、無電活性和不發(fā)熒光的樣品的檢測不允許使用含不揮發(fā)鹽組分的流動相不允許使用含不揮發(fā)鹽組分的流動相 體內(nèi)藥物分析體內(nèi)藥物分析 液相色譜圖分析液相色譜圖分析HPLC的的圖形圖形結(jié)果結(jié)果 色譜柱流出物通過檢測器時所產(chǎn)生的響應(yīng)信號對時間的曲線色譜柱流出物通過檢測器時所產(chǎn)生的響應(yīng)信號對時間的曲線圖，其縱坐標(biāo)為信號強度圖，其縱坐標(biāo)為信號強度,橫坐標(biāo)為時間橫坐標(biāo)為時間色譜峰色譜峰時間時間( (分分) )基

25、線基線峰高峰高峰寬峰寬響應(yīng)值響應(yīng)值色譜圖色譜圖( (Chromatogram) )液相色譜圖名詞術(shù)語液相色譜圖名詞術(shù)語(1) 色譜圖名詞術(shù)語色譜圖名詞術(shù)語: 死時間死時間(t0):不被固定相滯留的組分不被固定相滯留的組分,從進樣到出現(xiàn)峰最大值所從進樣到出現(xiàn)峰最大值所需的時間需的時間 保留時間保留時間(tR):組分從進樣到出現(xiàn)峰大值所需的時間組分從進樣到出現(xiàn)峰大值所需的時間 tR與固定相和流動相的性質(zhì)、固定相的量、柱溫、流速和柱與固定相和流動相的性質(zhì)、固定相的量、柱溫、流速和柱體積有關(guān)體積有關(guān)調(diào)整保留時間調(diào)整保留時間 tR= tRt0 色譜參數(shù)色譜參數(shù)容量因子，容量因子，k 在一定溫度下，組分在

26、兩相間分配達到平衡時的質(zhì)量比：在一定溫度下，組分在兩相間分配達到平衡時的質(zhì)量比：0R00Rtttttk容量因子容量因子k越大，保留時間越長越大，保留時間越長 色譜參數(shù)色譜參數(shù) k k取決于組分、流動相、固定相的性質(zhì)及溫度取決于組分、流動相、固定相的性質(zhì)及溫度、色譜柱中固定相、流動相色譜柱中固定相、流動相體積體積 色譜參數(shù)色譜參數(shù)分離因子分離因子（） 表示兩個相連組分的分離程度表示兩個相連組分的分離程度B)()(AARBRkktt= 1= 1.04.04 1.35 1.50 1.35 1.50 色譜參數(shù)色譜參數(shù) 與化合物在固定相和流動相中的分配性質(zhì)、柱與化合物在固定相和流動相中的分配性質(zhì)、柱溫有

27、關(guān)，與柱尺寸、流速、填充情況無關(guān)。溫有關(guān)，與柱尺寸、流速、填充情況無關(guān)。溫度對分離的影響溫度對分離的影響色譜參數(shù)色譜參數(shù)理論塔板數(shù)（理論塔板數(shù)（N）單位柱長的塔板數(shù)越多單位柱長的塔板數(shù)越多表明柱效越高表明柱效越高 色譜參數(shù)色譜參數(shù) 理論板數(shù)（理論板數(shù)（N） 計算供試品主成分或內(nèi)標(biāo)物質(zhì)的理論板數(shù)。如果測得理計算供試品主成分或內(nèi)標(biāo)物質(zhì)的理論板數(shù)。如果測得理論板數(shù)低于各品種項下規(guī)定的最小理論板數(shù)，應(yīng)改變色譜柱的論板數(shù)低于各品種項下規(guī)定的最小理論板數(shù)，應(yīng)改變色譜柱的某些條件某些條件-藥典通常要求不低于藥典通常要求不低于3000或或4000h225.54()RtnW色譜參數(shù)色譜參數(shù)提高柱效的方法（提高柱

