蛋白質(zhì)含量測(cè)定法

1、 實(shí)驗(yàn)一 蛋白質(zhì)含量測(cè)定法實(shí)驗(yàn)?zāi)康? 掌握考馬斯亮藍(lán)法（Bradford法）測(cè)定蛋白質(zhì)含量的方法2 掌握紫外吸收法測(cè)定蛋白質(zhì)含量的方法一考馬斯亮藍(lán)法（Bradford法）實(shí)驗(yàn)原理器材與試劑（一） 器材1 722型和753型可見(jiàn)光分光光度計(jì)2 漩渦混合器3 試管16支（二） 試劑1 標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)溶液，用牛血清清蛋白（BSA），配制成1.03mg/ml和0.103mg/ml。2 考馬斯亮藍(lán)G-250染料試劑：稱(chēng)100mg考馬斯亮藍(lán)，溶于50ml 95%的乙醇后，再加入120ml 85% 的磷酸，用水稀釋至1升。實(shí)驗(yàn)方法1 標(biāo)準(zhǔn)方法（1） 取10支試管，分別編號(hào)后按 表1-1 劑量依次加入標(biāo)準(zhǔn)蛋白（或

2、未知蛋白）、去離子水和考馬斯亮藍(lán)染料。每支試管加完后，立即在漩渦混合器上混合。（2） 加完染料20min后，使用722分光光度計(jì)（靈敏度4），塑料比色皿，在595nm處測(cè)量吸光度A595。（3） 用標(biāo)準(zhǔn)蛋白濃度（mg/ml）為橫坐標(biāo)，用A595為縱坐標(biāo)，進(jìn)行直線(xiàn)擬合，得到標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)。根據(jù)測(cè)得的未知樣品的A595，查表即可求得未知樣品的蛋白質(zhì)含量。2 微量法取10支試管，分別編號(hào)后按 表1-3 劑量依次加入稀釋的標(biāo)準(zhǔn)蛋白（或未知蛋白）、去離子水和考馬斯亮藍(lán)染料。其他步驟同上，不過(guò)使用753分光光度計(jì)（狹縫4）。3 SDS干擾實(shí)驗(yàn)（1） 取5支試管，分別編號(hào)后按表1-5劑量依次加入標(biāo)準(zhǔn)蛋白、SDS、

3、去離子水和考馬斯亮藍(lán)染料。每支試管加完后，立即在漩渦混合器上混合。（2） 加完染料20min后，使用753分光光度計(jì)（狹縫4），塑料比色皿，在595nm處測(cè)量吸光度A595。1 9實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)與結(jié)果分析（一） 標(biāo)準(zhǔn)方法的數(shù)據(jù)和圖表1 考馬斯亮藍(lán)標(biāo)準(zhǔn)法實(shí)驗(yàn)表格管號(hào)12345678910標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)（1.03mg/ml）00.010.020.040.060.080.10未知蛋白質(zhì)（約0.5mg/ml）0.040.080.10蒸餾水0.10.090.080.060.040.0200.060.020考馬斯亮藍(lán)G-250試劑3.03.03.03.03.03.03.03.03.03.0對(duì)應(yīng)的吸光度A5950.2

4、000.3110.3620.4830.6240.7520.8450.3870.5010.572根據(jù)表1，以A595為縱坐標(biāo)，標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)量/（g）為橫坐標(biāo)，作圖1。圖1 考馬斯亮藍(lán)標(biāo)準(zhǔn)法根據(jù)線(xiàn)性擬合公式y(tǒng)=6.1884x+0.2287計(jì)算所測(cè)溶液的蛋白質(zhì)的含量分別是8號(hào)管0.637mg/ml，9號(hào)管0.5547 mg/ml，10號(hào)管0.550 mg/ml。因?yàn)?號(hào)管測(cè)出結(jié)果誤差太大，取9和10管的平均值，所以，未知溶液的蛋白質(zhì)含量為0.5524 mg/ml。（二） 微量法的數(shù)據(jù)和圖表2 考馬斯亮藍(lán)微量法實(shí)驗(yàn)表格管號(hào)12345678910標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)（0.103mg/ml）00.10.20.40.6

5、0.81.0未知蛋白質(zhì)（約0.5mg/ml）0.40.81.0蒸餾水1.00.90.80.60.40.200.60.20考馬斯亮藍(lán)G-250試劑3.03.03.03.03.03.03.03.03.03.0對(duì)應(yīng)的吸光度A59500.0880.1840.2920.4110.5420.6310.1710.2890.362根據(jù)表2，以A595為縱坐標(biāo)，標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)量/（g）為橫坐標(biāo)，作圖2。圖2 考馬斯亮藍(lán)微量法根據(jù)線(xiàn)性擬合公式y(tǒng)=6.0579x+0.0305計(jì)算稀釋10倍后的未知溶液的蛋白質(zhì)含量分別是8號(hào)管0.05798 mg/ml，9號(hào)管0.05334 mg/ml，10號(hào)管0.05472 mg/ml

