表面微生物監(jiān)測(cè)

1、表面微生物監(jiān)測(cè)除了用空氣微生物取樣來(lái)監(jiān)測(cè)生產(chǎn)環(huán)境的微生物污染水平外，表面監(jiān)測(cè)也可監(jiān)測(cè)生產(chǎn)區(qū)域表面以及設(shè)備與產(chǎn)品接觸表面的微生物世。監(jiān)測(cè)的方法必須考慮取樣的準(zhǔn)確性和代表性?；镜谋O(jiān)測(cè)方法包括接觸碟法、擦拭法以及表面沖洗法。每種提供的數(shù)據(jù)都可以用于 產(chǎn)品質(zhì)量的評(píng)價(jià)。測(cè)試方法可以定性和定量。而且取樣的準(zhǔn)確性受收集和處理樣品的過(guò)程 影響，因此必須對(duì)取樣進(jìn)行培訓(xùn)和測(cè)試。(1) 接觸碟法接觸碟容易操作而且可以定量。因此被廣泛使用，適用于對(duì)平整的規(guī)則性表面進(jìn)行取 樣監(jiān)測(cè)。通常的碟子是50mm直徑的，培養(yǎng)基充滿(mǎn)碟子并形成圓頂，取樣面積一般約為 25cm2。培養(yǎng)基可以根據(jù)使用添加中和劑。取樣時(shí)，確保全部瓊脂表面

2、與取樣點(diǎn)表面充分 接觸。取樣后，需用蘸有70%乙醇的紗布擦拭被取樣表面，以除去殘留瓊脂。將取樣后并 做好標(biāo)記的接觸碟置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，讀數(shù)，記錄。缺點(diǎn)：不適用于非常規(guī)表面；若培養(yǎng)基太濕潤(rùn)，菌落會(huì)連片生長(zhǎng)導(dǎo)致不易計(jì)數(shù)。(2) 擦拭法該方法通常用于對(duì)不規(guī)則表面（尤其是設(shè)備表面）進(jìn)行取樣。拭子通常為一根棒狀 物，其頂端由吸水性材料制成，拭子頭在取樣前應(yīng)先行浸濕（通常為無(wú)菌生理氣化鈉溶液 或0. 1%的蛋白胨溶液約5ml),取樣時(shí)，握住拭子柄，以30°角與取樣表面接觸，緩慢并 充分擦拭，取樣面積25cm2左右（可用特定的無(wú)菌模板確定擦拭面積），然后將取樣頭折 斷放入上述溶液內(nèi)，充分振蕩，再用

3、平皿涂布法或鋪平板法計(jì)數(shù)。如果拭子頭的材料為藻 酸鈣，則要用稀的鹽溶液作為稀釋劑（如1%檸檬酸鈉溶液），這樣才能讓拭子頭完全溶 解。因擦拭取樣的面積一般約為25cm2，故擦拭法也屬于定量檢測(cè)方法。缺點(diǎn)：取樣和轉(zhuǎn)移技術(shù)可能會(huì)影響結(jié)果；樣品處理后才能培養(yǎng)。(3) 表面沖洗法該法適用于監(jiān)測(cè)大面積區(qū)域內(nèi)表面的微生物含菌量，包括設(shè)備軌道、儲(chǔ)水罐等。用定 量的無(wú)菌水沖洗表面，收集淋洗水，用膜過(guò)濾法來(lái)計(jì)算微生物數(shù)量。缺點(diǎn)：適用性不廣，需要額外的操作，取樣和處理過(guò)程可能會(huì)影響結(jié)果。D. 人員衛(wèi)生監(jiān)測(cè)人員是無(wú)菌生產(chǎn)中主要污染源。對(duì)于無(wú)菌藥品的人員要求參見(jiàn)“4人員”。人員衛(wèi)生監(jiān)測(cè)的方法與表面微生物監(jiān)測(cè)方法中的接觸