28、效的方法（N） 色譜柱本身色譜柱本身減小填料的顆粒度減小填料的顆粒度 找到最佳的流速找到最佳的流速( (根據(jù)不同內(nèi)徑根據(jù)不同內(nèi)徑) ) 合適的溫度合適的溫度 降低溶劑的粘度降低溶劑的粘度 增加柱長增加柱長色譜參數(shù)色譜參數(shù)改變填料顆粒度改變填料顆粒度 色譜參數(shù)色譜參數(shù) 分離度（分離度（R） 在規(guī)定的條件下，注入對照液或供試液，記錄色譜圖，在規(guī)定的條件下，注入對照液或供試液，記錄色譜圖，按下式計算待測峰（定量峰）與相鄰峰的分離度。除另有按下式計算待測峰（定量峰）與相鄰峰的分離度。除另有規(guī)定，分離度應(yīng)大于規(guī)定，分離度應(yīng)大于1.521122()RRttRWW 色譜參數(shù)色譜參數(shù)不同不同R值的峰重疊情況示

29、意圖值的峰重疊情況示意圖R =1.0：分離程度：分離程度98%，基本分離基本分離R =1.5：達：達99.7% 完全分離完全分離 R太小，兩個峰無法徹底分離太小，兩個峰無法徹底分離 R太大，分離時間過長，工作效率低太大，分離時間過長，工作效率低 色譜參數(shù)色譜參數(shù))1()1(41)(221R1R2kkNWWttR理論塔板數(shù)理論塔板數(shù) 分離因子分離因子 容量因子容量因子從數(shù)學(xué)推導(dǎo)來看，分別增大從數(shù)學(xué)推導(dǎo)來看，分別增大N, , k值，都可以提高分離度值，都可以提高分離度R色譜參數(shù)色譜參數(shù)增大柱效增大柱效N,分離因子分離因子 ,容量因子容量因子 k值，都可以提高分離度值，都可以提高分離度R 色譜參數(shù)色

30、譜參數(shù)不同廠家色譜柱填料質(zhì)量對色譜柱影響不同廠家色譜柱填料質(zhì)量對色譜柱影響色譜參數(shù)色譜參數(shù) 影響分離度的系統(tǒng)因素影響分離度的系統(tǒng)因素 柱內(nèi)效應(yīng)柱內(nèi)效應(yīng) 柱外效應(yīng)柱外效應(yīng) 柱外峰變寬因素柱外峰變寬因素 進樣體積進樣體積 連接管道連接管道 接頭接頭 檢測器體積檢測器體積色譜參數(shù)色譜參數(shù) 拖尾因子（拖尾因子（T） 考察色譜峰的對稱性，保證測量的準(zhǔn)確度。特別是采考察色譜峰的對稱性，保證測量的準(zhǔn)確度。特別是采用峰高法測量時，應(yīng)檢查待測峰的用峰高法測量時，應(yīng)檢查待測峰的T是否符合規(guī)定。峰高定是否符合規(guī)定。峰高定量時量時T T應(yīng)在應(yīng)在0.951.05間，峰面積定量可適當(dāng)放寬至間，峰面積定量可適當(dāng)放寬至0.8

31、1.20.0512hWTd色譜參數(shù)色譜參數(shù)不同作用造成的峰脫尾不同作用造成的峰脫尾1 1 壞柱（燒結(jié)片堵塞，柱頭塌陷）壞柱（燒結(jié)片堵塞，柱頭塌陷）2 2 樣品超載樣品超載3 3 溶劑與樣品不相配溶劑與樣品不相配4 4 柱外效應(yīng)柱外效應(yīng)5 5 強保留基質(zhì)強保留基質(zhì)6 6 次保留效應(yīng)次保留效應(yīng)7 7 緩沖液不合適緩沖液不合適8 8 假脫尾假脫尾 高效液相色譜方法的建立高效液相色譜方法的建立 建立高效液相色譜方法：建立高效液相色譜方法：1. 選擇合適的分析樣品的液相色譜方法選擇合適的分析樣品的液相色譜方法2. 選擇合適的柱選擇合適的柱3. 選擇合適的選擇合適的 k 值的條件值的條件4. 確定良好的峰

