實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)與應(yīng)用

1、北京元業(yè)伯樂科技發(fā)展有限公司北京元業(yè)伯樂科技發(fā)展有限公司提綱提綱 pcr pcr簡(jiǎn)介簡(jiǎn)介 熒光定量熒光定量pcrpcr技術(shù)原理技術(shù)原理 熒光化學(xué)物質(zhì)簡(jiǎn)介熒光化學(xué)物質(zhì)簡(jiǎn)介 多重多重pcrpcr與內(nèi)參照基因與內(nèi)參照基因 定量方法定量方法 定量定量pcrpcr技術(shù)延伸技術(shù)延伸 基因分型（基因分型（snpsnp）檢測(cè)）檢測(cè) 熔解曲線分析熔解曲線分析實(shí)時(shí)熒光定量實(shí)時(shí)熒光定量pcrpcr技術(shù)簡(jiǎn)介：技術(shù)簡(jiǎn)介：pcrpcr概念概念什么是什么是pcrpcr？polymerase chain reaction (polymerase chain reaction (pcr)pcr)聚合酶鏈反應(yīng)是在體聚合酶鏈反應(yīng)是

2、在體外選擇性的擴(kuò)增特定外選擇性的擴(kuò)增特定dnadna片段的方法。片段的方法。pcr pcr 循環(huán)循環(huán)第一步第一步 加熱變性、雙鏈打開加熱變性、雙鏈打開第二步第二步退火、引物與單鏈結(jié)合退火、引物與單鏈結(jié)合第三步第三步 - - 引物延伸引物延伸變?yōu)閮蓚€(gè)雙鏈變?yōu)閮蓚€(gè)雙鏈dnadna常規(guī)常規(guī)pcrpcr常規(guī)常規(guī)pcrpcr技術(shù)：技術(shù)：理論上理論上pcrpcr產(chǎn)物的積累是按照產(chǎn)物的積累是按照2 2n n指數(shù)擴(kuò)增指數(shù)擴(kuò)增pcr后借助電泳對(duì)擴(kuò)增反應(yīng)的后借助電泳對(duì)擴(kuò)增反應(yīng)的終產(chǎn)物終產(chǎn)物進(jìn)行定量及進(jìn)行定量及定性定性分析分析dna engines1 s2 m常規(guī)常規(guī)pcrpcr常規(guī)常規(guī)電泳分析方法的局限性電泳分析

3、方法的局限性 只能對(duì)終產(chǎn)物進(jìn)行分析，無(wú)法對(duì)起始模板只能對(duì)終產(chǎn)物進(jìn)行分析，無(wú)法對(duì)起始模板準(zhǔn)確定量準(zhǔn)確定量對(duì)終產(chǎn)物分析，受對(duì)終產(chǎn)物分析，受pcr過(guò)程平臺(tái)效應(yīng)的干過(guò)程平臺(tái)效應(yīng)的干擾，定量準(zhǔn)確度難以提高（相對(duì)誤差擾，定量準(zhǔn)確度難以提高（相對(duì)誤差1000%）存在擴(kuò)增產(chǎn)物的污染問(wèn)題。）存在擴(kuò)增產(chǎn)物的污染問(wèn)題。必須在擴(kuò)增反應(yīng)結(jié)束后借助電泳方法分析，必須在擴(kuò)增反應(yīng)結(jié)束后借助電泳方法分析，費(fèi)時(shí)費(fèi)事而且費(fèi)時(shí)費(fèi)事而且ebeb有毒有毒無(wú)法對(duì)擴(kuò)增反應(yīng)實(shí)時(shí)檢測(cè)無(wú)法對(duì)擴(kuò)增反應(yīng)實(shí)時(shí)檢測(cè)提綱提綱 pcr pcr簡(jiǎn)介簡(jiǎn)介 熒光定量熒光定量pcrpcr技術(shù)原理技術(shù)原理 熒光化學(xué)物質(zhì)簡(jiǎn)介熒光化學(xué)物質(zhì)簡(jiǎn)介 多重多重pcrpcr與內(nèi)參照

