肺結(jié)核的醫(yī)學診斷

1、肺結(jié)核一、疾病概述 肺結(jié)核(pulmonarytuberculosis)是結(jié)核分枝桿菌引起的慢性肺部感染性疾病，占各器官結(jié)核病總數(shù)的8090.是世界上最重要公共健康問題之一。隨著AIDS的流行、人口的流動、器官移植的出現(xiàn)以及免疫抑制劑的廣泛應用，結(jié)核病的疫情呈明顯上升，多重耐藥結(jié)核菌的感染更為常見。據(jù)1990年WHO的調(diào)查，全球現(xiàn)有肺結(jié)核患者2000萬人.每年新發(fā)病例800萬1000萬，結(jié)核病的年死亡人數(shù)高達300萬。我國是世界上結(jié)核病疫情負擔最重的22個國家之一，目前我國正積極推行全程督導短程化學治療(directlyobservedtreat-mentshort-course，D

2、OTS)，使肺結(jié)核患病率明顯下降，治愈率超過94，有效地遏止了肺結(jié)核的傳播。 【病因和發(fā)病機制】 1.結(jié)核桿菌結(jié)核分枝桿菌是結(jié)核病的致病菌，其包括 人型、牛型、非洲型和鼠型，其中人型結(jié)核分枝桿菌是最重要的病原菌。結(jié)核分枝桿菌細長可呈多種形態(tài)，無莢膜和鞭毛，抗酸染色呈紅色，不易被乙醇脫色，故又稱抗酸桿菌。結(jié)核桿菌屬于兼性需氧菌，具有較強的耐受性，在干燥和潮濕的環(huán)境中能存活數(shù)月甚至數(shù)年，但對高熱、乙醇或紫外線具有較好的敏感性。結(jié)核分枝桿菌主要由類脂質(zhì)、蛋白質(zhì)和多糖類組成，其中類脂質(zhì)可引起組織壞死、干酪液化和空洞形成，蛋白可誘發(fā)皮膚變態(tài)反應，多糖類導致免疫應答。

3、0;2.發(fā)病機制 (1)結(jié)核菌陽性，尤其是痰涂片陽性的肺結(jié)核患者是結(jié)核病的主要傳染源。傳染性的大小與痰菌的量呈正相關(guān)。飛沫傳播是結(jié)核病的主要傳播途徑。所有人群對結(jié)核菌均有易感性，而嬰幼兒、老年人、HIV患者、免疫抑制劑使用者、慢性疾病患者等由于免疫功能不完善或低下，更易感染結(jié)核菌。 (2)人體感染結(jié)核分枝桿菌時.大部分病菌可被肺泡內(nèi)巨噬細胞吞噬殺滅，部分病菌由于能抵抗溶酶體酶的破壞而存活，并在肺泡巨噬細胞內(nèi)外生長形成炎性病變，同時沿著淋巴管到達肺門淋巴結(jié)，引起淋巴結(jié)腫大，構(gòu)成原發(fā)綜合征。 (3)T淋巴細胞介導的細胞免疫是人體對結(jié)核分枝桿菌主要免疫保護機制。人體首次

4、感染結(jié)核分枝桿菌后，巨噬細胞分泌多種炎癥介質(zhì)促使淋巴細胞和單核細胞聚集，形成肉芽腫。當抗原再次進入人體.T淋巴細胞尤其是CD4+細胞可識別特異性抗原，增加細胞因子或炎癥介質(zhì)的釋放，激活巨噬細胞的吞噬功能，提高其抗菌活性而達到保護作用。 (4)原發(fā)性結(jié)核感染后有部分結(jié)核分枝桿菌遺留在潛在病灶中，在某個時期可再次發(fā)生結(jié)核病或再次感染結(jié)核分枝桿菌而出現(xiàn)繼發(fā)性肺結(jié)核。當人體出現(xiàn)免疫功能受損、營養(yǎng)不良或抵抗力下降，臨床癥狀表現(xiàn)明顯。 【病理】 滲出、增殖和干酪樣壞死是結(jié)核病特異性炎癥的三種病理改變，可同時存在，相互轉(zhuǎn)化。 1.滲出在結(jié)核病初期或病變惡化復發(fā)時，局部

5、血管通透性增加，組織充血水腫，中性粒細胞、淋巴細胞、單核細胞和巨噬細胞聚集、吞噬結(jié)核菌。當機體T淋巴細胞介導的細 胞免疫功能形成后滲出病變轉(zhuǎn)化為增殖表現(xiàn)，如果機體超敏反應較強時，則轉(zhuǎn)向干酪樣壞死，形成空洞。 2.增殖主要表現(xiàn)為類上皮細胞結(jié)節(jié)和結(jié)核肉芽腫，其中央可見朗漢斯巨細胞，外周有淋巴細胞、漿細胞和巨噬細胞浸潤。結(jié)核結(jié)節(jié)可相互融合形成融合性結(jié)節(jié)。 3.干酪樣壞死機體超敏反應增高或免疫功能低下，滲出性或增殖性病變呈進展惡化，干酪樣組織液化經(jīng)氣管排出，形成空洞。部分干酪樣組織周圍肉芽組織增生，圍以纖維包膜形成結(jié)核球或纖維干酪灶。 【臨床表現(xiàn)】 肺

6、結(jié)核患者常缺乏特征性的臨床表現(xiàn)，20患者可無癥狀或僅有輕微癥狀。全身癥狀表現(xiàn)為低熱、盜汗、乏力、消瘦，食欲下降、體重減輕和月經(jīng)失調(diào)。呼吸道表現(xiàn)咳嗽、咳痰或伴咯血、胸痛、呼吸困難等癥狀。部分患者有結(jié)節(jié)者性紅斑、關(guān)節(jié)痛、泡性結(jié)膜炎和結(jié)核風濕癥(Poncet病)等結(jié)核變態(tài)反應表現(xiàn)。病變范圍較小時一般無明顯體征。當病變廣泛或繼發(fā)空洞形成，叩診呈濁音，聞及支氣管肺泡呼吸音。胸膜增厚或纖維化明顯，患側(cè)胸廓塌陷，肋間變窄，氣管向病側(cè)移位，對側(cè)代償性肺氣腫。 【肺結(jié)核分型】 1.原發(fā)型肺結(jié)核為原發(fā)結(jié)核感染所致的臨床病癥。多見于兒童和青少年。原發(fā)病灶、淋巴管炎和肺門或縱隔淋巴結(jié)結(jié)核炎癥在X線