32、位（確定良好的峰位（值值）5.5. 選擇良好的柱條件（最佳選擇良好的柱條件（最佳N值）值）6.6. 用實測樣品解決出現(xiàn)的特殊問題用實測樣品解決出現(xiàn)的特殊問題7.7. 證實方法的正確性證實方法的正確性 系統(tǒng)適應(yīng)性實驗系統(tǒng)適應(yīng)性實驗色譜條件舉例色譜條件舉例色譜柱：色譜柱：Dikma Kromasil C18（250 mm4.6 mm，5 m）流動相：甲醇流動相：甲醇0.4磷酸溶液（磷酸溶液（26 74）檢測波長：檢測波長：326 nm柱溫：柱溫：30流速：流速：0.8 mLmin-1進樣量：進樣量：10 L 系統(tǒng)適應(yīng)性實驗系統(tǒng)適應(yīng)性實驗 系統(tǒng)適應(yīng)性試驗即用各品種項下規(guī)定的對照品和條件對系統(tǒng)適應(yīng)性試

33、驗即用各品種項下規(guī)定的對照品和條件對色譜系統(tǒng)進行試驗，應(yīng)符合要求。否則可對色譜分離條件作色譜系統(tǒng)進行試驗，應(yīng)符合要求。否則可對色譜分離條件作適當(dāng)?shù)恼{(diào)整適當(dāng)?shù)恼{(diào)整。 理論板數(shù)理論板數(shù)N 柱效柱效 分離度分離度R 分離效果分離效果 拖尾因子拖尾因子T 色譜峰對稱性色譜峰對稱性 重復(fù)性重復(fù)性 精密度精密度 分離度和重復(fù)性是系統(tǒng)適用性試驗中更具實用意義的參數(shù)分離度和重復(fù)性是系統(tǒng)適用性試驗中更具實用意義的參數(shù) 理論板數(shù)、分離度、拖尾因子一般工作站均可自動計算理論板數(shù)、分離度、拖尾因子一般工作站均可自動計算 HPLC在在TDM中的方法學(xué)和分離技術(shù)中的方法學(xué)和分離技術(shù)樣品的種類、采集和貯存樣品的種類、采集和

34、貯存 血樣血樣 尿樣尿樣 唾液唾液樣品貯存的條件和貯存穩(wěn)定性考察樣品貯存的條件和貯存穩(wěn)定性考察全血全血血漿血漿 血清血清生物樣品的特點生物樣品的特點a)a) 樣品基質(zhì)復(fù)雜樣品基質(zhì)復(fù)雜b)b) 濃度低濃度低c)c) 濃度變化范圍大濃度變化范圍大d)d) 可供分析的樣品有限可供分析的樣品有限e)e) 樣品易變化樣品易變化f)f) 往往要求快速報告分析結(jié)果往往要求快速報告分析結(jié)果 測定方法測定方法A :A :空白血漿空白血漿 B :B :模擬血漿樣品模擬血漿樣品 C:C:血漿樣品血漿樣品血漿樣品的復(fù)雜性血漿樣品的復(fù)雜性 對處理方法要求較高對處理方法要求較高 建立建立生物樣品生物樣品含量測定方法學(xué)含量

35、測定方法學(xué) 1. 色譜色譜/ /測定條件選擇測定條件選擇 檢測波長的選擇檢測波長的選擇 色譜柱選擇：填料、柱長色譜柱選擇：填料、柱長 流動相種類、水相、流動相配比流動相種類、水相、流動相配比 等度洗脫、梯度洗脫等度洗脫、梯度洗脫 柱溫選擇柱溫選擇2. 標(biāo)準(zhǔn)品純度考察標(biāo)準(zhǔn)品純度考察 采用面積歸一化法，應(yīng)大于采用面積歸一化法，應(yīng)大于9898。含量測定方法學(xué)含量測定方法學(xué) 驗證的效能指標(biāo)與基本要求驗證的效能指標(biāo)與基本要求 1特異性（專屬性）特異性（專屬性） 避免干擾避免干擾 2標(biāo)準(zhǔn)曲線與線性范圍標(biāo)準(zhǔn)曲線與線性范圍覆蓋所有濃度范圍覆蓋所有濃度范圍 3準(zhǔn)確度準(zhǔn)確度 與實際狀況相符與實際狀況相符 4精密度