4、基因與內(nèi)參照基因 定量方法定量方法 定量定量pcrpcr技術(shù)延伸技術(shù)延伸 基因分型（基因分型（snpsnp）檢測(cè)）檢測(cè) 熔解曲線分析熔解曲線分析實(shí)時(shí)熒光定量實(shí)時(shí)熒光定量pcrpcr技術(shù)簡(jiǎn)介：技術(shù)簡(jiǎn)介：定量定量pcrpcr定量定量pcrpcr技術(shù)：技術(shù)：利用利用熒光信號(hào)的變化實(shí)時(shí)檢測(cè)熒光信號(hào)的變化實(shí)時(shí)檢測(cè)pcrpcr擴(kuò)增反應(yīng)中擴(kuò)增反應(yīng)中每一每一個(gè)循環(huán)擴(kuò)增產(chǎn)物量的變化個(gè)循環(huán)擴(kuò)增產(chǎn)物量的變化，通過(guò)，通過(guò)ctct值值和標(biāo)準(zhǔn)曲線實(shí)和標(biāo)準(zhǔn)曲線實(shí)現(xiàn)對(duì)現(xiàn)對(duì)起始模板起始模板的的定量分析定量分析iq5 real-time pcr儀定量定量pcrpcr 實(shí)時(shí)熒光定量實(shí)時(shí)熒光定量pcrpcr三個(gè)關(guān)鍵詞：三個(gè)關(guān)鍵詞：

5、實(shí)時(shí)，熒光，定量實(shí)時(shí)，熒光，定量 如何如何實(shí)時(shí)實(shí)時(shí)檢測(cè)？檢測(cè)？ 借助借助熒光熒光物質(zhì)示蹤擴(kuò)增產(chǎn)物量的變化物質(zhì)示蹤擴(kuò)增產(chǎn)物量的變化pcrpcr反應(yīng)混合物反應(yīng)混合物mg2+mn2+dctpdgtpdttpdatptaq dna多聚酶多聚酶引物引物模板模板dna或或緩沖液緩沖液熒光物質(zhì)熒光物質(zhì)熒光曲線熒光曲線 隨著隨著pcrpcr反應(yīng)的進(jìn)行，擴(kuò)增產(chǎn)物不斷累積，熒光信號(hào)反應(yīng)的進(jìn)行，擴(kuò)增產(chǎn)物不斷累積，熒光信號(hào)強(qiáng)度不斷增加。每經(jīng)過(guò)一個(gè)循環(huán)，收集一次熒光強(qiáng)度強(qiáng)度不斷增加。每經(jīng)過(guò)一個(gè)循環(huán)，收集一次熒光強(qiáng)度信號(hào)，得到一條熒光擴(kuò)增曲線圖信號(hào)，得到一條熒光擴(kuò)增曲線圖定量原理定量原理 如何對(duì)起始模板如何對(duì)起始模板定量

6、定量？ 通過(guò)通過(guò)ctct值值和和標(biāo)準(zhǔn)曲線標(biāo)準(zhǔn)曲線實(shí)現(xiàn)對(duì)實(shí)現(xiàn)對(duì)起始模板起始模板的的定量分析定量分析 引入兩個(gè)概念：引入兩個(gè)概念： 熒光閾值、熒光閾值、ctct值值定量原理定量原理熒光閾值熒光閾值在熒光擴(kuò)增曲線指數(shù)增長(zhǎng)期設(shè)定一個(gè)熒光強(qiáng)度在熒光擴(kuò)增曲線指數(shù)增長(zhǎng)期設(shè)定一個(gè)熒光強(qiáng)度標(biāo)準(zhǔn)標(biāo)準(zhǔn)( (即即pcrpcr擴(kuò)增產(chǎn)物量的標(biāo)準(zhǔn)擴(kuò)增產(chǎn)物量的標(biāo)準(zhǔn)) )閾值線閾值線ctct值的概念值的概念定量原理定量原理ctct值的定義是值的定義是pcrpcr擴(kuò)增過(guò)程中，擴(kuò)增產(chǎn)物擴(kuò)增過(guò)程中，擴(kuò)增產(chǎn)物( (熒光熒光信號(hào)）到達(dá)閾值時(shí)所經(jīng)過(guò)的擴(kuò)增循環(huán)次數(shù)信號(hào)）到達(dá)閾值時(shí)所經(jīng)過(guò)的擴(kuò)增循環(huán)次數(shù)c(t) 值值c(t) 值值18.12 +