7、上表現(xiàn)為典型的“啞鈴”樣病變，稱為原發(fā)綜合征。 2.血行播散型肺結(jié)核多為原發(fā)型肺結(jié)核發(fā)展而來，也可繼發(fā)于肺或其他潛伏病灶中的結(jié)核菌進入血液引起。包括急性、亞急性和慢性血行播散型肺結(jié)核，多見兒童、青少年和免疫功能低下患者。急性型全身中毒癥狀明顯，胸片上表現(xiàn)為大小、密度、分布一致的“三均勻”粟粒樣結(jié)節(jié)影。亞急性、慢性者則病變以中上肺野為主，分布及大小不等。 3.繼發(fā)型肺結(jié)核是肺結(jié)核的主要類型，包括浸潤性、纖維空洞性和干酪樣肺炎等。多見于成年人，好發(fā)于上葉尖后段和下葉背段，胸部X線可表現(xiàn)為斑片狀、條索狀陰影以及空洞、干酪樣肺炎等表現(xiàn)。 4.結(jié)核性胸膜炎包括結(jié)核性干性胸膜

8、炎、結(jié)核性滲出性胸膜炎和結(jié)核性膿胸。常為胸膜下病灶蔓延所致，胸片上顯示胸腔積液征象。 5.肺外結(jié)核包括中樞神經(jīng)系統(tǒng)、消化系統(tǒng)、泌尿系統(tǒng)、骨關(guān)節(jié)等全身的結(jié)核病，多由于原發(fā)感染時菌血癥所致的病灶。 【肺結(jié)核特殊類型】 1.無反應性結(jié)核病又稱結(jié)核性敗血癥。多見于嚴重免疫功能低下患者，表現(xiàn)為高熱、肝脾和淋巴結(jié)腫大，肺部陰影延遲出現(xiàn).預后較差。 2.支氣管內(nèi)膜結(jié)核表現(xiàn)為刺激性咳嗽或伴咯血、呼吸困難，痰找結(jié)核分枝桿菌陽性，可繼發(fā)支氣管狹窄、肺不張和阻塞性肺炎等。 3.結(jié)核性風濕癥又稱Poncet病，是結(jié)核病的變態(tài)反應性表現(xiàn)?？梢姸喟l(fā)性關(guān)節(jié)痛或炎癥樣改變，皮

9、膚上出現(xiàn)結(jié)節(jié)性或環(huán)形紅斑。 【并發(fā)癥】 1.咯血肺結(jié)核咯血多為滲出、空洞病變或支氣管扭曲、變形或擴張引起，大咯血可引起窒息、失血性休克、肺不張、結(jié)核支氣管播散和吸人性肺炎等嚴重合并癥。 2.自發(fā)性氣胸胸膜下病灶或空洞破入胸腔，纖維灶或瘢痕組織導致肺氣腫或肺大皰破裂以及肺間質(zhì)的病變引起間質(zhì)肺大皰破裂均可出現(xiàn)氣胸、液氣胸或膿氣胸。 3.肺部繼發(fā)感染肺結(jié)核空洞、結(jié)核性支氣管擴張、支氣管狹窄等是繼發(fā)細菌、真菌感染的病理基礎。 【診斷和鑒別診斷】 1.診斷根據(jù)患者全身結(jié)核中毒癥狀以及呼吸道的臨床表現(xiàn)，結(jié)合典型胸部影像學、痰找結(jié)核桿菌等檢查，診斷

10、較為容易。但肺結(jié)核的臨床和X線往往不典型，易與其他疾病混淆。凡遇到下列情況應考慮肺結(jié)核可能：反復發(fā)作或遷延不愈的咳嗽、咳痰，或呼吸道感染經(jīng)抗炎治療34周無好轉(zhuǎn)；咯血或痰中帶血；長期低熱；體檢肩胛間區(qū)聞及濕性啰音或于啰音；有糖尿病、免疫抑制性疾病或接受激素和免疫抑制劑治療；滲出性胸膜炎或有開放性肺結(jié)核密切接觸史；關(guān)節(jié)腫痛和皮膚結(jié)節(jié)紅斑等變態(tài)反應性表現(xiàn)。 2.鑒別診斷 (1)原發(fā)型肺結(jié)核：支氣管淋巴結(jié)結(jié)核應與結(jié)節(jié)病、淋巴瘤、轉(zhuǎn)移性腫瘤和縱隔惡性腫瘤等相鑒別。 (2)血行播散型肺結(jié)核：應與肺部感染、細支氣管肺泡癌、癌性淋巴管炎、肺間質(zhì)纖維化相鑒別。 (3)繼發(fā)

11、型肺結(jié)核：應與肺部感染、肺膿腫、肺囊腫繼發(fā)感染、肺癌等相鑒別。 3.診斷記錄程序 (1)按病變范圍、部位、類型、痰菌情況和化療史程序書寫。如右上繼發(fā)型肺結(jié)核，涂(+)，復治；左側(cè)結(jié)核性胸膜炎，涂(-)，培養(yǎng)(-)，初治。 (2)如有必要，可在類型后加括弧說明。血行播散型肺結(jié)核可注明急性或慢性；繼發(fā)型肺結(jié)核可注明空洞或干酪性肺炎等。并發(fā)癥、并存病和手術(shù)史可在化療史后按并發(fā)癥、并存病、手術(shù)史等順序書寫。 4.相關(guān)輔助檢查 (1)胸部影像學：胸部X線檢查是診斷肺結(jié)核的重要方法，也是早期發(fā)現(xiàn)肺結(jié)核的重要體檢手段，可確定病變的部位、大小、密度、形態(tài)、有否