36、精密度 結(jié)果可重現(xiàn)結(jié)果可重現(xiàn) 5定量限定量限 達到峰濃度的達到峰濃度的1/101/20 6穩(wěn)定性穩(wěn)定性 確保所有樣品準(zhǔn)確測定確保所有樣品準(zhǔn)確測定 7提取回收率提取回收率 確保準(zhǔn)確度確保準(zhǔn)確度含量測定方法學(xué)含量測定方法學(xué)一、方法特異性一、方法特異性( (專屬性或選擇性專屬性或選擇性) ) 1. . 內(nèi)源性物質(zhì)的干擾內(nèi)源性物質(zhì)的干擾 2. 代謝產(chǎn)物的干擾代謝產(chǎn)物的干擾 3. 聯(lián)合藥物的干擾聯(lián)合藥物的干擾 含量測定方法學(xué)含量測定方法學(xué)二、標(biāo)準(zhǔn)曲線與線性范圍二、標(biāo)準(zhǔn)曲線與線性范圍 標(biāo)準(zhǔn)曲線標(biāo)準(zhǔn)曲線 生物樣品中所測定藥物濃度與響應(yīng)的相關(guān)性生物樣品中所測定藥物濃度與響應(yīng)的相關(guān)性 線性范圍線性范圍 標(biāo)準(zhǔn)曲線

37、的最高與最低濃度的區(qū)間標(biāo)準(zhǔn)曲線的最高與最低濃度的區(qū)間 標(biāo)準(zhǔn)曲線用模擬生物樣品建立標(biāo)準(zhǔn)曲線用模擬生物樣品建立 至少含至少含6 68 8個濃度點個濃度點( (不包括零點不包括零點, ,即空白即空白) ) 可覆蓋全部待測生物樣品中的藥物濃度可覆蓋全部待測生物樣品中的藥物濃度 含量測定含量測定 校正曲線只有在建立這條曲線的濃度范圍內(nèi)校正曲線只有在建立這條曲線的濃度范圍內(nèi)有效，高或低于這些點都可能引起計算錯誤有效，高或低于這些點都可能引起計算錯誤樣品濃度樣品濃度檢測器響應(yīng)檢測器響應(yīng)含量測定方法學(xué)含量測定方法學(xué) 外標(biāo)法外標(biāo)法 配制一系列已知濃度的標(biāo)樣配制一系列已知濃度的標(biāo)樣儲存標(biāo)樣儲存標(biāo)樣工作標(biāo)樣工作標(biāo)樣

38、12345增加溶質(zhì)的濃度增加溶質(zhì)的濃度含量測定方法學(xué)含量測定方法學(xué)含量測定方法學(xué)含量測定方法學(xué) 外標(biāo)法外標(biāo)法 測量對照品和供試品待測成分的峰面積（或峰高），測量對照品和供試品待測成分的峰面積（或峰高），按下式計算含量：按下式計算含量： 峰面積定量峰面積定量 A=a+b C 峰高定量峰高定量 h=a+b C含量測定方法學(xué)含量測定方法學(xué)外標(biāo)一點法為常用的定量計算方法外標(biāo)一點法為常用的定量計算方法XXRRACCA含量測定方法學(xué)含量測定方法學(xué)內(nèi)標(biāo)法內(nèi)標(biāo)法 配制一系列濃度的標(biāo)樣，其中加有內(nèi)標(biāo)樣配制一系列濃度的標(biāo)樣，其中加有內(nèi)標(biāo)樣儲存標(biāo)樣儲存標(biāo)樣工作標(biāo)樣工作標(biāo)樣12345增加溶質(zhì)的濃度增加溶質(zhì)的濃度+儲存