7、/ 0.04-閾值線閾值線模板起始濃度越高，ct值越小定量原理定量原理ctct值與值與模板起始濃度模板起始濃度的關(guān)系的關(guān)系哪個(gè)樣品濃度高？哪個(gè)樣品濃度高？為什么要用為什么要用ctct值定量值定量實(shí)時(shí)熒光定量實(shí)時(shí)熒光定量pcrpcr方法利用方法利用ctct的概念，在指數(shù)擴(kuò)的概念，在指數(shù)擴(kuò)增的開始階段進(jìn)行檢測(cè)，此時(shí)樣品間的細(xì)小誤差增的開始階段進(jìn)行檢測(cè)，此時(shí)樣品間的細(xì)小誤差尚未放大，因此該尚未放大，因此該ctct值具有值具有極好的重復(fù)性極好的重復(fù)性。 ctct值的重現(xiàn)性值的重現(xiàn)性終點(diǎn)處檢測(cè)產(chǎn)物量不恒定；終點(diǎn)處檢測(cè)產(chǎn)物量不恒定；ctct值則極具重現(xiàn)性值則極具重現(xiàn)性 ctct值的重現(xiàn)性值的重現(xiàn)性相同模板

8、在同一臺(tái)相同模板在同一臺(tái)pcrpcr儀上相同條件下儀上相同條件下重復(fù)重復(fù)9696次擴(kuò)增的擴(kuò)增曲線圖次擴(kuò)增的擴(kuò)增曲線圖閾值選擇閾值選擇閾值的選擇閾值的選擇熒光閾值是在熒光擴(kuò)增曲線上人為設(shè)定的熒光閾值是在熒光擴(kuò)增曲線上人為設(shè)定的一個(gè)值，它可以設(shè)定在指數(shù)擴(kuò)增階段任意位一個(gè)值，它可以設(shè)定在指數(shù)擴(kuò)增階段任意位置上置上缺省設(shè)置一般是缺省設(shè)置一般是3-153-15個(gè)循環(huán)的熒光信號(hào)的標(biāo)個(gè)循環(huán)的熒光信號(hào)的標(biāo)準(zhǔn)偏差的準(zhǔn)偏差的1010倍。倍。但實(shí)際應(yīng)用時(shí)要結(jié)合擴(kuò)增效率、線形回歸但實(shí)際應(yīng)用時(shí)要結(jié)合擴(kuò)增效率、線形回歸系數(shù)等參數(shù)來(lái)綜合考慮系數(shù)等參數(shù)來(lái)綜合考慮 定量原理定量原理 理想的理想的pcrpcr反應(yīng)：反應(yīng)： x=x

9、x=x0 0* *2 2n n 非理想的非理想的pcrpcr反應(yīng)：反應(yīng)： x=xx=x0 0(1+ex)(1+ex)n n n n：擴(kuò)增反應(yīng)的循環(huán)次數(shù)：擴(kuò)增反應(yīng)的循環(huán)次數(shù) x x：第：第n n次循環(huán)后的產(chǎn)物量次循環(huán)后的產(chǎn)物量 x x0 0：初始模板量：初始模板量 exex：擴(kuò)增效率：擴(kuò)增效率在擴(kuò)增產(chǎn)物達(dá)到閾值線時(shí):xct=x0(1+ex)ct =n (1)xct:熒光擴(kuò)增信號(hào)達(dá)到閾值強(qiáng)度時(shí)擴(kuò)增產(chǎn)物的量. 在閾值線設(shè)定以后,它是一個(gè)常數(shù),我們?cè)O(shè)為n.方程式(1)兩邊同時(shí)取對(duì)數(shù)得:logn=logx0 (1+ex)ct (2)整理方程式(2)得:logxlogx0 0= -log(1+ex)= -

10、log(1+ex)* *ct+logct+log n n (3) (3) ct= -1/log(1+ex)ct= -1/log(1+ex)* *logx0+log n/log(1+ex) logx0+log n/log(1+ex) (4)(4)loglog濃度與循環(huán)數(shù)呈線性關(guān)系，根據(jù)樣品擴(kuò)增達(dá)濃度與循環(huán)數(shù)呈線性關(guān)系，根據(jù)樣品擴(kuò)增達(dá)到域值的循環(huán)數(shù)就可計(jì)算出樣品中所含的模板量到域值的循環(huán)數(shù)就可計(jì)算出樣品中所含的模板量定量原理定量原理l初始模板的初始模板的對(duì)數(shù)值對(duì)數(shù)值與與循環(huán)數(shù)循環(huán)數(shù)（ctct值值) )呈線性呈線性關(guān)系關(guān)系l初始模板量越多初始模板量越多, , 擴(kuò)增擴(kuò)增產(chǎn)物達(dá)到某一值（域產(chǎn)物達(dá)到某一值