12、伴隨空洞以及與周圍組織的關(guān)系，判斷病灶的變化和療效。胸部CT易發(fā)現(xiàn)微小病變，更易顯示病變的性質(zhì)和變化，有利于肺結(jié)核的鑒別診斷，也可以引導穿刺、引流和介入性治療。 (2)痰結(jié)核分枝桿菌檢查：是確診肺結(jié)核病最特異性方法，也是確定治療方案和判斷療效的主要依據(jù)。所有肺結(jié)核或可疑患者均需查痰(具體方法見檢驗診斷部分)。 (3)結(jié)核菌素試驗：結(jié)核菌素主要成分為結(jié)核蛋白，是結(jié)核菌的代謝產(chǎn)物。目前主要使用純蛋白衍生物(purifiedpro-teinderivative，PPD)。將PPD5IU(0.1m1)注入皮下，4872h后觀察皮丘硬結(jié)直徑的變化：<5mm陰性反應，59mm弱陽

13、性(+)；1019mm陽性(+)，20mm或<20mm但伴有水泡或壞死為強陽性(+)。結(jié)核菌素試驗可受較多因素影響，包括變態(tài)反應尚未建立、營養(yǎng)不良、免疫功能低下、嚴重的結(jié)核菌感染等。 (4)支氣管鏡檢查：通過支氣管鏡可獲取組織學標本或分泌物、灌洗液行病原體檢查，提高結(jié)核菌檢出率。 1) 檢驗診斷的意義 肺結(jié)核的診斷、治療離不開實驗室的檢查.尤其是通過實驗室檢查檢到結(jié)核分枝桿菌對肺結(jié)核起到明確診斷的作用。 【一般檢驗】 1.白細胞計數(shù)與分類白細胞檢驗可作為肺結(jié)核不同病程的診斷與治療的依據(jù)。肺結(jié)核急性活動期白細胞總數(shù)增高明顯，白細胞總數(shù)可達(

14、1020)×109L，其中以中性粒細胞增高為主，甚至出現(xiàn)中性粒細胞核左移和中毒性改變，淋巴細胞減少，在嚴重的浸潤型肺結(jié)核時，可致血中單核細胞明顯增多，可達30以上，以成熟型為主，甚至呈單核細胞類白血病反應。肺結(jié)核慢性期白細胞總數(shù)輕度增高或正常，其中以淋巴細胞增高為主。隨著疾病的好轉(zhuǎn)，白細胞恢復正常。 2.紅細胞沉降率 (1)測定方法：魏氏法(Westergren法)；自動血沉測定儀測定法。 (2)標本：抗凝血。一般用109mmolL枸櫞酸鈉溶液與血液按1：4比例使用，抗凝劑應準確，抽血要及時，不能有凝固，也不能有溶血。 (3)參考范圍：魏氏法成

15、年男性015mmh，成年女性020mmh。 (4)臨床診斷價值和評價：血沉測定常作為肺結(jié)核是否活動的監(jiān)測指標，肺結(jié)核于活動期血沉增快明顯。病情好轉(zhuǎn)時血沉減慢，非活動期血沉可正常。但血沉正常亦不能排除活動性肺結(jié)核的可能。魏氏法不論男女其血沉值達25mmh時，為輕度增快；達50mmh時為中度增快；大于50mmh則為重度增快。 (5)方法學評價及問題 1)紅細胞沉降率是指紅細胞在一定條件下沉降的速度，簡稱血沉。且前已知影響血沉的因素很多，主要包括：血漿因素；血漿纖維蛋白原或球蛋白增多可使血沉加快；而清蛋白、糖蛋白等可使血沉減慢。此外膽固醇可使血沉加快.而卵磷脂可使血沉減

16、慢。紅細胞因素：嚴重貧血患者血沉加快，紅細胞增多癥時血沉減慢。紅細胞直徑愈大，厚度愈薄，血沉愈快。而球形紅細胞血沉緩慢。所以應結(jié)合病史，綜合分析結(jié)果才能給臨床提供有用的信息。 2)魏氏法檢測血沉受到抗凝劑、用血量、血沉管位置等方面的影響，如血沉管傾斜、溫度升高致使血沉加快。儀器法已避免了血沉管的影響，能提供血沉下降過程中3個時期：緡錢狀紅細胞形成期；快速沉降期；緩慢沉降期的血沉下降曲線的變化，對結(jié)核病灶活動與否及預后判斷有一定價值。 3)其他血沉測定的方法有庫氏法、溫氏法、潘氏法等，其差別在于抗凝劑、用血量、血沉管、觀察時間以及記錄結(jié)果方面不同。各種方法的參考值有所不同。我

17、國在1983年全國臨床檢驗方法學學術(shù)會議上推薦魏氏法作為參考方法。 4)現(xiàn)臨床上已較多使用光學毛細管停流動力學法測定血沉，此法用血液常規(guī)分析的EDTA-K2抗凝血直接上機檢測，操作方便，儀器通過光學原理進行紅細胞的分析，結(jié)果自動記錄后轉(zhuǎn)換成魏氏法測定值報告。 3.痰液常規(guī)檢查 (1)測定方法：外觀理學、顯微鏡檢查及涂片革蘭染色。 (2)標本：痰液，以晨痰為宜。 (3)臨床診斷價值和評價：肺結(jié)核痰液常規(guī)檢查在臨床應用上有一定的參考價值。在疾病的活動期尤其出現(xiàn)咯血，痰液中可見少量或大量紅細胞。肺結(jié)核如繼發(fā)感染時疲液通常變成膿性，量也增加，鏡下白細胞

18、增多，以中性粒細胞增高為主，也可出現(xiàn)少量的紅細胞以及來自氣管、支氣管脫落的上皮細胞，痰液涂片革蘭染色常顯示混合細菌，需通過痰液細菌培養(yǎng)來鑒定病原菌并進行藥敏試驗，為臨床提供有效依據(jù)。 4.涂片找結(jié)核分枝桿菌 (1)測定方法：有直接涂片法、集菌檢查法，一般用抗酸染色，也可用熒光染色檢查。 (2)標本：疲液.以晨痰為宜。 (3)參考范圍：陰性。 (4)臨床診斷價值和評價：痰中找到結(jié)核分枝桿菌是確診肺結(jié)核的主要依據(jù)，也是發(fā)現(xiàn)傳染源、觀察療效、決定是否治愈和流行病學調(diào)查統(tǒng)計的主要依據(jù)和指標。要確定陽性與否至少初診查痰次數(shù)為2次，最好3次，必要時應更多。