39、內(nèi)標(biāo)樣儲存內(nèi)標(biāo)樣內(nèi)標(biāo)樣濃度不變內(nèi)標(biāo)樣濃度不變含量測定方法學(xué)含量測定方法學(xué) 含量測定含量測定 內(nèi)標(biāo)法內(nèi)標(biāo)法 測量對照品和內(nèi)標(biāo)物質(zhì)的峰面積或峰高，按下式計測量對照品和內(nèi)標(biāo)物質(zhì)的峰面積或峰高，按下式計算校正因子：算校正因子：/SSRRACfAC 含量測定含量測定 再取各品種項下含有內(nèi)標(biāo)物質(zhì)的供試品溶液，注入再取各品種項下含有內(nèi)標(biāo)物質(zhì)的供試品溶液，注入儀器，記錄色譜圖，測量供試品中待測成分（或其雜質(zhì)）儀器，記錄色譜圖，測量供試品中待測成分（或其雜質(zhì)）和內(nèi)標(biāo)物質(zhì)的峰面積或峰高，按下式計算含量：和內(nèi)標(biāo)物質(zhì)的峰面積或峰高，按下式計算含量：/XXSSACfAC 含量測定含量測定對內(nèi)標(biāo)物的要求對內(nèi)標(biāo)物的要求a)

40、a) 化學(xué)結(jié)構(gòu)與待測組分相似化學(xué)結(jié)構(gòu)與待測組分相似( (同系物、異構(gòu)體同系物、異構(gòu)體) )b)b) 在樣品中不存在在樣品中不存在c)c) 不與樣品中組份發(fā)生任何化學(xué)反應(yīng)不與樣品中組份發(fā)生任何化學(xué)反應(yīng)d)d) 保留值與待測組分接近保留值與待測組分接近e)e) 濃度（響應(yīng)值）與待測組分相當(dāng)濃度（響應(yīng)值）與待測組分相當(dāng)f)f) 內(nèi)標(biāo)色譜峰與其他色譜峰分離好（內(nèi)標(biāo)色譜峰與其他色譜峰分離好（R1.5) )含量測定方法學(xué)含量測定方法學(xué) 三、準(zhǔn)確度三、準(zhǔn)確度用該方法測得的生物樣品中待測藥物的濃度與其真實濃用該方法測得的生物樣品中待測藥物的濃度與其真實濃度的接近程度度的接近程度 一般用相對回收率一般用相對回收

41、率( (RR) ) 或或 相對誤差相對誤差( (RE) )表示表示 應(yīng)使用實際生物樣品測定，分別添加高、中、低三組濃應(yīng)使用實際生物樣品測定，分別添加高、中、低三組濃度對照品度對照品 限度要求限度要求 相對回收率應(yīng)在相對回收率應(yīng)在85%115% ( (LOQ附近附近80%120%) RE在在15% ( (LOQ附近為附近為20%)含量測定方法學(xué)含量測定方法學(xué) 四、精密度四、精密度 系指每次測定結(jié)果與多次測定的平均值的偏離程度系指每次測定結(jié)果與多次測定的平均值的偏離程度 一般用標(biāo)準(zhǔn)偏差一般用標(biāo)準(zhǔn)偏差( (SD)或相對標(biāo)準(zhǔn)偏差或相對標(biāo)準(zhǔn)偏差( (RSD)表示表示 照準(zhǔn)確度項下方法，取空白生物基質(zhì)照準(zhǔn)

42、確度項下方法，取空白生物基質(zhì)( (如血漿如血漿) )數(shù)份，數(shù)份，分別在同一批內(nèi)和不同批間制備高、中、低分別在同一批內(nèi)和不同批間制備高、中、低 3 3個濃度的個濃度的QC樣品，并分析測定樣品，并分析測定限度要求限度要求 一般一般RSD應(yīng)小于應(yīng)小于15，在在LLOQ附近附近RSD應(yīng)小于應(yīng)小于20 含量測定方法學(xué)含量測定方法學(xué) 五、定量限五、定量限 定量下限定量下限測定樣品中符合準(zhǔn)確度和精密度要求的最低藥物濃度測定樣品中符合準(zhǔn)確度和精密度要求的最低藥物濃度 LLOQ應(yīng)能滿足測定應(yīng)能滿足測定35個消除半衰期時樣品中的藥個消除半衰期時樣品中的藥物濃度或能檢測出物濃度或能檢測出Cmax的的110120時的

