植物花藥和花粉培養(yǎng)參考PPT

1、12植物單倍體培養(yǎng)方法: 花藥培養(yǎng)、花粉培養(yǎng) 胚珠或子房培養(yǎng)（未受精）3植物花藥/花粉培養(yǎng)歷史guha和maheshwari （1964） 曼陀羅花藥培養(yǎng)nitsch 和 norreel (1973) 煙草花粉培養(yǎng)（游離小孢子培養(yǎng)） chu（1973）小麥花粉培養(yǎng)（早期花藥培養(yǎng)主要依靠小孢子的自然胚胎發(fā)生產(chǎn)生單倍體，能自發(fā)形成胚胎發(fā)生的基因頻率較低，效率極低）80年代后期到90年代期間，花培技術迅速發(fā)展。許多作物小孢子培養(yǎng)已經(jīng)成功。十字花科、麥類、水稻、玉米等。90年代，一些先前被認為是不易進行小孢子培養(yǎng)的基因型也相續(xù)成功konzak (1999) 。4概念：花藥和花粉培養(yǎng)：指在合成培養(yǎng)基上，

2、改變花粉的發(fā)育途徑，使其不形成配子，而像體細胞一樣進行分裂、分化、最終發(fā)育成完整植株。該發(fā)育途徑被稱為“花粉孢子體發(fā)育途徑”或“雄核發(fā)育”。兩者的異同點 培養(yǎng)目的相同，均獲得小孢子植株。 花藥培養(yǎng)屬于器官培養(yǎng)；而花粉培養(yǎng)屬于細胞培養(yǎng)。 花粉培養(yǎng)沒有藥壁組織干擾；可計數(shù)小孢子產(chǎn)胚率；可觀察雄核發(fā)育的全過程；單倍體產(chǎn)量高。但技術更復雜。5花藥或花粉培養(yǎng)的作用：供體植株小孢子（n）花培花粉植株（n）雄核發(fā)育自然加倍人工加倍純合植株dh（2n）一年內獲得純系1、作物育種（1）縮短育種周期：常規(guī)育種需4-6年獲得純系，而小 孢子培養(yǎng)僅需一年。6例子：二倍體供體植株基因型為aabb，若要從后代中選擇基因為

3、aabb的純合單株常規(guī)方法： aabb出現(xiàn)的概率為1/16，并且不能將aabb與aabb、aabb區(qū)分開。abababababaabbaabbaabbaabbabaabbaabbaabbaabbabaabbaabbaabbaabbabaabbaabbaabbaabb7例子：二倍體供體植株基因型為aabb，若要從后代中選擇基因為aabb的純合單株單倍體方法： aabb出現(xiàn)的概率為1/4。 單倍體單倍體 二倍體二倍體ab- - aabbab- aabbab- aabbab- - aabb供體親本aabb花培8 植株不受顯隱性的影響，在誘變育種中能在當代及時獲得突變個體，加倍后成為穩(wěn)定的純系。92、

4、物種進化研究 可探索親本染色體組的構成。分析單倍體植物減數(shù)分裂時，形成二價體的數(shù)目和形狀，能確定染色體組內是否存在同源染色體。 3、遺傳分析 單倍體植株中基因不受顯隱性的影響，每一個基因的作用均能表現(xiàn)出來。能用來研究基因的性質及其作用。還可用于基因的劑量效應分析。4、構建連鎖圖譜 雙單倍體（dh）群體是永久性群體，能有效地用于遺傳圖譜的構建5、用于遺傳轉化 能直接表達外源基因，不受顯隱性影響10花粉孢子體發(fā)育途徑（雄核發(fā)育）11一、花粉發(fā)育的階段花粉離體培養(yǎng)時，雄核發(fā)育最適宜的時期一般是第一次有分裂或之前。12二、雄核發(fā)育途徑1、a途徑 小孢子第一次有絲分裂為均等分裂，形成營養(yǎng)細胞和生殖細胞

5、（1）a-v途徑 由營養(yǎng)細胞重復分裂形成單倍體 （2）a-g途徑 由生殖細胞重復分裂形成單倍體 （3）a-vg途徑（e途徑） 由營養(yǎng)細胞和生殖細胞各自獨立分裂，共同形成單倍體 （4）c途徑 營養(yǎng)細胞和生殖細胞通過核融合，形成多倍體植株2、b途徑 小孢子第一次有絲分裂為均等分裂，形成大小相近的兩個細胞。然后由這兩細胞邊續(xù)分裂形成單倍體植株，或者核融合形成多倍體植株13141、雄核發(fā)育與p花粉的形成p-花粉：具胚胎發(fā)生潛能的花粉。也稱小花粉（s-花粉）或不染色花粉（ns-花粉）2、雄核發(fā)育與饑餓處理饑餓處理改變了小孢子的配子體發(fā)育方向，啟動雄核發(fā)育。三、雄核發(fā)育啟動機理151、胚狀體發(fā)育途徑 小孢