19、痰涂片鏡檢抗酸桿菌陽性2次，結(jié)合臨床即可明確診斷。痰菌陽性說明病灶是開放性的，具有傳染性。檢查陰性并不能排除肺結(jié)核，一般應注意病程、采樣的時機、方法以及其他原因的影響。治療中強化期結(jié)束與全療程結(jié)束前2個月均應檢查痰菌。 (5)方法學評價及問題 1)涂片陽性報告為“查到抗酸桿菌”。 2)為確保痰菌檢出率，可先作即時痰再留夜痰、晨痰。合格的痰液標本是檢驗結(jié)果的保證。標本收集前，應清潔口腔，除去口腔內(nèi)大量的雜菌，用力咳出氣管深部痰液吐到無菌的容器內(nèi)，量不少于1ml。也可收集24h痰液或支氣管鏡下取支氣管肺泡灌洗液，無痰者可霧化吸人引痰。兒童大多不會咳嗽留痰而常吞咽入胃，

20、故可抽清晨胃液或嘔吐物查菌。標本收集后應及時送檢，如不能及時檢查，可放人冰箱短時間貯存。 3)直接涂片法快速、簡便，是最常見的檢查方法，但干擾因素多，檢出率不高(抗酸染色鏡檢陽性率僅30左右)，一般需要每毫升痰液含有結(jié)核分枝桿菌10萬條以上才能檢出，而且不能區(qū)分死菌、活菌，也不能區(qū)分非結(jié)核分枝桿菌。對痰結(jié)核分枝桿菌量較少，雜菌和雜質(zhì)多時，直接涂片也不易檢出，為了提高痰結(jié)核分枝桿菌檢出率，可采取沉淀集菌法、漂浮集菌法，每毫升痰液含結(jié)核分枝桿菌1000條即能檢出，但需時間較長才能得到結(jié)果。也可利用支氣管肺泡灌洗液(BALF)檢查，又稱為“肺的液體活組織檢查”或“肺的液性活檢”，涂片平均陽

21、性事為33.9。 4)涂片熒光染色法選用金胺O作熒光染色，可提高涂片效果，也提高陽性檢出率，適合于大量標本的快速檢查，但熒光物質(zhì)有時會干擾結(jié)果的判斷，導致假陽性。 5.結(jié)核分枝桿菌培養(yǎng) (1)測定方法 1)傳統(tǒng)培養(yǎng)法：L-J培養(yǎng)基法。 2)快速培養(yǎng)法：Bactec460、Bactec960等系統(tǒng)，自動培養(yǎng)、鑒定，并進行藥敏試驗。 (2)標本：痰液，以晨痰為好。 (3)參考范圍：陰性。 (4)臨床診斷價值和評價：結(jié)核分枝桿菌培養(yǎng)是目前結(jié)核菌檢查的“金標準”，痰中培養(yǎng)到結(jié)核分枝桿菌是確定診斷與治療肺結(jié)核的主要依據(jù)。對于

22、肺結(jié)核患者應及早、多次進行結(jié)核分枝桿菌培養(yǎng)，培養(yǎng)法如得到陽性結(jié)果可做菌型鑒定并作藥敏試驗，為臨床提供可靠的診斷與治療依據(jù)，使患者能及時接受正確的治療方案，及時控制病情，避免形成耐藥結(jié)核菌株。 (5)方法學評價及同題 1)標本：采集應在抗結(jié)核治療之前為好。應做到規(guī)范化采集標本，收集到無菌廣口容器內(nèi)，及時送檢。 2)培養(yǎng)方法：傳統(tǒng)培養(yǎng)法以每毫升標本含結(jié)核分枝桿菌100條以上即為陽性。但此法結(jié)核分枝桿菌生長緩慢，培養(yǎng)周期長，37培養(yǎng)46周后才有培養(yǎng)結(jié)果，不利于臨床及時診斷和治療。Bactec法快速培養(yǎng)，其原理是細菌利用培養(yǎng)基里含放射性同位素14C棕櫚酸脂，代謝后產(chǎn)生含1

23、4C的CO2來檢測結(jié)核桿菌，可使報告時間縮短至20d，也可作藥敏試驗。但檢測條件要求較高，需配套進口培養(yǎng)基。由于靈敏度高，一旦出現(xiàn)污染.將產(chǎn)生假陽性結(jié)果，最好能同時作傳統(tǒng)培養(yǎng)法驗證。 3)菌型鑒定：分枝桿菌菌型的鑒定常根據(jù)培養(yǎng)特征(菌落形態(tài)等)和一系列的生化反應(煙酸試驗和硝酸鹽還原試驗等)來確定。由于分枝桿菌的生化反應經(jīng)常發(fā)生變化，這為其鑒定帶來了不確定性。目前可通過分子生物學方法快速、明確地確定菌型。 4)藥物敏感性試驗：每一患者只用一株分離菌株作藥敏試驗即可。比例法，現(xiàn)為國際通用的分枝桿菌藥敏試驗方法，采用Loewenstein-Jensen培養(yǎng)基，檢查實驗菌株對異煙

24、肼(H)、利福平(R)、鏈霉素(S)和乙胺丁醇(E)等的耐藥性。耐藥性用在臨界藥物濃度時的生長菌落的百分數(shù)來表示。臨界藥物濃度：異煙肼：0.2gml、利福平40gml、鏈霉素4gml、乙胺丁醇2gml。結(jié)果的判定按常用耐藥性標準，即所有藥物均為1。耐藥標準：含藥培養(yǎng)基菌落數(shù)對照管不含藥培養(yǎng)基菌落數(shù)>1為耐藥。絕對濃度法，含藥培養(yǎng)基菌落數(shù)20為耐藥。間接放射性同位素法，為Bactec450儀器所用，快速可靠。 【特殊檢驗】 1.結(jié)核特異性抗體 ：探討結(jié)核抗體在結(jié)核病的診斷、鑒別診斷以及療效觀察中的價值。方法 通過對324例患者血清結(jié)核抗體和痰檢的結(jié)果進行對比分