43、藥物濃度。時的藥物濃度。 其準(zhǔn)確度應(yīng)在真實濃度的其準(zhǔn)確度應(yīng)在真實濃度的80%120%范圍內(nèi)，相對標(biāo)范圍內(nèi)，相對標(biāo)準(zhǔn)差準(zhǔn)差( (RSD) )應(yīng)小于應(yīng)小于20%。應(yīng)由至少。應(yīng)由至少5個標(biāo)準(zhǔn)樣品測試結(jié)果個標(biāo)準(zhǔn)樣品測試結(jié)果證明證明 含量測定方法學(xué)含量測定方法學(xué)六、穩(wěn)定性六、穩(wěn)定性 在生物樣品的分析中，需要對樣品的存放條件和時間在生物樣品的分析中，需要對樣品的存放條件和時間進行考察，以保證分析結(jié)果的準(zhǔn)確、可靠進行考察，以保證分析結(jié)果的準(zhǔn)確、可靠 取高、中、低三個濃度的取高、中、低三個濃度的QC樣品，在不同條件下存樣品，在不同條件下存放不同時間后，每個樣品重復(fù)測定三次，平均值應(yīng)為零時放不同時間后，每個樣品

44、重復(fù)測定三次，平均值應(yīng)為零時測定的測定的5以內(nèi)（經(jīng)衍生化處理以內(nèi)（經(jīng)衍生化處理15以內(nèi)）以內(nèi)）含量測定方法學(xué)含量測定方法學(xué) 七、萃取回收率七、萃取回收率 方法準(zhǔn)確度方法準(zhǔn)確度( (相對回收率相對回收率) ) 萃取回收率萃取回收率( (絕對回收率）絕對回收率） 萃取回收率與相對回收率的比較萃取回收率與相對回收率的比較 （1 1）萃取回收率主要考察生物樣品預(yù)處理過程造成的藥）萃取回收率主要考察生物樣品預(yù)處理過程造成的藥物的程度損失物的程度損失 （2 2）相對回收率主要用來考察測定方法的準(zhǔn)確度，采用）相對回收率主要用來考察測定方法的準(zhǔn)確度，采用標(biāo)準(zhǔn)曲線可準(zhǔn)確計算生物樣品中藥物濃度標(biāo)準(zhǔn)曲線可準(zhǔn)確計算生

45、物樣品中藥物濃度含量測定方法學(xué)含量測定方法學(xué) 萃取回收率萃取回收率 從生物樣本基質(zhì)中回收得到分析物質(zhì)的響應(yīng)值除以純標(biāo)從生物樣本基質(zhì)中回收得到分析物質(zhì)的響應(yīng)值除以純標(biāo)準(zhǔn)品產(chǎn)生的響應(yīng)值準(zhǔn)品產(chǎn)生的響應(yīng)值 應(yīng)考察高、中、低應(yīng)考察高、中、低3 3個濃度的提取回收率個濃度的提取回收率 限度要求限度要求高、中、低濃度樣品的萃取回收率一般應(yīng)高、中、低濃度樣品的萃取回收率一般應(yīng)50% 高、中濃度的高、中濃度的RSD應(yīng)應(yīng)15% 低濃度的低濃度的RSD應(yīng)應(yīng)20% 內(nèi)標(biāo)法中內(nèi)標(biāo)物質(zhì)的提取回收率應(yīng)內(nèi)標(biāo)法中內(nèi)標(biāo)物質(zhì)的提取回收率應(yīng)50%生物樣品預(yù)處理生物樣品預(yù)處理 1、除蛋白除蛋白： 加入與水混溶的有機溶劑加入與水混溶的有

46、機溶劑 加入中性鹽加入中性鹽 加入強酸加入強酸 加入含鋅鹽及銅鹽的沉淀劑加入含鋅鹽及銅鹽的沉淀劑 酶水解法酶水解法 超濾法超濾法 2、分離、純化與濃集分離、純化與濃集 液液- -液提取液提取 液液- -固提取固提取 3、綴合物的水解綴合物的水解 酸水解法酸水解法 酶水解法酶水解法 4 4、化學(xué)衍生化化學(xué)衍生化 柱前衍生柱前衍生 、 柱后衍生柱后衍生生物樣品的預(yù)處理生物樣品的預(yù)處理 考慮考慮：待測藥物的理化性質(zhì)、生物樣品種類、測：待測藥物的理化性質(zhì)、生物樣品種類、測 定方法等三方面因素。定方法等三方面因素。 1. 1. 除蛋白除蛋白 （）（）加入與水混溶的有機溶劑加入與水混溶的有機溶劑 常用常用

