Transwell侵襲實驗全面總結(jié)

1、Tran swell侵襲實驗全面總結(jié)第一節(jié)概念這里想明確兩個概念，一個是Tran swell，另一個是腫瘤細胞侵襲模型。1. Tran swelltrans-這個詞根有轉(zhuǎn)移、轉(zhuǎn)運、穿過等意思，well有小室的意思，可以從字面上理解，這是一類有通透性的杯狀的裝置，根據(jù)Corni ng公司的Tran swell說明書中的介紹，可以認為這是一種膜濾器（Membrane filters ），也可認為是一種有通透性的支架（ permeable supports）。更準確地說，Tran swell應該是一種實驗技術(shù)，這項技術(shù)的主要材料是 Tran swell小室（T ran swell chamber,

2、Tran swell i nsert），其外形為一個可放置在孔板里的小杯子，不同廠家對Tran swell會有不同的命名，而不同型號也可有不同形狀，不同大小，根據(jù)實驗需要，可有不同選擇。但無論是何種外形， 其關(guān)鍵部分都是一致的， 那就是杯子底層的一張有通透性的膜， 而杯子卩叫根據(jù)不同需要其余部分的材料與普通的孔板是一樣。這層膜帶有微孔，孔徑大小有-內(nèi)慣J yr * - i-enbi ' ,e可用不同材料，一般常用的是聚碳酸酯膜(polycarb on ate membra ne )。下圖是一個 Trans well裝置的縱切面將Tran swell小室放入培養(yǎng)板中， 小室內(nèi)稱上室，培養(yǎng)

3、板內(nèi)稱下室， 上室內(nèi)盛裝上層培養(yǎng)液， 下室內(nèi)盛裝下層培養(yǎng)液，上下層培養(yǎng)液以聚碳酸酯膜相隔。我們將細胞種在上室內(nèi)， 由于聚屮1卜碳酸酯膜有通透性，下層培養(yǎng)液中的成分可以影響到上室內(nèi)的細胞，從而可以研究下層培養(yǎng)液中的成分對細胞生長、運動等的影響。應用不同孔徑和經(jīng)過不同處理的聚碳酸酯膜，就可以進行共培養(yǎng)、 細胞趨化、細胞遷移、細胞侵襲等多種方面的研究。當然不同細胞其體積不同，具體選擇時要考慮到細胞大小。這里主要談幾種大家常用的實驗：(1) 共培養(yǎng)體系：小于孔徑條件下，細胞不會遷徙通過，因此，若研究不涉及細胞運動能力，不需要細胞穿過聚碳酸酯膜，則應選擇 ym以下孔徑。常用、ym。我們實驗室用的是 ym

4、。將細胞A種于上室，細胞B種于下室，可以研究細胞 B分泌或代謝產(chǎn)生的物質(zhì)對細胞A的影響。(2) 趨化性實驗可用、ym膜，上室細胞可穿過聚碳酸酯膜進入下室，計數(shù)進入下室的細胞量可反映下室成分對上室細胞的趨化能力。 細胞B對細胞A的趨化作用：將細胞 A種于上室，細胞 B種于下室，可以研究細胞 B分 泌或代謝產(chǎn)生的物質(zhì)對細胞 A的趨化作用。 趨化因子對細胞的趨化作用：將細胞種于上室，下室加入某種趨化因子， 可研究該趨化因子對細胞的趨化作用。(3) 腫瘤細胞遷移實驗常用、 叩 膜，上室種腫瘤細胞，下室加入FBS或某些特定的趨化因子，腫瘤細胞會向營養(yǎng)成分高的下室跑，計數(shù)進入下室的細胞量可反映腫瘤細胞的遷