6、子經(jīng)歷胚發(fā)生的各個階段，最后子葉展開，形成花粉植株。2、愈傷組織發(fā)育途徑 小孢子分裂數(shù)次形成愈傷，再分化形成花粉植株。此途徑產(chǎn)生的植株會出現(xiàn)變異且倍性復雜。四、花粉植株形態(tài)發(fā)生方式16胚狀體發(fā)育途徑部分花藥通過胚狀體途徑形成小植株煙草花藥培養(yǎng)17通過胚狀體途徑再生形成小植株煙草花藥培養(yǎng)18胚狀體發(fā)育途徑a) 球形胚 d) 魚雷形胚蕓苔屬小孢子培養(yǎng)19愈傷組織發(fā)育途徑部分花藥產(chǎn)生愈傷組織接種在平板上的水稻花藥水稻花藥培養(yǎng)20愈傷組織轉接種到再生培養(yǎng)基愈傷組織分化形成再生植株水稻花藥培養(yǎng)21花藥和花粉培養(yǎng)方法22一、花藥培養(yǎng) 1、取材 鏡檢，根據(jù)花粉的發(fā)育時期，選取大小適宜的花蕾。 2、消毒 70

7、酒精擦洗花蕾表面，或70酒精浸泡30-60s后在1次氯酸鈉溶液中浸泡10-20min或在0.1的氯化汞溶液中消毒3-10min，無菌水沖洗3-5次。 3、培養(yǎng) 固體或液體培養(yǎng)基均可。先進行脫分化培養(yǎng)，至小孢子大量分裂形成胚或愈傷，并突破花藥壁表面，形成突出物（2-3周）；后轉入分化培養(yǎng)基培養(yǎng)，形成小植株。23二、花粉培養(yǎng)(一)花粉的分離與純化 1、自然散落法(漂浮培養(yǎng)散落小孢子收集法) 將花藥接種在預處理液或液體培養(yǎng)基上，待花粉自動散落后，收集培養(yǎng)。2、擠壓法 在燒杯或研缽中擠壓花藥，將花粉擠出后收集培養(yǎng)。3、機械游離 （1）磁攪拌法 用磁力攪拌器攪拌培養(yǎng)液中的花藥，使花粉游離出來；（2）超速

8、旋切法 通過攪拌器中的高速旋轉刀具破碎花蕾、穗子、花藥，使小孢子游離出來（此法應用最廣）。4、小孢子純化 對上述方法獲得的小孢子混合物進行分級過篩、梯度離心處理純化小孢子24梯度離心前（小孢子形態(tài)、活力不一致）30%蔗糖梯度離心后（獲得均一的小孢子群體）25(二)花粉培養(yǎng)方式 1、平板培養(yǎng) 花粉置瓊脂固化培養(yǎng)基上培養(yǎng)。2、液體培養(yǎng) 花粉懸浮在液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)，需震蕩，以利通氣。3、雙層培養(yǎng) 花粉置固體-液體雙層培養(yǎng)基上培養(yǎng)。培養(yǎng)基制作方法：先鋪一層瓊脂固體培養(yǎng)基，凝固后，在表面加入少量液體培養(yǎng)基。 4、看護培養(yǎng) 利用花藥或花藥愈傷組織釋放出的活性物質促進花粉小孢子發(fā)育。5、微室培養(yǎng) 利用小的蓋

9、玻片和凹穴載玻片形成微室進行花粉培養(yǎng)6、條件培養(yǎng)基培養(yǎng) 利用培養(yǎng)過花藥的液體培養(yǎng)基或含失活花藥提取物的培養(yǎng)基上培養(yǎng)。花藥條件培養(yǎng)基、子房條件培養(yǎng)等。26看護培養(yǎng)圖解27三、白化苗現(xiàn)象28（一）白化苗產(chǎn)生的影響因素及機理1、內因 供體植株基因型（如秈稻比粳稻白苗率高）、花粉發(fā)育時期。2、外因 預處理、培養(yǎng)基成分、激素水平與種類、培養(yǎng)條件和方法、愈傷組織轉分化時間等。3、機理 核基因起關鍵作用，導致質體dna缺失，產(chǎn)生白苗。另外地、無性系變異也可能是原因之一。（二）白化苗的控制 通過對花粉發(fā)育時期、預處理、培養(yǎng)基成分等因素進行調控。29四、影響雄核發(fā)育和花粉花藥培養(yǎng)的因素（一）基因型 植物基因型是