25、析。結(jié)果 結(jié)核抗體檢測的陽性率為4599，痰檢的陽性率2469。(1)測定方法：酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA法)、金標法等。 (2)標本：血清、痰液。 (3)參考范圍：陰性。 (4)臨床診斷價值和評價：機體感染結(jié)核分枝桿菌后能產(chǎn)生特異性免疫應答，包括細胞免疫(結(jié)核菌素測定)和體液免疫(結(jié)核抗體)應答。測定體液中結(jié)核抗體可間接反映結(jié)核感染的存在，可輔助肺部有結(jié)核病變、但直接痰涂片和(或)結(jié)核分枝桿菌培養(yǎng)陰性的肺結(jié)核診斷。活動性肺結(jié)核多為陽性，但免疫功能低下者為陰性。隨著抗結(jié)核治療時間的延長，血清抗結(jié)核分枝桿菌抗體水平逐漸降低，也可通過結(jié)核抗體水平來評估結(jié)核病的轉(zhuǎn)歸。

26、 (6)方法學評價及問題 1) ELISA法：能做到快速、敏感、特異、簡便，但其特異性、敏感性、測定方法仍受到許多因素的影響.而且陽性結(jié)果不能排除以往感染或非結(jié)核分枝桿菌感染、卡介苗接種等所致。2） 膠體金法 ：操作簡便，無需或僅需極小的操作經(jīng)驗即可完成，無需任何儀器，保存方便，通常在室溫下可以穩(wěn)定保存一年以上，便攜，現(xiàn)場檢測，時間短，加樣后5-10分鐘可得到結(jié)果。3） 金標法結(jié)核抗體試驗(TB-DOT)：該方法是應用現(xiàn)代生物技術(shù)提純結(jié)核分枝桿菌特異性外膜抗原，引進斑點金免疫滲濾試驗(DIGFA)原理，在定性檢測的基礎上，引進定量標準色譜卡技術(shù)，用于測定活動性結(jié)核

27、患者IgG、IgA、IgM抗體的快速血清免疫學診斷，以及用于化療后抗體滴度動態(tài)跟蹤觀察，具有靈敏度高、特異性強等特點，能在數(shù)分鐘內(nèi)完成檢測。具有簡便、快速、不需特殊儀器等特點，得到臨床廣泛應用。 由于結(jié)核分枝桿菌是胞內(nèi)苗，加上結(jié)核分枝桿菌的弱抗原性、屬間和種間共同抗原決定簇的存在，其在機體內(nèi)的免疫反應是以細胞免疫為主，感染后的抗結(jié)核抗體滴度較低，而且抗體滴度與病情的相關(guān)性未得到充分闡明，它與細胞免疫鑲嵌性、抗體產(chǎn)生的前緩和后滯作用、共同抗原決定簇的存在和由于種種原因產(chǎn)生的假陽性和假陰性使結(jié)核病血清學診斷一直未取得實質(zhì)性進展。 4）結(jié)核桿菌蛋白芯片檢測：肺結(jié)核病的診斷主要為痰

28、涂片抗酸染色鏡檢，痰結(jié)核菌培養(yǎng)法。患者無痰則無法檢測，抗酸染色鏡檢陽性率低且影響因素較多，痰結(jié)核菌培養(yǎng)法耗時長且對早期感染不易檢出。因此，實現(xiàn)早期診斷結(jié)核分枝桿菌感染及建立準確，快速簡便的試驗方法，即結(jié)合抗體檢測成為了結(jié)核病診斷和鑒別診斷的重要方法，國內(nèi)外相繼報道了脂阿拉伯甘露聚糖（LAM）,結(jié)核菌重組蛋白抗原38KD和16KD等在結(jié)核病抗體檢測中的作用，目前已經(jīng)有的結(jié)合抗體檢測試劑均為未純化的結(jié)核菌液抗原，存在特異性差的缺陷。三種抗原均為結(jié)核桿菌特異性較高的抗原，存在于結(jié)核桿菌復合群中，具有較強的免疫原性，適用于血清學診斷。LAM是一種結(jié)核桿菌細胞壁的脂多糖成分，具有較強的抗原性，其檢測的靈

29、敏性較高。是其他分枝桿菌所不具有的或者其含量遠低于結(jié)核菌，約有75%的人群感染結(jié)核菌后會產(chǎn)生針對LAM的特異性抗體。38KD抗原是引起人結(jié)核病的結(jié)核分枝桿菌含有的一種特異性蛋白質(zhì)抗原。即使已經(jīng)預防接種也不會影響檢測結(jié)果。并且患者體內(nèi)針對38KD的抗體與患者的感染程度有良好的線性關(guān)系?？梢詣討B(tài)監(jiān)測該抗體，用于結(jié)核病的治療考核及抗藥物的選擇。16KD蛋白僅發(fā)現(xiàn)與結(jié)核菌復合群中，在其他分枝桿菌不存在該抗原的基因，因而也不表達該抗原。而其他分枝桿菌感染不能誘導機體產(chǎn)生抗16KD蛋白抗體，且該抗原陽性對兒童結(jié)核病和肺外結(jié)核的診斷提供較好的信息。所以3個指標聯(lián)合檢測可提高痰涂片陰性者的檢出率，提供不同情況

30、的早期診斷結(jié)果?？设b別痰涂片陽性者是否屬于結(jié)核桿菌感染。但該實驗的局限性在于僅用于血清樣本的測定和對免疫力低下者無法檢出。5）結(jié)核桿菌T細胞檢測（TB-IGRA）：結(jié)核菌素皮膚實驗(PPD)用于診斷感染和活動性結(jié)核病，陽性結(jié)果與患者當前或未來是否患結(jié)核病具有相關(guān)性。局限性在于在免疫抑制者，新近感染者，營養(yǎng)不良患者以及幼兒中，由于其機體的免疫應答減弱，PPD實驗會出現(xiàn)假陰性結(jié)果，導致其敏感度降低。由特異的T細胞釋放的IFN-在結(jié)核病診斷中具有較高的敏感度和特異度。方法學評價及問題：評價TBIGRA與常用幾種結(jié)核分枝桿菌檢測方法的優(yōu)越性。方法選擇確診肺內(nèi)結(jié)核70例，肺外結(jié)核33例及體檢正常人群30