11、（域值）時(shí)所需要的循環(huán)值）時(shí)所需要的循環(huán)數(shù)越少數(shù)越少確定初始模板的濃度確定初始模板的濃度定量原理定量原理absolute（絕對(duì)定量）（絕對(duì)定量）determines input quantity of a nucleic acid targetrequires a standard curve relative（相對(duì)定量）（相對(duì)定量）determines fold differences in input target nucleic acid quantities between samplesperformed with or without a standard curvetypical

12、ly used for gene expression analysis with a target gene normalized to a reference gene14500 copies定量方法定量方法 定量原理：利用已知起始拷貝數(shù)的標(biāo)準(zhǔn)樣品作出標(biāo)準(zhǔn)曲線,通過(guò)未知樣品的ct值,從標(biāo)準(zhǔn)曲線上計(jì)算出該樣品的起始濃度。 絕對(duì)定量絕對(duì)定量熒光強(qiáng)度熒光強(qiáng)度-循環(huán)數(shù)曲線循環(huán)數(shù)曲線初始模板量對(duì)數(shù)初始模板量對(duì)數(shù)-c(t)循環(huán)數(shù)標(biāo)準(zhǔn)曲線循環(huán)數(shù)標(biāo)準(zhǔn)曲線.未知未知10410310610510210 首先確定未知樣品的首先確定未知樣品的 c(t)c(t)值值 借助標(biāo)準(zhǔn)曲線由未知樣品的借助標(biāo)準(zhǔn)曲線由未知樣品的

13、c(tc(t) )值反推出其初始量值反推出其初始量 得到未知樣品初始量絕對(duì)值得到未知樣品初始量絕對(duì)值unknown104103unknown contains 3108 copies絕對(duì)定量絕對(duì)定量livak comparative ct method (2-ddct) for relative quantification1. normalize c(t): c(t) = c(t)target - c(t)hskg2. calculate c(t)average: c(t)ave = average c(t) of replicates 3. normalize to calibrator:

14、 c(t) = c(t)sample ave - c(t)calibrator ave(for calibrator, c(t) = 0)4. fold difference:f=2-c(t) = normalized fold difference (for calibrator, 2-c(t) = 1)note, this formula can be modified to account for reaction efficiencies (dr. m. pfaffl) and multiple reference genes (dr. j. vondosomple).相對(duì)定量相對(duì)定量

15、非標(biāo)準(zhǔn)曲線法非標(biāo)準(zhǔn)曲線法 quantities interpolated from standard curves are used to measure fold differences in target nucleic acidat least 2 concurrent standard curves are usedone for gene(s) of interestat least one for reference genestandard curves account for reaction efficiencies 使用標(biāo)準(zhǔn)曲線法進(jìn)行相對(duì)定量分析使用標(biāo)準(zhǔn)曲線法進(jìn)行相對(duì)定量分

16、析相對(duì)定量相對(duì)定量標(biāo)準(zhǔn)曲線法標(biāo)準(zhǔn)曲線法 與傳統(tǒng)與傳統(tǒng)pcrpcr的比較的比較 實(shí)現(xiàn)了初始模板的絕對(duì)定量實(shí)現(xiàn)了初始模板的絕對(duì)定量 檢測(cè)靈敏度高檢測(cè)靈敏度高 可以檢測(cè)到低拷貝的目的基因可以檢測(cè)到低拷貝的目的基因 可以區(qū)分微小的拷貝數(shù)差異可以區(qū)分微小的拷貝數(shù)差異 可以對(duì)初始模板含量差異較大的樣品同時(shí)定可以對(duì)初始模板含量差異較大的樣品同時(shí)定量量 省時(shí)省力省時(shí)省力 檢測(cè)設(shè)計(jì)靈活檢測(cè)設(shè)計(jì)靈活提綱提綱 pcr pcr簡(jiǎn)介簡(jiǎn)介 熒光定量熒光定量pcrpcr技術(shù)原理技術(shù)原理 熒光化學(xué)物質(zhì)簡(jiǎn)介熒光化學(xué)物質(zhì)簡(jiǎn)介 多重多重pcrpcr與內(nèi)參照基因與內(nèi)參照基因 定量方法定量方法 定量定量pcrpcr技術(shù)延伸技術(shù)延伸 基