5、移能力。(4) 腫瘤細胞侵襲實驗常用、ym膜，原理與腫瘤細胞遷移實驗類似。transwell侵襲實驗，其實原理簡單地說就是用一層膜將高營養(yǎng)的培養(yǎng)液和低營養(yǎng)的培養(yǎng)液隔開，細胞放在低營養(yǎng)的培養(yǎng)液里，為了找吃的，細胞會往高營養(yǎng)的培養(yǎng)液里面跑，但是有膜擋著，所以要穿過膜才行。我們在膜上涂上一層基質(zhì)膠，模仿細胞外基質(zhì)，于是細胞要把基質(zhì)消化了才可以從低營養(yǎng)的培養(yǎng)液跑到高營養(yǎng)的培養(yǎng)液里面，最后我們檢測高營養(yǎng)的培養(yǎng)液里細胞量就可以知道細胞的侵襲能力了，大概原理就是這樣的2. 腫瘤細胞侵襲模型用于研究腫瘤細胞侵襲能力的腫瘤細胞侵襲模型有如下幾種（引自司徒鎮(zhèn)強 細胞培養(yǎng)）：2. 1體內(nèi)癌細胞侵襲模型2. 1.1皮

6、下移植侵襲模型2. 1 . 2肌肉內(nèi)移植侵襲模型2. 1 . 3腹腔內(nèi)移植侵襲模型2. 1 . 4小鼠腎包膜下移植侵襲模型2.1 . 5鼠睪丸包膜下移植侵襲模型2 . 1. 6小鼠耳廓皮下移植侵襲模型2.1 . 7鼠爪墊皮下移植侵襲模型2 . 1. 8視網(wǎng)內(nèi)界膜侵襲模型2 . 2體外癌細胞侵襲模型2.2 . 1體外靜止器官培養(yǎng)法2.2 . 1 . 1半固體培養(yǎng)基單細胞器官培養(yǎng)法2 . 2 . 1 . 2液體培養(yǎng)基單細胞器官培養(yǎng)法2.2 . 2半體外半體內(nèi)器官培養(yǎng)法2.2 . 3單層細胞器官培養(yǎng)法2.2 . 4瘤細胞球體器官培養(yǎng)法2 . 2 . 4 . 1靜止球體器官培養(yǎng)法2.2 . 4 . 2

7、旋轉(zhuǎn)搖動球體器官培養(yǎng)法2. 2 . 5單層細胞侵襲實驗模型 2. 2. 6 Tran swell侵襲小室測定法可見，Tran swell與侵襲實驗之間并不能劃等號，Tran swell有多種應用，侵襲實驗也有多種方法。所謂Tran swell侵襲實驗，其實是指將Tran swell這一技術(shù)應用于腫瘤細胞侵襲研究的 一種實驗。由于其簡單易行、重復性好，因而得到了越來越廣泛的應用，但不能認為研究腫瘤侵襲只有Tran swell 一種方法。第二節(jié)Tran swell侵襲實驗1實驗用品: Tran swell 小室:多種廠家可提供，論壇里常用的是Costar、Corning、BD生產(chǎn)的小室，我們實驗室

8、用的是Chemicon公司的ECM550系列，另有 Boyden chamber、Millipore公司的 millicell和雕弓滿月射天狼戰(zhàn)友介紹的 Thincert。這些廠家提供的小室，有的已鋪好基質(zhì)膠，買來就可以用，很方便，但也比較貴，我們實驗室用的Chemicon公司的ECM550系列是已經(jīng)鋪好膠的，質(zhì)量很好，但是非常貴，24孔板配套的小室，每個價格約 130元，不推薦給大家。BD也有已包被好的，價格不清楚。 Coster 和Corning公司生產(chǎn)的小室，是論壇里比較常用的，好像是要自己鋪膠，但據(jù)說每個小室成 本只有40左右，應該比較適合中國國情。面是一些戰(zhàn)友提供的價格， 具體建議大

9、家聯(lián)系代理商咨詢。 linanping1979 戰(zhàn)友提供的價格：coster的24孔板的transwell的價格是456元RMB, 8（im,用于腫瘤的侵襲實驗。iceyxy戰(zhàn)友提供的價格：Millipore的8m的50個1760RMB, m的2000多，是一次性的。梅林戰(zhàn)友提供的BD價格：240RMB 一塊（，24孔，12instert ），好像是沒膠的。liguofan說國產(chǎn) 的 boyden30 塊一個。 jjyy 提供的價格是： corning cat . transwell with prore polycarbona te membrane insert， Qty 48,950 人