4、碟法相同。E. 培養(yǎng)基及培養(yǎng)條件環(huán)境監(jiān)測(cè)用培養(yǎng)基的類(lèi)型和培養(yǎng)條件取決于所選用的檢測(cè)方法，但必須具有廣譜性。 通常，營(yíng)養(yǎng)瓊脂（NA)或大豆胰蛋白胨瓊脂（TSA)培養(yǎng)基屬于全能型培養(yǎng)基。此類(lèi)培 養(yǎng)基適用于多數(shù)環(huán)境微生物（包括真菌）的分離生長(zhǎng)。但是，對(duì)專(zhuān)用于酵母菌分離生長(zhǎng)的 特定培養(yǎng)基，仍應(yīng)另行選擇，如玫瑰紅鈉瓊脂、薩布羅（Sabourauds)培養(yǎng)基等都是常用 的真菌培養(yǎng)基。如果被監(jiān)測(cè)環(huán)境中使用過(guò)消毒劑或存在抗生素，則要向表面監(jiān)測(cè)用培養(yǎng)基 中加一些添加劑（聚山梨酯80、卵磷脂、偶氮凝集素或(3-內(nèi)酰胺酶等），以中和或盡量 減少消毒劑或抗生素的抑菌作用。例如，在對(duì)非抗生素生產(chǎn)級(jí)區(qū)環(huán)境設(shè)施表面監(jiān)測(cè)時(shí)，

5、通 常是在營(yíng)養(yǎng)瓊脂或大豆胰蛋白胨瓊脂培養(yǎng)基內(nèi)添加0.7%的聚山梨酯80和0. 1%的卵 磷脂。應(yīng)對(duì)環(huán)境監(jiān)測(cè)用微生物培養(yǎng)基進(jìn)行驗(yàn)證，驗(yàn)證其在適當(dāng)?shù)臅r(shí)間和溫度條件下檢出真菌 (包括酵母菌和霉菌）和細(xì)菌的能力。用于環(huán)境監(jiān)控的培養(yǎng)基，首先應(yīng)檢查其可靠地恢復(fù)微生物生長(zhǎng)的能力。所有配好的培 養(yǎng)基批號(hào)，均應(yīng)進(jìn)行培養(yǎng)基靈敏度試驗(yàn)，表14-4列出了環(huán)境監(jiān)測(cè)用培養(yǎng)基靈敏度檢查菌 種。必要時(shí)，應(yīng)使用中和劑，防止?jié)崈羰蚁緞┗虍a(chǎn)品殘留（如抗生素）抑制微生物生 長(zhǎng)。培養(yǎng)基靈敏度檢查試驗(yàn)中，可加人環(huán)境監(jiān)測(cè)中分離的菌株進(jìn)行試驗(yàn)，接種量應(yīng)不超過(guò) 100個(gè)菌。培養(yǎng)基相關(guān)的其他內(nèi)容，參見(jiàn)“15.6培養(yǎng)基”。表14 -4推薦環(huán)境監(jiān)

6、測(cè)用培養(yǎng)基靈敏度檢查菌種分類(lèi)菌 種菌株號(hào)箔氧菌祜草芽孢桿菌(Bacillus suhtUis)CMCC (B) 63 501ATCC 6633金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus )CMCC (B) 26 003ATCC 6538銅綠假單胞菌(Pscudomonas aeruginosa')CMCC (B) 10 104ATCC 9027環(huán)境監(jiān)測(cè)中分離的菌株厭氧菌生抱梭菌(Clostridium sporogenes)CMCC (B) 64 941ATCC 11437 ATCC 18404真菌白色念珠菌（Candida albicans)CMCC (F) 98 0

7、01ATCC 10231黑曲瘡(Aspergillus niger )CMCC (F) 98 003ATCC 16404一旦選定培養(yǎng)基，需確定培養(yǎng)溫度和培養(yǎng)時(shí)間。通常，需氧菌應(yīng)在30培養(yǎng) 48 72小時(shí)。酵母菌和霉菌數(shù)通常在20-ZSt,培養(yǎng)57天。F. 監(jiān)測(cè)方法的確認(rèn)方法確認(rèn)的手段包括以下幾種。進(jìn)行回顧性驗(yàn)證/確認(rèn)，即回顧環(huán)境監(jiān)測(cè)的歷史數(shù)據(jù)，并對(duì)這些監(jiān)測(cè)數(shù)據(jù)的重現(xiàn) 性予以評(píng)價(jià)。參進(jìn)行挑戰(zhàn)性試驗(yàn)，證明監(jiān)測(cè)方法的回收率。該法應(yīng)用廣泛，也可作為回顧性驗(yàn) 證/確認(rèn)的支持性資料。進(jìn)行監(jiān)測(cè)后取樣點(diǎn)的清潔消毒效力測(cè)試。對(duì)接觸碟法和擦拭法，有時(shí)同樣需進(jìn)行方法確認(rèn)。方法是，將從環(huán)境中分離到得代表 性微生物，接