17、因分型（基因分型（snpsnp）檢測(cè)）檢測(cè) 熔解曲線分析熔解曲線分析實(shí)時(shí)熒光定量實(shí)時(shí)熒光定量pcrpcr技術(shù)簡(jiǎn)介：技術(shù)簡(jiǎn)介：sybr green 1 molecular beacons taqman熒光化學(xué)熒光化學(xué)sybr green isybr green isybr green i sybr green i 工作原理工作原理l sybr green 1sybr green 1 結(jié)合結(jié)合到雙鏈到雙鏈dnadna的小溝部位的小溝部位l sybr green 1 sybr green 1 染料只有和雙鏈染料只有和雙鏈dnadna結(jié)合后結(jié)合后才發(fā)熒光才發(fā)熒光gtttggcccccccaaaggga

18、cttgatagcatcgtaasybr green i sybr green i 工作原理工作原理extension53535353extension continuedapply excitationwavelength535355taqtaq353taqtaq55repeatbdbdbdbdbdbdbdbdbdbdlllllsybr green i sybr green i 工作原理工作原理sybr green i sybr green i 優(yōu)點(diǎn)優(yōu)點(diǎn)l 使用方便使用方便 - - 不必設(shè)計(jì)復(fù)雜的不必設(shè)計(jì)復(fù)雜的熒光探針熒光探針 l 沒有序列特異性沒有序列特異性 - - 可以用于不同的模板可以

19、用于不同的模板 l 便宜便宜 l 靈敏靈敏sybr green i sybr green i 缺點(diǎn)缺點(diǎn)l與非特異性產(chǎn)物結(jié)合與非特異性產(chǎn)物結(jié)合l無(wú)法實(shí)現(xiàn)多個(gè)目的基因的檢測(cè)無(wú)法實(shí)現(xiàn)多個(gè)目的基因的檢測(cè)關(guān)于關(guān)于sybr green isybr green i一種一種最基礎(chǔ)最基礎(chǔ)的實(shí)驗(yàn)手段的實(shí)驗(yàn)手段評(píng)價(jià)引物特異性：評(píng)價(jià)引物特異性： 使用熔點(diǎn)曲線分析（使用熔點(diǎn)曲線分析（ melt curve analysismelt curve analysis） 評(píng)價(jià)引物對(duì)擴(kuò)增效率：評(píng)價(jià)引物對(duì)擴(kuò)增效率： 將模板進(jìn)行梯度稀釋將模板進(jìn)行梯度稀釋研究最適反應(yīng)條件：研究最適反應(yīng)條件： 使用梯度功能進(jìn)一步優(yōu)化實(shí)驗(yàn)條件使用梯度功能

20、進(jìn)一步優(yōu)化實(shí)驗(yàn)條件molecular beaconsmolecular beacons發(fā)夾型雜交探針發(fā)夾型雜交探針molecular beaconsmolecular beacons原理：熒光原理：熒光偏偏振能量傳遞（振能量傳遞（fretfret） 莖由互補(bǔ)配對(duì)的序列組成莖由互補(bǔ)配對(duì)的序列組成環(huán)與目標(biāo)序列完全配對(duì)環(huán)與目標(biāo)序列完全配對(duì)莖莖熒光素?zé)晒馑卮銣鐒┐銣鐒┉h(huán)環(huán)變性變性: : 產(chǎn)生產(chǎn)生非特異性的熒光非特異性的熒光taccgggggttacgaacggtaattaccgggggttacgaacggtaatmolecular beaconsmolecular beaconstarget-loop

21、 interaction more stable than stem-stemtaccgggggttacgaacg gtaatttttgcccccaaaaqrtarget 退火時(shí)退火時(shí): :探針與靶序列結(jié)合探針與靶序列結(jié)合熒光素與淬滅劑分離熒光素與淬滅劑分離發(fā)出熒光（靶序列特異的）發(fā)出熒光（靶序列特異的）molecularmolecular beaconsbeacons延伸延伸: : 沒有熒光沒有熒光molecular beacons snpmolecular beacons snpmolecular beacons molecular beacons 實(shí)驗(yàn)結(jié)果實(shí)驗(yàn)結(jié)果molecular be