6、。取平均值再乘10倍，得未知溶液的蛋白質(zhì)含量為0.5534 mg/ml。（三） SDS干擾數(shù)據(jù)和圖表3 考馬斯亮藍(lán)SDS干擾實(shí)驗(yàn)表格管號(hào)123456標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)（1.03mg/ml）0.10.10.10.10.10.1SDS (1mg/ml)00.10.20.40.60.8蒸餾水0.90.80.70.50.30.1考馬斯亮藍(lán)G-250試劑3.03.03.03.03.03.0對(duì)應(yīng)的吸光度A5950.4230.3360.2750.2000.2130.198根據(jù)表3，以A595為縱坐標(biāo)，SDS濃度為橫坐標(biāo)，作圖3。圖3 考馬斯亮藍(lán)SDS干擾實(shí)驗(yàn)由上圖可以看出，十二烷基硫酸鈉(SDS)對(duì)考馬斯亮藍(lán)法測(cè)蛋

7、白質(zhì)含量有干擾，同是0.103mg/ml的標(biāo)準(zhǔn)蛋白與3.0ml考馬斯亮藍(lán)，但隨著SDS濃度的增加，其混合液的595nm處的吸收峰逐漸降低，而后有一小段回升，最后趨于漸近線(xiàn)。二紫外吸收法實(shí)驗(yàn)原理280nm的光吸收法：蛋白質(zhì)分子中，酪氨酸、苯丙氨酸和色氨酸在280nm處有最大吸收。215nm與225nm的吸收差法：蛋白質(zhì)因?yàn)楹康投荒苁褂?80nm的光吸收測(cè)定時(shí)，可用215nm與225nm吸收值之差，通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)法來(lái)測(cè)定蛋白質(zhì)稀溶液的濃度。肽鍵測(cè)定法：蛋白質(zhì)溶液在238處的光吸收強(qiáng)弱，與肽鍵的多少成正比?？梢詼y(cè)238nm處吸收值，通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)法來(lái)測(cè)定蛋白質(zhì)稀溶液的濃度。器材與試劑（一） 器材1S

8、PECORD200分光光度計(jì)2漩渦混合器3試管12支（二） 試劑1 標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)溶液，用牛血清清蛋白（BSA），配制成1.03mg/ml。 實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)與結(jié)果分析（一）紫外280nm吸收法數(shù)據(jù)和圖表4 紫外280nm光吸收法管號(hào)123456BSA (1.03mg/ml)體積01.02.03.04.05.0H2O5.04.03.02.01.00BSA濃度（mg/ml）00.2060.4120.6180.8241.03A28000.1580.2700.3790.5140.645根據(jù)表4，以A280為縱坐標(biāo)，SBA濃度為橫坐標(biāo)，作圖4。圖4 紫外280nm光吸收法根據(jù)直線(xiàn)擬和方程y=0.6105x+0.0

9、132求解當(dāng)標(biāo)準(zhǔn)蛋白（牛血清清蛋白）與文獻(xiàn)值6.3比較接近。（二） 紫外215nm與225nm的吸收差法的數(shù)據(jù)和圖表5 紫外215nm與225nm的吸收差法管號(hào)123456未知BSA (1.03mg/ml)體積00.10.20.30.40.5H2O5.04.94.84.74.64.5BSA濃度(g/ml)020.641.261.882.4103A21500.2870.4590.7941.0901.4010.574A22500.1650.2640.4390.6210.8030.286吸收差00.1220.1950.3550.4690.5980.288根據(jù)表5，以吸收差為縱坐標(biāo)，蛋白質(zhì)濃度為橫坐標(biāo)

10、，作圖5。圖5 215nm與225nm吸收差法把未知蛋白質(zhì)溶液稀釋10倍后測(cè)得的吸收差0.288帶入上圖直線(xiàn)擬和方程y=0.0058x-0.0095得稀釋10倍后的蛋白質(zhì)濃度為51.83g/ml，則原未知濃度溶液的蛋白質(zhì)含量為0.518mg/ml。（三） 肽鍵測(cè)定法數(shù)據(jù)和圖表6 肽鍵吸收法管號(hào)123456未知BSA (1.03mg/ml)體積00.51.01.52.02.5H2O5.04.54.03.53.02.5BSA濃度 (g/ml)0103206309412515A28000.1900.3010.5410.7350.9210.441根據(jù)表6，以A238為縱坐標(biāo)，蛋白質(zhì)濃度為橫坐標(biāo)，作圖4