10、民幣不到。平均每個 20 元不到。Transwell 小室按照公司的要求，都是一次性使用的。不過其實洗洗泡泡還是可以重復用的。我用的Chemicon公司的ECM554,用完后擦去基質(zhì)膠，再用胰酶和75%酒精泡，可以把膜洗得很干凈，用前用紫外里外都照 30min。 sword01 戰(zhàn)友提供的處理方法：用棉簽輕輕擦去 膠和反面細胞，清水沖洗，超聲清洗，低擋，30min，清水3X 5min蒸餾水3X 5min室溫涼干，用前紫外線小室正面3h，反面6h,微波，低火10minX2。因為我買的是鋪好膠的，所以沒買 Matrigel ，二次利用的小室只用來做不需要鋪膠的遷移實驗。以前的Chemicon EC

11、M550系列，膜很結(jié)實，擦不壞，可以反復用很多次，但現(xiàn)在的膜 已經(jīng)改用一種很薄很脆的材料，一般只能重復用一次，真黑啊！很多戰(zhàn)友說Costar 和 Corning 也是可以重復用的，大家可以試試。另外，根據(jù)論壇戰(zhàn)友提供的信息， osmonic 公司有專用的膜出售，鼎國生物代理。 Transwell 小室用過后，可把原來的膜切下， 貼上osmonic公司的膜，這樣又可以用了，不過我沒用過， 有興趣的可以試試。 maojianwen 戰(zhàn)友的使用方法： trasnwell 小室做一次后，將原來的膜去 掉，重新泡酸，泡酒精，使用前照紫外，然后用女士用指甲油（注意用無色較稀的）將osmonic 公司的膜貼

12、上，剪掉多余的邊緣。再照紫外。 上層培養(yǎng)液：上層培養(yǎng)液采用無血清培養(yǎng)基，為維持滲透壓，需加入% BSA。 細胞： 值得注意的是，有侵襲能力的細胞才可用于 Transwell 侵襲實驗。建議實驗前先用酶譜法檢測 MMPs 的表達，特別是 MMP-2 的表達。如果不清楚細胞 MMPs 的表達情況，就盲目進行 Transwell 侵襲實驗，可能會造成不必要的浪費，一次 Transwell 侵襲實驗花錢少則數(shù)百，多 則數(shù)千，并不是筆小數(shù)目，還是小心為妙。另外，為了讓實驗結(jié)果更明顯，可先撤血清讓細 胞饑餓12 -24h，再進行實驗。 基質(zhì)膠：常用的是人工重構(gòu)基底膜材料Matrigel，主要成分為層黏連蛋

13、白和W型膠原，生產(chǎn)廠家有BD、美國Collaborative Rsearch公司等。CaoY戰(zhàn)友的帖這么說的： Matrigel是BD公司生產(chǎn)的， 是一種細胞外基質(zhì)， 4度時是液體，在 37 度會逐漸凝固成膠狀，不可逆。同樣的東西在 sig ma叫ECM。zhangyong1036戰(zhàn)友提供的價格：BD公司的 matrigel 1500左右。如果購買的小室是已經(jīng)鋪好基質(zhì)膠的，那么 Matrigel 就不需要購買了。 下層培養(yǎng)液：下層常用含5% 10% FBS的培養(yǎng)基，具體濃度根據(jù)細胞侵襲力而定，侵襲力弱的細胞可適 當提高FBS濃度。下層也可用趨化因子， 有戰(zhàn)友將纖維粘連蛋白加入下層培養(yǎng)液作為趨化

14、因 子，但個人認為，F(xiàn)BS仍是最合適的。 細胞培養(yǎng)板：常用于 Transwell 侵襲實驗的細胞培養(yǎng)板有 6孔板、 12孔板、 24孔板等，以 24 孔最常用。 細胞培養(yǎng)板沒什么特殊要求， 普通的細胞培養(yǎng)板就可以。 但要注意， 細胞培養(yǎng)板應當與購買 的 Transwell 小室相配套。 此外，膜的下室面可涂上纖維粘連蛋白（ fibronectin ， FN， Sigma 有售），這樣做的目的 是使穿過膜的細胞更好地附著在膜上，也可用膠原（ collagen）或明膠（gelatin ）。很多戰(zhàn)友認為這不是必須的， 而且我也是不涂的， 細胞照樣貼壁很好。 如果貼壁不好的話可以試試看。linanpi