22、acons molecular beacons 優(yōu)點(diǎn)優(yōu)點(diǎn)l 對(duì)目標(biāo)序列有很高的特異性對(duì)目標(biāo)序列有很高的特異性 用于用于snpsnp檢測(cè)的最靈敏的試劑之一檢測(cè)的最靈敏的試劑之一l 可以實(shí)現(xiàn)多通道檢測(cè)可以實(shí)現(xiàn)多通道檢測(cè)l 熒光背景低熒光背景低molecular beaconsmolecular beacons缺點(diǎn)缺點(diǎn)l 設(shè)計(jì)困難設(shè)計(jì)困難l 只能用于一個(gè)特定的目標(biāo)只能用于一個(gè)特定的目標(biāo)l 價(jià)格較高價(jià)格較高 taqmantaqman探針探針熒光素?zé)晒馑卮銣鐒┐銣鐒┧庑碗s交探針?biāo)庑碗s交探針taqmantaqmanl 目標(biāo)特異性探針目標(biāo)特異性探針l 5 5為熒光素，為熒光素， 3 3為淬滅劑為淬滅劑5

23、 熒光素3淬滅劑與目標(biāo)序列互補(bǔ)與目標(biāo)序列互補(bǔ)5533d.ntpsthermal stable dna polymeraseprimers5353535353535353add master mix and sampledenaturation535353535353annealingreaction tubetaql53rqprobe53rqtaqmantaqman工作原理工作原理535353rqextension step531. strand displacementtaq5533qtaqr52. cleavage3. polymerizationcomplete53qtaqr354. d

24、etection533qtaqr5ltaqmantaqman工作原理工作原理r3qtaqmantaqman實(shí)驗(yàn)結(jié)果實(shí)驗(yàn)結(jié)果taqmantaqman優(yōu)點(diǎn)優(yōu)點(diǎn)l 對(duì)目標(biāo)序列有很高的特異性對(duì)目標(biāo)序列有很高的特異性 - -特別適合于特別適合于snpsnp檢測(cè)檢測(cè)l可以實(shí)現(xiàn)可以實(shí)現(xiàn)多通道檢測(cè)多通道檢測(cè) l與與 molecular beacons molecular beacons 相比設(shè)計(jì)相比設(shè)計(jì) 相對(duì)簡(jiǎn)單相對(duì)簡(jiǎn)單taqmantaqman缺點(diǎn)缺點(diǎn) 價(jià)格較高價(jià)格較高 只適合于一個(gè)特定的目標(biāo)只適合于一個(gè)特定的目標(biāo) 不能進(jìn)行融解曲線分析不能進(jìn)行融解曲線分析 背景高背景高兼容化學(xué)試劑總結(jié)兼容化學(xué)試劑總結(jié)結(jié)合于雙

25、鏈結(jié)合于雙鏈dna的小溝的小溝中中發(fā)夾型雜交探發(fā)夾型雜交探針針?biāo)庑碗s交探水解型雜交探針（針（5-3外切）外切）延伸延伸復(fù)性復(fù)性任何任何步驟步驟定量和檢測(cè)目標(biāo)基因定量和檢測(cè)目標(biāo)基因熔解曲線分析熔解曲線分析snp分析分析定量和檢測(cè)目標(biāo)基因定量和檢測(cè)目標(biāo)基因snp分析分析定量和檢測(cè)目標(biāo)基因定量和檢測(cè)目標(biāo)基因信號(hào)檢測(cè)信號(hào)檢測(cè)工作原理工作原理有否淬滅劑有否淬滅劑化學(xué)試劑化學(xué)試劑否否有有有有主要應(yīng)用范圍主要應(yīng)用范圍提綱提綱 pcr pcr簡(jiǎn)介簡(jiǎn)介 熒光定量熒光定量pcrpcr技術(shù)原理技術(shù)原理 熒光化學(xué)物質(zhì)簡(jiǎn)介熒光化學(xué)物質(zhì)簡(jiǎn)介 多重多重pcr與內(nèi)參照基因與內(nèi)參照基因 定量方法定量方法 定量定量pcrpcr