8、種于無(wú)菌的試驗(yàn)表面，接種量不超過(guò)100CFU，然后按常規(guī)方法進(jìn)行取樣及 處理，計(jì)算回收率。用于接種的試驗(yàn)表面通常為方形或圓形薄片，材料多為塑料、玻璃和 不銹鋼類(lèi)，以盡可能模擬實(shí)際監(jiān)測(cè)時(shí)的環(huán)境設(shè)施表面。通?？梢圆蒘引用相關(guān)文獻(xiàn)或技術(shù) 報(bào)告的方法來(lái)證明該取樣方法的適用性。在方法確認(rèn)階段，應(yīng)對(duì)培養(yǎng)基、培養(yǎng)時(shí)間和培養(yǎng)溫度等進(jìn)行評(píng)估，以確定適于環(huán)境中 代表性微生物的最佳培養(yǎng)條件。同時(shí)，應(yīng)確定適用于真菌、厭氧微生物或特定的控制性微 生物（指可能?chē)?yán)重影響環(huán)境的微生物）的選擇性培養(yǎng)基。一旦培養(yǎng)基供應(yīng)商、接觸碟、拭 子或監(jiān)測(cè)方法發(fā)生變更，則需重新確認(rèn)。如果決定變更取樣方法，變更前必須進(jìn)行相應(yīng)的 驗(yàn)證/確認(rèn)性試驗(yàn)

9、，以保證新方法等效或優(yōu)于現(xiàn)行方法。14.3.2 取樣計(jì)劃【背景介紹】環(huán)境監(jiān)測(cè)的取樣計(jì)劃在各生產(chǎn)企業(yè)各不相同，這取決于一些影響因素，包括但不局限 于產(chǎn)品的類(lèi)型、生產(chǎn)過(guò)程、設(shè)施/工藝的設(shè)計(jì)、生產(chǎn)密度、人為干擾、環(huán)境監(jiān)測(cè)歷史數(shù)據(jù) 等。沒(méi)有一個(gè)單獨(dú)的取樣方案適用于所有的監(jiān)測(cè)。環(huán)境監(jiān)測(cè)的頻率及取樣fi,最好能及時(shí) 發(fā)現(xiàn)所有人為干預(yù)、偶發(fā)事件及任何系統(tǒng)的損壞。由無(wú)菌工藝生產(chǎn)的無(wú)菌產(chǎn)品與最終滅菌 處理的無(wú)菌產(chǎn)品相比，前者的環(huán)境監(jiān)測(cè)尤為重要。取樣計(jì)劃應(yīng)隨著取樣頻率的變化而變 化，根據(jù)趨勢(shì)分析對(duì)取樣點(diǎn)數(shù)量做出相應(yīng)的調(diào)整，既可增加，也可減少?！炯夹g(shù)要求】根據(jù)生產(chǎn)環(huán)境對(duì)產(chǎn)品污染風(fēng)險(xiǎn)的高低，確定取樣計(jì)劃。例如，對(duì)無(wú)菌