47、：乙腈、甲醇、乙醇、丙醇、丙酮、四氫呋喃等：乙腈、甲醇、乙醇、丙醇、丙酮、四氫呋喃等生物樣品的預(yù)處理生物樣品的預(yù)處理 （）加入中性鹽（）加入中性鹽 中性鹽能將與蛋白質(zhì)水合的水置換出來，從而使蛋白質(zhì)中性鹽能將與蛋白質(zhì)水合的水置換出來，從而使蛋白質(zhì)脫水而沉淀。脫水而沉淀。常用常用：飽和硫酸銨、硫酸鈉、鎂鹽、磷酸鹽：飽和硫酸銨、硫酸鈉、鎂鹽、磷酸鹽及枸櫞酸鹽等及枸櫞酸鹽等 （）加入強酸（）加入強酸 當(dāng)當(dāng)pH低于蛋白質(zhì)的等電點時，蛋白質(zhì)以陽離子形式存在。低于蛋白質(zhì)的等電點時，蛋白質(zhì)以陽離子形式存在。此時加入強酸，可與蛋白質(zhì)陽離子形成不溶鹽而沉淀此時加入強酸，可與蛋白質(zhì)陽離子形成不溶鹽而沉淀 常用常用：

48、三氯乙酸、高氯酸、硫酸：三氯乙酸、高氯酸、硫酸- -鎢酸混合液、偏磷酸鎢酸混合液、偏磷酸 在酸性條件下分解的藥物在酸性條件下分解的藥物不宜用不宜用本法除蛋白本法除蛋白生物樣品的預(yù)處理生物樣品的預(yù)處理 （）加入含鋅鹽及銅鹽的沉淀劑（）加入含鋅鹽及銅鹽的沉淀劑 當(dāng)當(dāng)pH高于蛋白質(zhì)的等電點時，金屬陽離子與蛋白質(zhì)分子高于蛋白質(zhì)的等電點時，金屬陽離子與蛋白質(zhì)分子中帶陰電荷的羧基形成不溶性鹽而沉淀中帶陰電荷的羧基形成不溶性鹽而沉淀 常用常用：硫酸銅：硫酸銅- -鎢酸鈉鎢酸鈉 、硫酸鋅、硫酸鋅- -氫氧化鈉氫氧化鈉 （）酶解法（）酶解法 在測定一些酸不穩(wěn)定及蛋白結(jié)合牢的藥物時，常需用酶在測定一些酸不穩(wěn)定及蛋

49、白結(jié)合牢的藥物時，常需用酶解法解法 最常用的酶是蛋白水解酶中的枯草菌溶素，它不僅可使最常用的酶是蛋白水解酶中的枯草菌溶素，它不僅可使組織組織酶解，并可使藥物析出酶解，并可使藥物析出生物樣品的預(yù)處理生物樣品的預(yù)處理 （6 6）超濾法）超濾法 以多孔性半透膜以多孔性半透膜- -超濾膜作為分離介質(zhì)的一種膜分離技超濾膜作為分離介質(zhì)的一種膜分離技術(shù)術(shù) 血液中血液中游離藥物游離藥物的測定可采用分子量截流值在的測定可采用分子量截流值在5 5萬左右萬左右的超濾膜，用加壓過濾法或高速離心法分離的超濾膜，用加壓過濾法或高速離心法分離 生物樣品的預(yù)處理生物樣品的預(yù)處理2.2.分離、純化與濃集分離、純化與濃集 提取的