26、技術(shù)延伸技術(shù)延伸 基因分型（基因分型（snpsnp）檢測(cè)）檢測(cè) 熔解曲線分析熔解曲線分析實(shí)時(shí)熒光定量實(shí)時(shí)熒光定量pcrpcr技術(shù)簡(jiǎn)介：技術(shù)簡(jiǎn)介：多重多重pcr在一個(gè)在一個(gè)pcrpcr管中進(jìn)行多個(gè)不同的管中進(jìn)行多個(gè)不同的pcrpcr反應(yīng)：反應(yīng)： 同一樣本，多對(duì)引物，分別擴(kuò)增不同的靶基因同一樣本，多對(duì)引物，分別擴(kuò)增不同的靶基因 目標(biāo)基因目標(biāo)基因 內(nèi)參照基因（看家基因）內(nèi)參照基因（看家基因） 不同熒光標(biāo)記的探針識(shí)別不同的靶基因不同熒光標(biāo)記的探針識(shí)別不同的靶基因內(nèi)參照基因內(nèi)參照基因 解決模板提取過(guò)程中造成的差別解決模板提取過(guò)程中造成的差別 解決樣品材料不均一造成的差別解決樣品材料不均一造成的差別 解決

27、加樣過(guò)程中的差別解決加樣過(guò)程中的差別內(nèi)參照基因內(nèi)參照基因多通道技術(shù)多通道技術(shù)多通道技術(shù)：多通道技術(shù)： 使用多種熒光染料使用多種熒光染料 在不同的檢測(cè)通道內(nèi)同時(shí)測(cè)定多種不同在不同的檢測(cè)通道內(nèi)同時(shí)測(cè)定多種不同 熒光染料發(fā)出的熒光熒光染料發(fā)出的熒光1 1、引物及探針問(wèn)題、引物及探針問(wèn)題-引物及探針的相互干擾引物及探針的相互干擾2 2、不同、不同pcrpcr反應(yīng)要在同樣擴(kuò)增條件下進(jìn)行反應(yīng)要在同樣擴(kuò)增條件下進(jìn)行2 2、模板量差別、模板量差別-共用資源的相互競(jìng)爭(zhēng)共用資源的相互競(jìng)爭(zhēng)多重多重pcr技術(shù)問(wèn)題技術(shù)問(wèn)題一個(gè)一個(gè)pcrpcr管內(nèi)進(jìn)行多重管內(nèi)進(jìn)行多重pcrpcr擴(kuò)增要解決的問(wèn)題：擴(kuò)增要解決的問(wèn)題：frr

28、qfrrqfrrqrq多重多重pcrpcr技術(shù)問(wèn)題技術(shù)問(wèn)題1 1、引物及探針相互干擾問(wèn)、引物及探針相互干擾問(wèn)題題frrqfrrqrqrqrqrqrqrqrqrqrqrqrqrqrqrqrqrqrqrqrqrq2 2、共用資源的相互競(jìng)爭(zhēng)、共用資源的相互競(jìng)爭(zhēng)多重多重pcrpcr技術(shù)問(wèn)題技術(shù)問(wèn)題單雙通道同時(shí)進(jìn)行，相互驗(yàn)證單雙通道同時(shí)進(jìn)行，相互驗(yàn)證frrqfrrqrqrqrqrqrqrqrqrqrqrqrqrqrqrqrqrq單單單單雙雙多重多重pcrpcr技術(shù)問(wèn)題技術(shù)問(wèn)題提綱提綱 pcr pcr簡(jiǎn)介簡(jiǎn)介 熒光定量熒光定量pcrpcr技術(shù)原理技術(shù)原理 熒光化學(xué)物質(zhì)簡(jiǎn)介熒光化學(xué)物質(zhì)簡(jiǎn)介 多重多重pcrp

29、cr與內(nèi)參照基因與內(nèi)參照基因 定量方法定量方法 定量定量pcrpcr技術(shù)延伸技術(shù)延伸 基因分型（基因分型（snpsnp）檢測(cè)）檢測(cè) 熔解曲線分析熔解曲線分析實(shí)時(shí)熒光定量實(shí)時(shí)熒光定量pcrpcr技術(shù)簡(jiǎn)介：技術(shù)簡(jiǎn)介：表達(dá)差異表達(dá)差異基因表達(dá)差異分析（替代基因表達(dá)差異分析（替代northern blot)northern blot)：responses to a particular stimulustissue differentiationstages of developmentcell proliferationdisease state progression研究方面部分應(yīng)用研究方面部分應(yīng)