10、工藝產(chǎn)品的A級(jí) 區(qū)取樣頻率可設(shè)為每批一次；I)級(jí)區(qū)的非關(guān)鍵輔助區(qū)取樣頻率可設(shè)為每季度一次?！緦?shí)例分析】表14-5某公司無(wú)菌藥品不同生產(chǎn)用潔凈環(huán)境的常規(guī)取樣頻率和監(jiān)控項(xiàng)目（僅供參考)監(jiān)控區(qū)（潔凈度級(jí)別監(jiān)控頻率監(jiān)控項(xiàng)目最終滅菌產(chǎn)品 生產(chǎn)區(qū)域稱(chēng)擻配料、配液 (以C級(jí)區(qū)為例）每月一次空氣懸浮粒子 空氣浮游菌 空氣沉降菌 表面微生物灌封間 (以C/A級(jí)區(qū)為例）每周一次空氣懸浮粒子 空氣浮游菌 空氣沉降菌 表面微生物 操作者手套表面微生物軋蓋間、洗塞間 (以C/A級(jí)區(qū)為例）每月一次空氣懸浮粒子 空氣浮游菌 空氣沉降菌 表面微生物 操作者手套表面微生物容器精洗區(qū) (以D級(jí)區(qū)為例）每季度一次空氣懸浮粒子 空氣

11、浮游菌 空氣沉降菌 表面微生物非最終 滅菌產(chǎn)品 生產(chǎn)區(qū)域稱(chēng)傲配料、配液 (以C/A級(jí)區(qū)為例每周一次空氣懸浮粒子 空氣浮游菌 空氣沉降菌 表面微生物無(wú)菌灌封輔助區(qū) (以C級(jí)區(qū)為例）每周一次空氣懸浮粒子 空氣浮游菌 空氣沉降菌 表面微生物無(wú)菌潲封間 (以B/A級(jí)區(qū)為例）每批一次空氣懸浮粒子 空氣浮游菌 空氣沉降菌 表面微生物 操作者手套和操作服表面微生物微生物實(shí)驗(yàn)室無(wú)菌實(shí)驗(yàn)室 (以B/A級(jí)區(qū)為例）每次實(shí)驗(yàn)空氣懸浮粒子 空氣浮游菌 空氣沉降菌 表面微生物 操作者手套和操作服表面微生物限度檢查實(shí)驗(yàn)室(以C/A級(jí)區(qū)為例）每周一次空氣懸浮粒子 空氣浮游菌 空氣沉降菌 表面微生物 操作者手套表面微生物抗生素

12、效價(jià)測(cè)定室 (以D級(jí)區(qū)為例）每月一次空氣懸浮粒子 空氣浮游菌 空氣沉降菌 表面微生物注：（1>每月一次。14.3.4取樣點(diǎn)及取樣量的設(shè)置 【背景介紹】取樣位點(diǎn)的選擇很大程度上取決于潔凈室的設(shè)計(jì)和生產(chǎn)過(guò)程。在選擇取樣點(diǎn)時(shí)，應(yīng)對(duì) 每個(gè)程序仔細(xì)認(rèn)真地加以評(píng)估。取樣的主要的目的是提供有價(jià)值并可用于判斷的數(shù)據(jù)，以 便鑒別/識(shí)別特定程序、設(shè)備、材料和工藝相關(guān)的實(shí)際或潛在的污染。取樣應(yīng)設(shè)在如果取 樣點(diǎn)受到污染，則產(chǎn)品很可能受到污染的那些位置，然而，必須謹(jǐn)慎地確定取樣點(diǎn)的位 置，靠近產(chǎn)品但不要接觸產(chǎn)品?！緦?shí)施指導(dǎo)】常規(guī)監(jiān)測(cè)取樣位點(diǎn)應(yīng)考慮如下因素：在哪些部位的微生物污染，最可能對(duì)產(chǎn)品質(zhì)量造成不良影響？在生