15、ng1979戰(zhàn)友認為，如果培養(yǎng)時間很長（>24h）,細胞還是會掉到下室里面去，所以有條件的話，最好還是在膜下層涂上FN。另外，值得一提的是，膜下層涂上 FN還有一定的趨化作用。zhangyong1036戰(zhàn)友提供的價格：sigma的fibronectin，價格在1500左右。2步驟21 Transwell 小室制備21 1 無基質(zhì)膠 Transwell 小室制備 包被基底膜：用50mg/LMatrigel 1: 8稀釋液包被Tran swell小室底部膜的上室面，4 C風干。如果需要在下室面鋪FN的話，可將200ul槍頭的尖端剪掉，吸取FN均勻涂抹在小室的下面。用膠原（collagen）的

16、話，一般配成 ml，直接用槍吸了涂在膜上。 水化基底膜：吸出培養(yǎng)板中殘余液體，每孔加入50ul含10g/LBSA的無血清培養(yǎng)液，37 C, 30min。另有 tianjin_glioma 戰(zhàn)友提供的方法：在上室的聚碳酸酯膜上加入稀釋后的 Matrigel （ ul）60-80卩l(xiāng) （注意體積不可太大，以剛把聚碳酸酯膜浸濕為最好），置37 C 30min使Matrige l 聚合成凝膠。21 2 有基質(zhì)膠的 Transwell 小室制備Chemicon公司的ECM550系列說明書要求，將小室放入培養(yǎng)板中， 在上室加入300 預溫的無血清培養(yǎng)基，室溫下靜置1530min ，使基質(zhì)膠再水化。再吸去剩

17、余培養(yǎng)液。22 制備細胞懸液 制備細胞懸液前可先讓細胞撤血清饑餓12-24h，進一步去除血清的影響。但這一步并不是必須的。 消化細胞，終止消化后離心棄去培養(yǎng)液，用PBS洗1-2遍，用含BSA的無血清培養(yǎng)基重懸。調(diào)整細胞密度至 1 - 10X 10,個人認為不要超過 5X 10。具體實驗時采用密度要自己摸索，因為不同細胞， 其侵襲能力是不同的。個人經(jīng)驗，細胞量 過多,穿過膜的細胞會過多過快, 如果最后用計數(shù)法統(tǒng)計結(jié)果的話將難以計數(shù)； 而過少的話, 可能還沒到檢測的時間點, 所有的細胞都已穿過, 因此最少也要保證在收樣的時候, 上室內(nèi) 還要有一定量的細胞存在。個人認為, 對照組和處理盡量不要分開計

18、數(shù), 因為細胞數(shù)目的差異會嚴重影響實驗結(jié)果。 如 果需要對細胞預處理而不得不分開計數(shù), 那么計數(shù)一定要多重復幾次, 力求準確, 盡量保證 對照組和處理組細胞密度一致。23 接種細胞 取細胞懸液100 200卩加入Tran swell小室，不同公司的、不同大小的Tran swell小室對細胞懸液量有不同要求，請參考說明書。24孔板小室一般200卩。 24孔板下室一般加入 500 含F(xiàn)BS或趨化因子的培養(yǎng)基，不同的培養(yǎng)板加的量有不同要求，具體請參考說明書。 這里要特別注意的是，下層培養(yǎng)液和小室間常會有氣泡產(chǎn)生，一旦產(chǎn)生氣泡， 下層培養(yǎng)液的趨化作用就減弱甚至消失了， 在種板的時候要特別留心， 一旦出