10、影響雄核發(fā)育的最重要的因素之一。同一物種中的不同基因型對小孢子離體誘導反應差異較大。 如在水稻中，秈稻花粉培養(yǎng)力遠低于糯稻。30蕓苔屬植物brassica napusbrassica napus不同基因型的小孢子產(chǎn)胚率比較topas 10,000-200,000 1-20westar 1000-10,000 0.1-1delta 100-10,000 0.01-1bounty 10-100 0.001-0.01基因型胚狀體數(shù)量/106小孢子 成苗率（%）31（二）供體植株生長條件和生理狀態(tài)1、植株生長條件 光溫等因素均能影響花藥培養(yǎng)力。一般 處于適宜生長條件（如溫室中）較好。但物種間存在差異。

11、2、植株生長時期 一般是開花始期優(yōu)于開花末期。3、p花粉的頻率 不同溫度、日照時數(shù)、氮饑餓及生長物質處 理提高p花粉的數(shù)量 32（三）花粉發(fā)育時期小孢子發(fā)育時期對誘導雄核發(fā)育非常重要。33四分體四分體: 醋酸洋紅染色醋酸洋紅染色四分體四分體: alexanders 染色染色單核期單核期雙核期雙核期成熟花粉粒成熟花粉粒處于不同發(fā)育時期的煙草小孢子34單核晚期單核晚期液泡液泡第一次有絲分裂后期第一次有絲分裂后期雙核早期雙核早期雙核中期雙核中期生殖核生殖核生殖核生殖核營養(yǎng)核營養(yǎng)核35一般而言，單核期（第一次有絲分裂前）對誘導反應最敏感，為最佳培養(yǎng)期。形成雙核后，在合適的條件，主要由營養(yǎng)細胞分裂產(chǎn)生胚

12、狀體。 36不同物種誘導胚胎發(fā)生的最佳小孢子發(fā)育時期發(fā)育時期物種減數(shù)分裂期草莓、番茄四分孢子期葡萄單核早中期石刁柏、油菜、大麥、天仙子、馬鈴薯單核晚期荔枝、茄子、青椒、小麥單核早期至晚期煙草單核早期至雙核期梨、水稻、甘藍四分孢子期至雙核期玉米37對不同發(fā)育階段的花藥進行對不同發(fā)育階段的花藥進行培養(yǎng)測試培養(yǎng)測試確定最佳小孢子發(fā)育時期的確定最佳小孢子發(fā)育時期的形態(tài)特征形態(tài)特征注意形態(tài)特征會因品種、發(fā)注意形態(tài)特征會因品種、發(fā)育狀態(tài)、環(huán)境條件的變化而育狀態(tài)、環(huán)境條件的變化而發(fā)生變化發(fā)生變化處于不同發(fā)育階段的煙草花芽處于不同發(fā)育階段的煙草花芽 花粉發(fā)育時期的確定38（四）預處理 預處理是小孢子培養(yǎng)成功的

13、前提條件 預處理目的：是改變小孢子的發(fā)育方向，使盡可能多的小孢子從配子體發(fā)育途徑轉向孢子體發(fā)育途徑（即成為具胚胎發(fā)生潛力的小孢子）。適當?shù)念A處理能使綠苗產(chǎn)量大量增加。 預處理方法：主要是對花藥進行適度的逆境處理，包括低溫、高溫、化學物質、離心、射線等。 391、高低溫處理低溫預處理：指在接種之前將材料用0以上低溫處理一段時間后再接種。應用較多。處理溫度一般在1-14，時間從幾小時至幾十天不等。不同作物所用的預處理溫度及時間差異較大。不同的處理溫度需要不同的時間。 例子:小麥穗子培養(yǎng)前4預處理幾天，花藥培養(yǎng)效率顯著提高。 十字花科未經(jīng)低溫預處理的花蕾，每花藥產(chǎn)胚數(shù)為4.39個，6-9處理1天，產(chǎn)