13、產(chǎn)過(guò)程中，什么地點(diǎn)最容易長(zhǎng)菌？取樣點(diǎn)的選擇需要統(tǒng)計(jì)學(xué)設(shè)計(jì)（例如，按照美國(guó)標(biāo)準(zhǔn)209E來(lái)計(jì)算）還是根據(jù)網(wǎng) 格法來(lái)確定？在常規(guī)監(jiān)測(cè)中，有一些點(diǎn)需要周轉(zhuǎn)取樣嗎？哪些地方是清潔、消毒或滅菌時(shí)最難覆蓋/接觸或最難奏效的部位？什么活動(dòng)會(huì)導(dǎo)致污染的擴(kuò)散？參在某一部位的取樣操作，足以導(dǎo)致測(cè)試數(shù)據(jù)的差錯(cuò)或污染產(chǎn)品嗎？取樣只應(yīng)在生 產(chǎn)結(jié)束或換班時(shí)進(jìn)行嗎？為了建立常規(guī)的取樣位點(diǎn)，必須考慮產(chǎn)品與其接觸或暴露的環(huán)境的程度。對(duì)反映產(chǎn)品 的微生物污染水平有代表性的取樣點(diǎn)必須取樣和進(jìn)行環(huán)境監(jiān)測(cè)。與產(chǎn)品接觸的來(lái)源可能包 括壓縮氣體，房間空氣，生產(chǎn)設(shè)備，工具，關(guān)鍵表面，儲(chǔ)存容器，傳送帶，手套，人員以 及水。不與產(chǎn)品直接接觸的來(lái)源

14、可能包括：墻，地，天花板，門(mén)，長(zhǎng)発，椅子，測(cè)試儀器 和緩沖間。但是，最關(guān)鍵點(diǎn)的位置作為取樣點(diǎn)并不一定適用。必須考慮環(huán)境監(jiān)測(cè)是否實(shí)際上會(huì)加 大產(chǎn)品污染風(fēng)險(xiǎn)的概率。此外，如果在生產(chǎn)過(guò)程中污染的概率很低，就不必要對(duì)關(guān)鍵點(diǎn)取 樣（例如，不再需要手工操作的已滅菌部件）。確立一個(gè)合適的取樣點(diǎn)需要考慮很多因素，比如廠(chǎng)方設(shè)施，生產(chǎn)線(xiàn)的設(shè)定，驗(yàn)證數(shù) 據(jù)，生產(chǎn)過(guò)程，歷史數(shù)據(jù)，測(cè)試方法等。潔凈區(qū)（室）監(jiān)測(cè)中的取樣點(diǎn)和取樣量可以比潔凈級(jí)別確認(rèn)時(shí)的取樣點(diǎn)和取樣量少， 應(yīng)該通過(guò)正式的風(fēng)險(xiǎn)分析研究和對(duì)監(jiān)測(cè)結(jié)果的分析（至少要有6個(gè)月以上的運(yùn)行數(shù)據(jù)作為 分析基礎(chǔ)），來(lái)確定監(jiān)測(cè)頻次和限度。同時(shí)，監(jiān)測(cè)頻次和限度的確定也要考慮到生產(chǎn)

15、工藝 因素，監(jiān)測(cè)限度及取樣點(diǎn)應(yīng)該定期進(jìn)行回顧驗(yàn)證，以保證監(jiān)測(cè)行為的有效性。國(guó)標(biāo) GB/T 162922010、GB/T 162932010 和 GB/T 162942010 醫(yī)藥工業(yè)潔凈室 (區(qū)）懸浮粒子、浮游菌和沉降菌的測(cè)試方法中規(guī)定了最少采樣點(diǎn)的數(shù)目。最少采樣點(diǎn)數(shù) 目可在以下兩種方法中任選一種。(1)利用公式計(jì)算N,=A°'S最少采樣點(diǎn)數(shù)(四舍五人為整數(shù)）；-4潔凈室或潔凈區(qū)的面積，m2。注：在單向流悄況下.面積/!可以認(rèn)為fi垂直于氣流方向上的橫截面面積。(2)最少采樣點(diǎn)數(shù)可從表14-6查到。表14-6潔凈區(qū)空氣懸浮粒子、浮游菌及沉降菌的最少取樣點(diǎn)數(shù)面積（m2)潔凈級(jí)別

16、10010000100000<102-322彡 10 <20422>20- <40822多 40 <1001642彡 100- <20040103200- <40080206400- <10001604013彡 1000 <200040010032彡200080020063注：此表摘自GB/T 162922010醫(yī)藥工業(yè)潔凈室（區(qū)）懸浮粒子的測(cè)試方法。環(huán)境取樣在遵循最低取樣點(diǎn)數(shù)的同時(shí)，還須執(zhí)行以下規(guī)則。A. 空氣懸浮粒子參任何潔凈區(qū)內(nèi)取樣點(diǎn)應(yīng)不少于兩個(gè)；除受潔凈區(qū)的設(shè)備限制外，取樣點(diǎn)應(yīng)在整個(gè)潔凈區(qū)均勻布置；在一個(gè)區(qū)域內(nèi)應(yīng)最少取樣五次，每個(gè)取