50、目的是為了從大量共存物中分離出所需要的微提取的目的是為了從大量共存物中分離出所需要的微量組分量組分-藥物及其代謝物，并通過溶劑的蒸發(fā)使樣品得藥物及其代謝物，并通過溶劑的蒸發(fā)使樣品得到濃集到濃集 具有具有親脂性親脂性在適當(dāng)?shù)脑谶m當(dāng)?shù)膒H值下用值下用溶劑萃取溶劑萃取 蛋白結(jié)合較強蛋白結(jié)合較強不宜直接采用溶劑萃取不宜直接采用溶劑萃取 提取法包括液提取法包括液- -液萃取法和液液萃取法和液- -固萃取法固萃取法生物樣品的預(yù)處理生物樣品的預(yù)處理 液液- -液提取法液提取法 基于被測組分在不相混溶的兩種溶劑中的分配系數(shù)不基于被測組分在不相混溶的兩種溶劑中的分配系數(shù)不同而得到分離同而得到分離 要考慮所選用有

51、機溶劑的特性（極性、沸點、紫外截要考慮所選用有機溶劑的特性（極性、沸點、紫外截止波長）、有機相和水相的體積及水相的止波長）、有機相和水相的體積及水相的pH等等 生物樣品的預(yù)處理生物樣品的預(yù)處理 液液- -固萃取法固萃取法 固相萃取技術(shù)是基于同液相色譜同樣技術(shù)開發(fā)的產(chǎn)品，固相萃取技術(shù)是基于同液相色譜同樣技術(shù)開發(fā)的產(chǎn)品，分離復(fù)雜樣品中的不同組份分離復(fù)雜樣品中的不同組份 SPE的種類的種類生物樣品的預(yù)處理生物樣品的預(yù)處理 固相萃取步驟固相萃取步驟活化活化被分析物被分析物上樣上樣沖洗沖洗洗脫洗脫雜質(zhì)雜質(zhì) 根據(jù)根據(jù)SPE及樣品的性質(zhì)，選洗脫強度不同的溶劑把樣品分及樣品的性質(zhì)，選洗脫強度不同的溶劑把樣品分

52、開，讓樣品的各組份在固定相上吸附、解吸附開，讓樣品的各組份在固定相上吸附、解吸附 生物樣品的預(yù)處理生物樣品的預(yù)處理 由于綴合物較原型藥物具有較大的極性，不易被有機由于綴合物較原型藥物具有較大的極性，不易被有機溶劑提取溶劑提取 為了測定為了測定尿液尿液中藥物總量，無論是直接測定或萃取分離中藥物總量，無論是直接測定或萃取分離之前，都需要將綴合物中的藥物釋出之前，都需要將綴合物中的藥物釋出 有些藥物僅需較溫和條件即可使藥物游離，有些則需有些藥物僅需較溫和條件即可使藥物游離，有些則需較劇烈的方法，常用較劇烈的方法，常用酸水解酸水解或或酶水解酶水解的方法的方法體內(nèi)藥物分析體內(nèi)藥物分析 體內(nèi)藥物分析方法應(yīng)

53、用示例體內(nèi)藥物分析方法應(yīng)用示例應(yīng)用示例應(yīng)用示例苯妥英鈉苯妥英鈉C15H11N2NaO2 274.25 常用抗癲癇藥物常用抗癲癇藥物 有效血藥濃度范圍有效血藥濃度范圍( (1020 ug/ ml) )應(yīng)用示例應(yīng)用示例 具有環(huán)狀酰脲的結(jié)構(gòu)，可因互變異構(gòu)成亞胺醇式，具有環(huán)狀酰脲的結(jié)構(gòu)，可因互變異構(gòu)成亞胺醇式，而顯酸性，而顯酸性，pKa約為約為8.3 本品在水中易溶，在乙醇中溶解，在三氯甲烷或乙本品在水中易溶，在乙醇中溶解，在三氯甲烷或乙醚中幾乎不溶醚中幾乎不溶應(yīng)用示例應(yīng)用示例（1）光譜條件）光譜條件 紫外波長：紫外波長：250 nm 樣品處理樣品處理 血清加血清加pH 6.8 磷酸鹽緩沖液磷酸鹽緩沖液0.5 mL , ,旋渦混合后加二旋渦混合后加二氯甲烷氯甲烷0.5 mL