11、。圖6 肽鍵測(cè)定法把未知蛋白質(zhì)溶液稀釋1倍后測(cè)得238nm的吸收值為0.441，帶入上圖直線(xiàn)擬和方程y=0.0018x-0.0125得稀釋1倍后的蛋白質(zhì)濃度為251.94g/ml，則原未知濃度溶液的蛋白質(zhì)含量為0.503mg/ml。結(jié)論：1 考馬斯亮藍(lán)標(biāo)準(zhǔn)法測(cè)得未知溶液中蛋白質(zhì)含量為0.5524mg/ml, 用微量法測(cè)得未知溶液中蛋白質(zhì)含量為0.5534mg/ml，最終結(jié)果相差不大，但是標(biāo)準(zhǔn)法所測(cè)的三個(gè)數(shù)據(jù)明顯比微量法測(cè)得數(shù)據(jù)標(biāo)準(zhǔn)偏差大，這說(shuō)明微量法比標(biāo)準(zhǔn)法實(shí)驗(yàn)穩(wěn)定性高，準(zhǔn)確性高。2 干擾考馬斯亮藍(lán)方法的物質(zhì)中，我們主要對(duì)SDS的干擾情況作了分析：總體上，當(dāng)溶液中存在一定量的SDS后所測(cè)得的吸

12、光度比正常值相對(duì)減小。但是隨著SDS濃度的增加，吸光度的減小量沒(méi)有呈現(xiàn)出很明顯的規(guī)律。從SDS與蛋白質(zhì)的作用機(jī)理來(lái)看，SDS可以斷開(kāi)分子內(nèi)和分子間的氫鍵，破壞蛋白質(zhì)的二級(jí)和三級(jí)結(jié)構(gòu)。SDS和蛋白質(zhì)結(jié)合后使蛋白質(zhì)-SDS復(fù)合物上帶有大量的負(fù)電荷，平均每?jī)蓚€(gè)氨基酸結(jié)合一個(gè)SDS分子，這時(shí)各種蛋白質(zhì)分子本身的電荷完全被SDS掩蓋。由于SDS 的存在，阻礙了染料與堿性氨基酸和芳香族氨基酸的結(jié)合，使得吸光度減小。由于SDS與染料分子對(duì)蛋白質(zhì)的競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合，使得顯色減弱，吸光度值降低，因此在曲線(xiàn)前段呈下降趨勢(shì)；但由于SDS破壞氫鍵，使得蛋白質(zhì)的空間結(jié)構(gòu)更加伸展，一些原來(lái)包裹在結(jié)構(gòu)中的堿性氨基酸和芳香族氨基酸暴

13、露出來(lái)，所以會(huì)有少量的吸光度回升；但最終SDS與蛋白質(zhì)的結(jié)合達(dá)到所處溶液條件下的“飽和”時(shí)，過(guò)量的SDS就不起作用了，曲線(xiàn)是最后為平緩段。 要去除SDS的干擾，可以利用它與K+結(jié)合生成沉淀的性質(zhì)將其去除。K+對(duì)考馬斯亮藍(lán)方法不產(chǎn)生干擾。3 紫外280nm吸收法中，從文獻(xiàn)中查得牛血清清蛋白的。實(shí)驗(yàn)得出相對(duì)誤差為：4 紫外吸收差法和肽鍵測(cè)定法所測(cè)的未知溶液蛋白含量分別為0.518mg/ml 和0.503mg/ml，與考馬斯亮藍(lán)法的結(jié)果有差距，這與兩個(gè)方法用蛋白質(zhì)分子中不同的物質(zhì)的測(cè)量值近似代替蛋白質(zhì)含量有關(guān)?？捡R斯亮藍(lán)染料主要與蛋白質(zhì)中的堿性氨基酸（特別是精氨酸）和芳香族氨基酸殘基相結(jié)合，測(cè)吸收峰

14、；而紫外吸收法是測(cè)酪氨酸、苯丙氨酸和色氨酸殘基的苯環(huán)含有的共軛雙鍵。 思考與討論1.用考馬斯亮藍(lán)法G-250測(cè)定蛋白質(zhì)含量有何特點(diǎn)，操作過(guò)程中應(yīng)注意什么？答：Bradford 法的優(yōu)點(diǎn)是（1）靈敏度高，其最低蛋白質(zhì)檢測(cè)量可達(dá)1g。這是因?yàn)榈鞍踪|(zhì)與染料結(jié)合后產(chǎn)生的顏色變化很大，蛋白質(zhì)-染料復(fù)合物有更高的消光系數(shù)，因而光吸收值隨蛋白質(zhì)濃度的變化很大。（2）測(cè)定快速、簡(jiǎn)便、只需要加一種試劑。完成一個(gè)樣品的測(cè)定，只需要5min左右，顏色在5min至20min之間穩(wěn)定性也很好。（3）干擾物質(zhì)相對(duì)其它方法少。缺點(diǎn)是（1）由于各種蛋白質(zhì)中的精氨酸和芳香族氨基酸的含量不同，因此Bradford法用于不同蛋白質(zhì)