14、胚數(shù)提高到61.4個，預處理4天后，胚狀體產(chǎn)量降為10.47個。預處理方法：40 高溫處理（熱擊處理）：指花藥接種后，先在較高溫度下（30-35）培養(yǎng)數(shù)天，然后再移至正常溫度下繼續(xù)培養(yǎng)。 例子:如煙草，32高溫；小麥，33高溫預處理顯著地提高了小孢子胚胎發(fā)生能力（touraev，1996）412、化學物質處理 包括高糖、甘露醇、秋水仙素、乙烯利等進行處理。甘露醇僅能維持滲透壓，不能提供碳源，其主要原理是造成小孢子營養(yǎng)饑餓，從而使小孢子去分化。 3、其它 包括射線、離心、磁場等。 42（五）培養(yǎng)基 1.基本培養(yǎng)基 主要為n6和ms培養(yǎng)基。在此基礎上發(fā)展出一些其它的培養(yǎng)基。如h培養(yǎng)基（適于煙草）、

15、c17培養(yǎng)基（適于小麥）、馬鈴署-培養(yǎng)基（適于馬鈴署） 432.碳源 包括蔗糖、麥芽糖、纖維二糖、葡萄糖、果糖、海藻糖等。不同作物所需最適的碳源種類及濃度的所差異。一般認為單子葉植物比雙子葉植物需糖的濃度要高。玉米中蔗糖效果最好；而麥類作物中，麥芽糖似乎為最好的碳源。443、激素4、氨基酸5、活性碳6、ph 45（六）培養(yǎng)條件 1、溫度 物種間有差異2、光照 3、植板密度 植板密度與花培效率有很大的相關性。5103到2104ml密度均能有效培養(yǎng)。一般來說，足夠數(shù)量的、但相對低密度的小孢子濃度有利于小孢子競爭營養(yǎng)、氧氣、細胞分裂的空間，從則有利于胚狀體發(fā)生。46（七）花藥壁因素 花藥組織的存在對

16、小孢子的胚性分裂具有明顯的促進作用。但花藥壁損傷會釋放有毒物質影響小雄核的發(fā)育。47單倍體植株鑒定和染色體加倍48一、倍性鑒定 （為什么要進行倍性鑒定？）1、染色體直接計數(shù)法 通常取根尖、莖尖等分生組織區(qū)進行制片，直接計數(shù)染色體數(shù)目。2、間接鑒定（1）掃描細胞光度儀鑒定（流式細胞儀） 主要測定葉片單個細胞中dna的含量確定細胞的倍性，材料的使用量可少到1cm2。（2）細胞形態(tài)學鑒定法 葉片保衛(wèi)細胞大小、單位面積上的氣孔數(shù)及保衛(wèi)細胞中葉綠體的大小和數(shù)目與倍性具有高度的相關性。（3）植株形態(tài)學鑒定法 單倍體植株瘦弱，葉片窄小，花小柱頭長，花粉粒小，不結實。49（4）雜交鑒定法自交或測交鑒定，看后代

17、分離情況確定二倍體植株是來自小孢子還是體細胞。（5）分子標記鑒定包括生化標記（如同工酶標記）和分子標記（如rflp、rapd、aflp等）50二、染色體加倍 （為什么要進行加倍？）（一）莖段培養(yǎng)將單倍體植株的莖段進行培養(yǎng)，誘導愈傷組織形成。由于單倍體愈傷組織在培養(yǎng)過程中會有一定頻率的核內有絲分裂，從而形成二倍體細胞，分化出純合的二倍體植株。51二、染色體加倍 （為什么要進行加倍？）（二）化學試劑誘變有秋水仙素、oryzalin、trifluralin、apm等。1、秋水仙素誘導（1）浸泡法無菌條件下以一定濃度的秋水仙素浸泡再生小植株，再轉移至新鮮培養(yǎng)基中培養(yǎng)。（2）生長錐處理 秋水仙素水溶液直接涂抹生長點（頂芽或腋芽）。（3）培養(yǎng)基處理 將單倍體植株和任何一部分作為外植體，種植在附加一定濃度和秋水仙素的培養(yǎng)基中培養(yǎng)一段時間后，轉入無秋水仙素的相同培養(yǎng)基中繼續(xù)培養(yǎng)誘導胚狀體。2、除草劑誘導 （毒性小，引起植株的變異幾率小）52花藥和花粉培養(yǎng)基本流程：預處理花藥（物理或生理逆境）收集具胚性小孢子的花藥，或離心收集胚性小孢子培養(yǎng)（充足的營養(yǎng)、合適的溫光、或條件培