17、樣點(diǎn)的取樣次數(shù)可多于一次，不同取樣點(diǎn)的 取樣次數(shù)可以不同；為了確定A級(jí)區(qū)的級(jí)別，每個(gè)采樣點(diǎn)的采樣量不得少于丨m3。參取樣點(diǎn)一般布置在距離地面0. 8 1. 5m之間或操作平臺(tái)的高度；參盡量避免在回風(fēng)口附近取樣，而且測(cè)試人員應(yīng)站在取樣口的下風(fēng)側(cè)。B. 空氣浮游菌參除受潔凈區(qū)的設(shè)備限制外，取樣點(diǎn)應(yīng)在整個(gè)潔凈區(qū)均勻布置。在日常監(jiān)控時(shí)，那些與產(chǎn)品相鄰近的區(qū)域，以及可能與產(chǎn)品直接接觸的空氣及設(shè) 備附近均應(yīng)考慮增加取樣點(diǎn)和取樣次數(shù)（與產(chǎn)品非接觸區(qū)相比，這些區(qū)域應(yīng)視為 關(guān)鍵區(qū)h人員活動(dòng)頻繁或人員較集中的區(qū)域也應(yīng)被視為關(guān)鍵區(qū)，需加強(qiáng)監(jiān)控。參取樣點(diǎn)一般布置在距離地面0. 8 1. 5m之間或操作平臺(tái)的高度。取樣

18、時(shí)，取樣設(shè)備會(huì)對(duì)氣流產(chǎn)生干擾，因此，動(dòng)態(tài)測(cè)試空氣浮游菌取樣時(shí)應(yīng)避免 可能對(duì)氣流組織的干擾。參應(yīng)根據(jù)被測(cè)區(qū)域的浮游菌控制限度和取樣方式確定取樣量，每個(gè)點(diǎn)一般采樣一次。盡量避免在回風(fēng)口附近取樣（距離lm以上），且測(cè)試人員應(yīng)站在取樣口的下風(fēng) 側(cè)，并盡量少走動(dòng)。C. 沉降菌測(cè)試取樣點(diǎn)的分布及其取樣位置與空氣浮游菌監(jiān)測(cè)相同；日常監(jiān)控可以根據(jù)風(fēng)險(xiǎn)分析 結(jié)果，沉降菌與浮游菌交替或混合取樣。參沉降時(shí)間至少為半小時(shí)，但不得超過(guò)4小時(shí)。D. 表面微生物測(cè)試表面微生物監(jiān)測(cè)的取樣點(diǎn)數(shù)應(yīng)依下列因素確定：參潔凈區(qū)（室）的大??；設(shè)備、管路等的復(fù)雜程度；參生產(chǎn)活動(dòng)的重要性；參易受污染的部位等。應(yīng)考慮包含以下部位：每扇門(mén)、每個(gè)門(mén)把手、地板（至少兩點(diǎn)）、墻壁（不易被清 潔/消毒的部位，至少兩點(diǎn)）、公用介質(zhì)的管路（不易被清潔/消毒部位）、生產(chǎn)設(shè)備的關(guān) 鍵性部位（如灌裝針、易與人員接觸的塑料簾膜、膠塞筒、傳輸帶）等。根據(jù)潔凈區(qū)內(nèi)設(shè)施、設(shè)備等表面對(duì)產(chǎn)品和潔凈室環(huán)境的影響程度，通常將表面分為三 類(lèi)：關(guān)鍵表面（與產(chǎn)品、容器及密封件直接接觸或暴露于產(chǎn)品、容器及密封件的表面）、 一般表面（如設(shè)備的外表面、墻壁等）和地板，并且分別設(shè)定不同的微生物限度要求。表面微生物的