15、測(cè)定時(shí)有較大的偏差。（2）仍有些物質(zhì)干擾此法測(cè)定：去污劑、Triton X-100、十二烷基硫酸鈉（SDS）和0.1mol/L的NaOH。（3）標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)也有輕微的非線(xiàn)性。 操作注意事項(xiàng)：不可使用石英比色皿，可用塑料或者玻璃比色皿，使用后立即用少量95%的乙醇蕩洗，以洗去染色。塑料比色皿決不可以用乙醇或丙酮長(zhǎng)時(shí)間浸泡。2.考馬斯亮藍(lán)G-250和R-250各有何特點(diǎn)，在電泳染色方面有何異同？（詳見(jiàn)講義參考文獻(xiàn)12.）答：考馬斯亮藍(lán)G-250和R-250的結(jié)構(gòu)式不同，配方不同，染色方法也適合于不同性質(zhì)的蛋白。考馬斯亮藍(lán)R-250即三苯基甲烷（triphenylmethane）。每個(gè)分子含有兩個(gè)-SO

16、3H，偏酸性，與蛋白質(zhì)的堿性集團(tuán)結(jié)合。在一定pH時(shí)，染料蛋白復(fù)合物可以被完全解聚。與不同蛋白結(jié)合呈現(xiàn)基本相同的顏色，并且在比較寬的范圍內(nèi)(15-20g)，掃描峰的面積與蛋白量有線(xiàn)性關(guān)系。通常用先固定，再進(jìn)行染色和脫色的方法?？捡R斯亮藍(lán)G-250即二甲花青亮藍(lán)（Xylene Cyanine Brillian Blue）其染色方法經(jīng)常是對(duì)蛋白質(zhì)同時(shí)進(jìn)行固定和染色。這種方法的特點(diǎn)是快而簡(jiǎn)便，有時(shí)甚至不需脫色。但靈敏度略遜于R-250。同時(shí)考馬斯亮藍(lán)G-250對(duì)小肽染色效果很好。3.試述幾種主要干擾物質(zhì)對(duì)考馬斯亮藍(lán)G-250蛋白測(cè)定法測(cè)定結(jié)果的影響及其作用機(jī)理。答：SDS的存在會(huì)使相同條件下的吸光度值

17、減小，其作用機(jī)理為：斷開(kāi)分子內(nèi)和分子間的氫鍵，破壞蛋白質(zhì)的二級(jí)和三級(jí)結(jié)構(gòu)。SDS和蛋白質(zhì)結(jié)合后使蛋白質(zhì)-SDS復(fù)合物上帶有大量的負(fù)電荷，平均每?jī)蓚€(gè)氨基酸結(jié)合一個(gè)SDS分子，這時(shí)各種蛋白質(zhì)分子本身的電荷完全被SDS掩蓋。由于SDS與染料分子與蛋白質(zhì)的競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合，會(huì)使顯色減弱，所以吸光度值減小。Tris，乙酸，2-巰基乙醇，蔗糖，甘油，EDTA及微量的去污劑如TritonX-100，玻璃去污劑有少量顏色干擾，用適當(dāng)?shù)木彌_液對(duì)照很容易除掉。4.試求紫外吸收法的靈敏度（即濃度每變化0.1mg/ml時(shí)相應(yīng)吸光度值的變化量）。答：未知蛋白濃度c（mg/ml）與吸光度A280的關(guān)系如下：所以，靈敏度為：。同理，肽鍵測(cè)定法的靈敏度為：；吸收差法的靈敏度（）為：。5.解釋百分吸光系數(shù)，說(shuō)明其在生化實(shí)驗(yàn)中的應(yīng)用，并試述為何不同蛋白質(zhì)的百分吸光系數(shù)會(huì)有很大差別？答：蛋白質(zhì)溶液濃度為，光徑為1cm，在波長(zhǎng)下測(cè)得的吸光度值稱(chēng)為這種蛋白質(zhì)的百分吸光系數(shù)（或比吸收系數(shù)）。記為：。在生化實(shí)驗(yàn)中，可以只進(jìn)行相同波長(zhǎng)、相同光徑下樣品蛋白質(zhì)的吸光度測(cè)量