19、現(xiàn) 氣泡，要將小室提起，去除氣泡，再將小室放進培養(yǎng)板。 培養(yǎng)細胞：常規(guī)培養(yǎng) 12 48h （主要依癌細胞侵襲能力而定）。時間點的選擇除了要考 慮到細胞細胞侵襲力外，處理因素對細胞數(shù)目的影響也不可忽視。以我的課題為例， 我使用的藥物不僅會抑制腫瘤細胞侵襲力， 還對細胞增殖有明顯抑制。 我 選擇的藥物濃度是用 MTT篩選出的72h的IC50。用這個濃度處理細胞，24h內(nèi)對細胞增殖并無明顯抑制，但 24h 后，抑制作用就開始出現(xiàn)了。所以，用這個濃度來做Transwell ，處理時間也必須限定在 24h 內(nèi)，否則一旦藥物抑制了細胞增殖或者誘導出凋亡，使處理組細胞數(shù)目少于對照組，那么就難以肯定穿過膜的細

20、胞比對照組少，究竟是由于侵襲被抑制引起， 還是處理后細胞數(shù)目本身就比對照組少而引起的了。時間過長不可以，同樣，過短也不行，因為細胞內(nèi)會有一定量的MMPs 儲存，短時間內(nèi)可能侵襲能力不會有太大改變。同時從藥物被吸收進去，進而發(fā)揮作用，影響MMPs 表達，到最后釋放到培養(yǎng)基中， 還需要一個過程。 時間點的選擇可盡量長點， 也可選擇多個時間點 研究時間依賴效應，但前提是這個時間范圍內(nèi)細胞數(shù)目不能有明顯變化。另外， 我看到細胞在小室內(nèi)的形態(tài)不是正常培養(yǎng)貼壁的形態(tài)， 而是圓形的， 仍是懸浮時的形 態(tài)，不過會聚集成團，所以看到細胞不正常貼壁也不要緊張，是正?，F(xiàn)象。在培養(yǎng)過程中，膜下會逐漸有少量小氣泡產(chǎn)生，

21、這是正常現(xiàn)象，可不予處理，但我遇到過培養(yǎng)一段時間后, 膜下出現(xiàn)了大氣泡，幸虧及時發(fā)現(xiàn)，否則后果將非常嚴重。因此，個人建議，最好接種細胞后1- 2h把培養(yǎng)板從培養(yǎng)箱里拿出來看看，確信沒有大氣泡產(chǎn)生。2. 4結(jié)果統(tǒng)計檢測穿過的細胞數(shù)有兩種方法：2. 4. 1直接計數(shù)法2. 4. 1. 1貼壁”細胞計數(shù)這里所謂的貼壁”是指細胞穿過膜后，可以附著在膜的下室側(cè)而不會掉到下室里面去。如下圖：通過給細胞染色，可在鏡下計數(shù)細胞： 用棉簽擦去基質(zhì)膠和上室內(nèi)的細胞。 染色：常用的染色方法有結(jié)晶紫染色、臺肦藍染色、Giemsa染色、蘇木精染色、伊紅染色等。個人推薦采用結(jié)晶紫染色，這種方法有如下優(yōu)勢：（1）不需要固定

22、細胞，直接染色即可。（2）配制簡單方便。（3）染色后可以用33%醋酸脫色，將結(jié)晶紫完全洗脫下來，洗脫液可在酶標儀上570nm測其0D值，間接反映細胞數(shù)。個人認為這是結(jié)晶紫染色最大的優(yōu)勢 所在。因為，雖然經(jīng)過準確的細胞計數(shù)，往往穿過膜的細胞數(shù)仍難以準確控制，可能某一批實驗穿過的細胞會特別多，以致細胞成堆，這種情況下就難以計數(shù)了，這種情況下就可以用醋酸脫色后用酶標儀檢測。使用結(jié)晶紫染色要注意，染色前要將膜風干，否則可能會染不上。 細胞計數(shù)：我們使用的是 Leica DC 300F正置顯微鏡進行觀察和拍照，把Tran swell小室反過來底朝上就可清楚看到小室底膜上下室側(cè)附著的細胞。也有不少人用手術(shù)