31、例為對照，分別采用TB-lGRA、TST（PPD）、結(jié)核抗體、痰涂片及痰菌培養(yǎng)等方法檢測結(jié)核分枝桿菌感染，進行統(tǒng)計學分析評價。結(jié)果結(jié)核分枝桿菌感染者TBIGRA檢出陽性率、敏感性、Youden指數(shù)（準確性）均比常規(guī)方法高，差異有統(tǒng)計學意義（P001）；正常對照組陽性檢出率比常規(guī)方法低，差異亦有統(tǒng)計學意義（P005）。表明TBIGRA假陽性出現(xiàn)少，準確性高，且對肺內(nèi)、肺外結(jié)核的檢測同樣準確有效。結(jié)論TBIGRA檢測肺內(nèi)、肺外結(jié)核病簡便、快速、敏感、準確有效，值得臨床推廣應用。與T-SPOT.TB的區(qū)別？應用人群：1) “菌陰”結(jié)核的輔助診斷對于圖片和培養(yǎng)陰性的疑似結(jié)核病患者2) 肺外結(jié)核的鑒別診

32、斷結(jié)腦（兒童），骨結(jié)核，腸結(jié)核（與CD鑒別），結(jié)核性胸膜/胸膜炎（胸腹水待查的患者），淋巴結(jié)核等。3) 免疫力低下/受抑制人群的結(jié)核篩查4) 兒童結(jié)核病的輔助診斷5) 高結(jié)核暴露風險人群的篩查2.結(jié)核分枝桿菌分子生物學檢測 (1)測定方法：PCR法、核酸雜交法等。 (2)標本：痰液。 (3)參考范圍：陰性。 (4)臨床診斷價值和評價：結(jié)核分枝桿菌DNA檢測具有敏感性高、特異性強、快速、能檢出低活力菌等優(yōu)點，對早期尤其是痰結(jié)核分枝桿菌涂片或培養(yǎng)陰性的肺結(jié)核的診斷有一定的價值。由于結(jié)核分枝桿菌DNA檢測的各種方法存在許多技術(shù)上的問題，還有待進一步的完善與改進

33、，臨床上還未廣泛應用。 (5)方法學評價及問題 1)TB-DNA-PCR檢查即結(jié)核分枝桿菌基因檢測，其基本原理是利用DNA在體外反復“克隆”復制，在短時間內(nèi)，DNA可復制到原來的百萬倍。此方法具有快速、特異、靈敏度高的特點，但電泳法定性PCR易出現(xiàn)假陽性(污染及引物的特異性不高等引起)，限制了其臨床應用。  熒光定量PCR技術(shù)，是利用熒光探針的高特異性和PCR擴增的敏感性相結(jié)合，真正實現(xiàn)了結(jié)核病的快速診斷。標本類型可為尿液，痰液，腦脊液，抗凝血液，具有較高的敏感性和特異性，它具有快速(34h出結(jié)果)、靈敏(檢出率可達到10條菌毫升標本)、特異性高的特點.相對常規(guī)定

34、性PCR，減少了許多中間操作環(huán)節(jié)，減少了交叉污染機會，既可定性又可定量檢測，陽性率達60以上。此方法不受抗結(jié)核藥物的影響，這對已開始抗結(jié)核治療，結(jié)核菌生長受到抑制或發(fā)生變異而導致培養(yǎng)陰性的結(jié)核病有重要的診斷價值，也可用于評價抗結(jié)核用藥療效。 需要注意的是，PCR方法檢測的是病原體核酸，不管結(jié)核桿菌是否為活的桿菌，PCR均能檢出，因此，在經(jīng)抗生素治療一個療程后，必須兩周后才能做PCR檢測，以避免臨床假陽性。2)核酸雜交法是利用核酸探針，即能識別特異性核苷酸序列的帶標志的一小段DNA分子，根據(jù)DNA雙鏈互補結(jié)合原理，檢測標本中結(jié)核特異性DNA片段來診斷結(jié)核病，可以 在數(shù)小時內(nèi)完

35、成鑒定。此方法技術(shù)復雜，特異性強、靈敏度高的理想核酸探針尚缺乏，如果結(jié)合PCR技術(shù)，將標本中的結(jié)核菌特異性核酸先進行擴增，再進行探針檢測，就能更早期、靈敏、特異地檢測到少量的結(jié)核菌的存在，為臨床結(jié)核病的診斷與治療開拓新的領(lǐng)域。 3)除PCR、核酸雜交對結(jié)核分枝桿菌進行分子生物學診斷的方法外，還有堿基序列測定、基因芯片檢測等分子生物學手段。如16srRNA基因序列測定，由于分枝桿菌的16srRNA基因序列是高度可變的，有種類的特異性，即不同種的分枝桿菌其16srRNA基因序列是不同的，所以可通過測定16srRNA基因序列來鑒定菌種。 基因芯片在基因表達譜分析、基因診斷、藥物篩

36、選及序列分析等諸多領(lǐng)域呈現(xiàn)出廣闊的應用前景，但要成為臨床實驗室普遍采用的技術(shù)，仍有許多問題急待解決，如：提高基因芯片的特異性；簡化樣品制備和標記操作；增加信號檢測的靈敏度；高度集成化樣品制備、基因擴增、核酸標記及檢測儀器的研制和開發(fā)。 3.L型結(jié)核桿菌檢查 (1)測定方法：細胞壁染色法、L型分枝桿菌培養(yǎng)基培養(yǎng)法、分子生物學方法。 (2)標本：痰液。 (3)參考范圍：陰性。 (4)臨床診斷價值和評價。 1)凡能破壞肽聚糖結(jié)構(gòu)或抑制肽聚糖合成的因素都可誘導細菌形成L型。結(jié)核分枝桿菌在體內(nèi)外經(jīng)青霉素、環(huán)絲氨酸或溶菌酶誘導可影響細胞壁中肽聚糖