23、刀將膜切下后染色，再貼在玻片上，滴二甲苯，再蓋上蓋玻片，就可以長期保存，但是這樣做小室就成了 一次性的了，未免有點浪費。取若干個視野計數(shù)細胞個數(shù)。論壇里一般采用3- 5個視野，也有人用10個，都是隨機選取，個人認為這樣選擇的視野帶有很大的偶然性，也會摻進人為影響，特別是計數(shù)視野較少的時候。我選取16個視野，不是隨機選擇，而是有固定的位置。我們使用的顯微鏡所看到的視 野的直徑剛好是 Chemicon公司的ECM550系列小室底面膜的直徑的1/4。如圖，藍色部分表示膜的大小，白色圓形表示視野的大小，綠色方形則表示拍照時所能拍下的視野的中心部分。這樣，每個小室都拍攝如下圖的16個視野進行計數(shù)，這樣得

24、到結(jié)果是比較客觀和準確的。用的MTT實驗是同樣的原理。2. 4. 2. 1 MTT 法 用棉簽擦去基質(zhì)膠和上室內(nèi)的細胞 24孔板中加入500卩1含ml MTT的完全培養(yǎng)基，將小室置于其中，使膜浸沒在培養(yǎng)基中， 37 C 4h后取出。 24孔板中加入500卩I DMSO,將小室置于其中，使膜浸沒在DMSO中，振蕩10min，使甲臜充分溶解。取出小室，24孔板于酶標儀上測 OD值。2. 4. 2. 2熒光試劑檢測這類方法一般是與 Tran swell小室一起出售的，其原理與MTT法類似，是用一種熒光染料染細胞，再將細胞裂解，檢測熒光值。Chemicon的ECM554即屬于這類。2. 4. 2 .

25、3結(jié)晶紫檢測上文已說過，這里不再贅述，原理與MTT法也是類似的。但結(jié)晶紫染色還有個優(yōu)點，就是染色和脫色的過程并不影響膜上細胞，在脫色后還可重新染色。2. 4. 2. 4非貼壁”細胞計數(shù)由于某些細胞自身的原因或某些膜的關(guān)系，有時細胞在穿過膜后不能附著在膜上，而是掉進F室。如下圖:第三節(jié) Transwell 的其他應用的實驗步驟1 Transwell 腫瘤細胞遷移實驗過程與 Transwell 侵襲實驗基本一致，不同的只是不需要鋪 Matrigel 。個人認為，由于沒有 基質(zhì)膠的阻擋， 細胞穿過膜的速度較侵襲實驗明顯加快， 所以細胞量要更大。 我做侵襲實驗的細胞密度是1X 10,而遷移實驗的密度是

26、 1X 10。另外，下層培養(yǎng)液的 FBS濃度也可適當 下調(diào)，我做侵襲實驗的濃度是 5%，遷移實驗的濃度是 %。2cathywxy 戰(zhàn)友的 Transwell 上皮細胞培養(yǎng)步驟做了一段時間的原代細胞培養(yǎng),把經(jīng)驗拿出來跟大家分享一下吧,請大家共同探討：2-95% 空氣含 5% 胎牛血清 ( Gibco-BRL) and 100 U/ml 青霉素 and 100ug/ml 鏈霉素的 LHC-8 medium 孵育 6 10 天。（5） 孵育后，經(jīng)測定跨上皮電阻在10002000Q之間，即可用于電生理試驗。顯微鏡下氣管上皮細胞形細胞呈鋪路石狀， 圓形核位于中央， 生長時常彼此緊密連接成單層 細胞3. metastasis 戰(zhàn)友的 Transwell B16 細胞的體外遷移實驗我以前用 costar 的 Transwell 做過 B16 細胞的體外遷移實驗，具體是這么做的：首先把 Tra nswell 倒置，在 Tran swell 的 PVPF 膜（um）的下表面涂一層 fibro necti n（ 10 ug/ml，50ul）， 37度2小時，PBS洗一遍后，放入預先每孔加有600ul的培養(yǎng)基（含10%血清）的24孔板內(nèi)，后在Tran swell的內(nèi)室加入細胞（100ul，用含血清