37、的合成，異煙肼可影響分枝桿菌的合成，巨噬細胞吞噬結(jié)核分枝桿菌后溶菌酶的作用可破壞肽聚糖，均可導致其變?yōu)長型，呈顆粒狀或絲狀。L型結(jié)核分枝桿菌是結(jié)核分枝桿菌生命周期中的一個重要環(huán)節(jié)，是結(jié)核分枝桿菌為了適應不良環(huán)境的一種保護性反應，其細胞壁完全或部分缺失，導致細胞壁中分枝菌酸也全部或部分缺失。 2)L型結(jié)核分枝桿菌可在結(jié)核患者各種標本中檢出。L型結(jié)核分枝桿菌的檢查對診斷菌陰結(jié)核病有極其重要意義。臨床上，細菌L型的主要意義在于細菌仍有致病性，而且是臨床上感染漏診的主要原因之一。 (5)方法學評價及同題 1)細胞壁染色法有其缺陷，其只能證明標本內(nèi)存在L型菌，但不一定就是L

38、型結(jié)核菌，培養(yǎng)法還須經(jīng)返祖才可確診為L型結(jié)核菌，其費時太長。如能在做細胞壁染色及培養(yǎng)的同時，結(jié)合分子生物學方法來確診是否為L型結(jié)核菌，將大大提高確診的效率，而且會使L型結(jié)核分枝桿菌檢測更加快速，符合臨床需要。 2)細菌L型需在高滲和營養(yǎng)豐富的條件下才能生長，細菌L型生長緩慢，無陽性發(fā)現(xiàn)可報告無L型細菌生長。 3)細菌L型對抗生素的敏感性往往與原菌有所不同。 4.結(jié)核桿菌耐藥基因的檢測 (1)測定方法：直接測序法，單鏈構(gòu)象多態(tài)性分析(SS-CP)及固相雜交法。 (2)標本：痰液。 (3)參考范圍：陰性。 (4)臨床診斷價值和評

39、價 1)抗結(jié)核藥物的應用，使得結(jié)核病得到控制和治愈，然而間斷用藥、不合理的用藥、管理不善等致使結(jié)核分枝桿菌不能及時被藥物殺滅而產(chǎn)生耐藥性。耐藥結(jié)核病導致病程延長，死亡的危險性增加，傳染性增加，已成為引起全球結(jié)核病急劇上升的原因之一，特別是耐多藥結(jié)核病(mdr-th)的發(fā)生對結(jié)核病控制規(guī)劃的實施構(gòu)成嚴重的威脅。耐多藥結(jié)核病是指至少對抗結(jié)核藥物中異煙肼和利福平產(chǎn)生耐藥的結(jié)核病。耐藥性是通過結(jié)核分枝桿菌特有細胞壁降低多數(shù)藥物通透性、結(jié)核分枝桿菌產(chǎn)生諸如-內(nèi)酰胺酶的降解酶類和其他藥物修飾酶兩種途徑產(chǎn)生的。通過基因的分析，染色體突變介導的耐藥性是結(jié)核分枝桿菌產(chǎn)生耐藥的主要形式，由于靶基因核苷酸

40、的突變，形成錯誤的氨基酸順序，影響了藥物和靶位酶的親和性，形成結(jié)核分枝桿菌對藥物的敏感性下降或耐受。由于基因突變的發(fā)生.有23以上的結(jié)核分枝桿菌菌株對多種抗結(jié)核藥物產(chǎn)生耐藥性。快速鑒定結(jié)核分枝桿菌耐藥基因類型，了解結(jié)核病患者的耐藥狀況，對指導臨床的化療和防止耐藥菌株的播散是非常必要的。 因為檢測患者結(jié)核的耐藥譜是治療的必要條件，但普通的培養(yǎng)加藥敏試驗需要時間可達2個月，時間長，早期得到耐藥信息對患者的治療更有意義。臨床標本經(jīng)前處理后接種在改良羅氏固體培養(yǎng)基或改良羅氏的液體培養(yǎng)基進行直接(絕對濃度法)或間接(比例法)的藥敏試驗。這是傳統(tǒng)的方法，也是應用最早、最為普遍的檢測結(jié)核分枝桿菌耐

41、藥性的方法，也是判定其他檢測方法時的參考標準13。該方法操作簡單、經(jīng)濟、適用于經(jīng)濟欠發(fā)達地區(qū)使用，但是存在著檢測周期長(68周)、陽性檢出率低、不易標準化、結(jié)果重復性不佳、費時費力等缺點，不能滿足臨床的急需。2)近年來研究證實：耐利福平主要是由于編碼RNA聚合酶的rpob基因突變；耐異煙肼系與katg、inhamaba、ahpc基因突變有關(guān)；pcna基因突變是耐毗嗪酰胺酶藥的主要原因；編碼16srRNA的rrs基因和編碼s12蛋白的rps1基因的突變與耐鏈霉素有關(guān)；乙胺丁醇耐藥株與embab基因有關(guān)。耐多藥是由于多種藥物靶基因突變所致，少數(shù)耐多藥分離株只有一個利福平耐藥基因突變.可能只存在一個

42、突變位點，也可能系檢查技術(shù)所限，未能測出所有突變。 (5)方法學評價及問題 1)直接測序法：是鑒定突變的金標準.利用耐藥區(qū)域PCR擴增，PCR擴增產(chǎn)物純化或克隆化取DNA片段直接測序，與標準敏感菌株的同一DNA片段比較，分析堿基突變的位置和分布。目前已應用自動化DNA測序儀分析臨床分離的結(jié)核桿菌基因突變。 第三代DNA測序技術(shù)通過現(xiàn)代光學，高分子，納米技術(shù)等手段來區(qū)分堿基信號差異的原理，可以直接讀取序列信息。DNA序列分析法是一種直接、客觀的檢測突變的方法，但由于設備和技術(shù)條件限制了其廣泛應用。該方法不僅能用于細菌基因突變的檢測，而且能夠確定其突變的部位與性質(zhì)，是

43、檢測基因突變的決定性方法。PCRDNA序列測定簡便、快速，約848 h即可完成，是最常用的測定方法。目前，DNA序列測定已作為從基因水平進行結(jié)核分枝桿菌耐藥性測定的金標準。但對每一菌株來說，要測定各種抗結(jié)核藥物的所有已知突變部位，需多次反應，同時費用昂貴，因此其應用受到限制。故此法多作為評價其他方法的參考方法，或與其他方法結(jié)合應用。2)聚舍酶鏈反應-單鏈構(gòu)象多態(tài)性分析(PCR-SSCP)：PCR-SSCP原理是單鏈核酸通過自身互補或分子內(nèi)的相互作用形成折疊構(gòu)象，單個核苷酸的突變可造成其構(gòu)象改變，從而導致其在非變性凝膠電泳上遷移速度的改變，是檢測單堿基置換和堿基缺失或插入的可靠而簡便方法.比直接

44、DNA測序容易進行，可作為檢測的快速篩選方法，也是一種檢測耐藥性的有效手段。目前用熒光素標記PCR擴增產(chǎn)物而建立自動化SSCP分析法，可直接檢測痰涂片陽性標本和Bactec陽性培養(yǎng)物中的耐藥菌株，適用于大量標本的快速篩選。 3)固相雜交法：根據(jù)結(jié)核分枝桿菌RFP耐藥ropb基因突變資料，設計一組覆蓋69bpropb高變區(qū)的寡核苷酸探針，包括結(jié)核分枝桿菌探針一個，覆蓋69bpropb高度區(qū)的野生型探針5個，ropb突變特異的攆針4個。依次固定于尼龍膜上，然后與待測菌株ropb基因擴增片段進行雜交，根據(jù)雜交譜帶判斷有無突變及突變的類型。因采用多個撩針且固定于尼龍膜上形成多列，此方法又稱為

45、多列探針檢測法(lineprobeassay，LiPA)。該方法可快速鑒定結(jié)核桿菌RFP耐藥株ropb基因的突變，適合于臨床標本的直接檢測。現(xiàn)已有商品化LiPA試劑盒。4)反向線性點雜交技術(shù)：用膜芯片檢測結(jié)核分支桿菌對鏈霉素和乙胺丁醇的耐藥性，具有較高的特異性和敏感性，可作為常規(guī)藥敏方法的補充，用于指導開展早期，有效的臨床化療。檢測速度快，數(shù)小時到一天時間就可以完成檢測。缺點是受探針數(shù)量限制，與測序技術(shù)相比，反向斑點雜交技術(shù)就不能檢測到所有可能的突變類型，也更不可能檢測到新的突變類型；另外基因突變和耐藥表型也并非是一一對應的關(guān)系；所以反向雜交技術(shù)只能作為快速檢驗的輔助手段，下一步將進一步擴大探

46、針系列中的探針數(shù)量，更多檢測結(jié)核耐藥性位點。 5. T淋巴細胞亞群(CD4+細胞CD8+細胞)目前T淋巴細胞較為明確的兩個亞群是輔助性T細胞(Th)和細胞毒性T細胞(Tc)。輔助性T細胞是能夠幫助B細胞分化成抗體產(chǎn)生細胞和放大細胞免疫應答的一個細胞群，表達CD4但不表達CD8。細胞毒性T細胞(Te)是能特異性溶解靶細胞的一個細胞亞群，表達CD8但不表達CD4。CD4分子可增強對MHC類抗原的結(jié)合，CD8分子增強對MHC類抗原的結(jié)合。臨床檢測CD4+細胞CD8+細胞可作為細胞免疫功能的評價指標之一。 (1)測定方法：流式細胞儀測定、熒光免疫組化技術(shù)、酶免疫組化技術(shù)等。其原理是

47、利用CD系統(tǒng)的單克隆抗體(MeAb)與外周血單個核細胞反應的百分率，可確定人T細胞亞群的分布情況。 (2)標本：肝素抗凝血。 (3)參考范圍：CD4細胞陽性率為(45.7土5.3)；CD8細胞陽性率為(27.9±5.0)；CD4+CD8+細胞比值為1.66±0.33。 (4)臨床診斷價值和評價：T淋巴細胞介導的細胞免疫是人體對結(jié)核分枝桿菌主要免疫保護機制。CD4和CD8細胞是結(jié)核病產(chǎn)生保護性免疫反應的主要效應細胞。在結(jié)核分枝桿菌感染的早期，活化的CD4和CD8細胞就向感染病灶轉(zhuǎn)移和聚集，通過遞呈抗原、參與結(jié)核結(jié)節(jié)的形成、溶解被感染的細胞以及直接

48、殺菌等作用來控制結(jié)核分枝桿菌擴散和防止結(jié)核病灶的復燃。肺結(jié)核尤其是活動性肺結(jié)核，其外周血中的CD4+細胞百分率增加，CD8+細胞百分率減少，CD4+CD8+細胞比值增加明顯。 (5)方法學評價及問題  1)流式細胞儀(flowcytometer，F(xiàn)CM)是利用流式細胞技術(shù)對細胞或顆粒進行快速分析的自動分析儀。近年用流式細胞儀測定T細胞亞群日益廣泛，結(jié)果穩(wěn)定，重復性好。 2)熒光免疫組化技術(shù)、酶免疫組化技術(shù)等主要影響是熒光抗體應有較高純度，否則易出現(xiàn)假陽性結(jié)果。試驗中所用McAb和熒光抗體的最適工作濃度均應通過預試驗選擇。 3)嬰幼兒CD4+細胞數(shù)較高而CD8+細胞數(shù)較低，老年人CD8+細胞數(shù)下降，因而其CD4+CD8+細胞比值較高；男女性T細胞數(shù)及其亞群相似.但女性CD4+CD8+細胞比值高于男性。在分析結(jié)果時應對此加以考慮。  6. 分枝桿菌菌種鑒定