30、用two-color-real-time qpcr assay for cancer marker expression using taqman probes應(yīng)用實(shí)例應(yīng)用實(shí)例cancer marker expression cancer marker expression taqman chemistry multiplexing expression differences of erbb2 in neoplastic breast tissue samplescancer marker expressioncancer marker expression erbb2 oncogene t

31、ransmembrane tyrosine kinase overexpressed in 25 % of breast cancer cases increased transcript levels associated with a poor prognosis and lower response to standard treatments gapdh housekeeping gene for normalization材料和方法材料和方法l 從 正常乳腺組織中提取的 total rna l 從乳腺癌組織中提取的 total rnal 含 erbb2 and gapdh 的質(zhì)粒用于

32、生成標(biāo)準(zhǔn)曲線l 單雙通道同時(shí)進(jìn)行，獨(dú)立分析l controlsno rnarna + no reverse transcriptase實(shí)驗(yàn)材料實(shí)驗(yàn)材料材料和方法材料和方法multiplex rt-qpcr reaction componentscomponentstock concentrationvolumefinal concentrationrnatarget primer/probe mixgaphd primer/probe mixquantitect probe rt-pcr mixreverse transcriptaseddh2o1ng/ul20x20x2x2.0ul0.5ul

33、0.5ul10.0ul0.2ul6.8ul0.5x0.5x1xtotal volume20ul材料和方法材料和方法1.50c,30min2.95c,15min3.94c,15sec4.60c,1min5.plate read6.go to step 3,39 more times7.10c,forever8.endcolor 2 - vic detection for gapdhcolor 1 fam detection for erbb2實(shí)驗(yàn)結(jié)果實(shí)驗(yàn)結(jié)果實(shí)驗(yàn)結(jié)果實(shí)驗(yàn)結(jié)果pmt1-fam detection- erbb2pmt2-vic detection- gapdh實(shí)驗(yàn)結(jié)果實(shí)驗(yàn)結(jié)果erbb

34、2erbb2單雙通道相互驗(yàn)證的實(shí)驗(yàn)結(jié)果單雙通道相互驗(yàn)證的實(shí)驗(yàn)結(jié)果a.multiplex reactionshealthy rnacarcinoma28.4826.4228.6826.9828.7826.9828.65 0.1526.80 0.32b.singleplex reactionshealthy rnacarcinoma28.6727.0928.7126.6828.7326.7028.70 0.0326.82 0.24healthyrnatumorrnagapdherbb2109510522130249295500857301360001308002.16 x1.45 xcopies

35、ng/ l total rna實(shí)驗(yàn)結(jié)果實(shí)驗(yàn)結(jié)果erbb2 copies / gapdh copies1095 / 95500 = 0.0111052 / 85730 = 0.0122130/136000 = 0.0172492/130800 = 0.019healthy rnatumor rna0.01150.0180.011 / 0.018graphcopies ng/ l total rna實(shí)驗(yàn)結(jié)果實(shí)驗(yàn)結(jié)果00.20.40.60.811.21.41.61.82healthytissuecarc.tissuerelative expressionerbb2erbb2的表達(dá)差異的表達(dá)差異實(shí)驗(yàn)結(jié)

36、果實(shí)驗(yàn)結(jié)果討論討論利用利用rt-qpcrrt-qpcr在在opticon2opticon2上成功檢測(cè)上成功檢測(cè)了了erbb2erbb2基因在不同組織的基因在不同組織的 表達(dá)差表達(dá)差異；在乳腺癌組織中，異；在乳腺癌組織中，erbb2erbb2的表的表達(dá)量提高到正常水平的達(dá)量提高到正常水平的1.81.8倍倍提綱提綱 pcr pcr簡(jiǎn)介簡(jiǎn)介 熒光定量熒光定量pcrpcr技術(shù)原理技術(shù)原理 熒光化學(xué)物質(zhì)簡(jiǎn)介熒光化學(xué)物質(zhì)簡(jiǎn)介 多重多重pcr與內(nèi)參照基因與內(nèi)參照基因 定量方法定量方法 定量定量pcrpcr技術(shù)延伸技術(shù)延伸 熔解曲線分析熔解曲線分析 基因分型（基因分型（snpsnp）檢測(cè)）檢測(cè)實(shí)時(shí)熒光定量實(shí)時(shí)

37、熒光定量pcrpcr技術(shù)簡(jiǎn)介：技術(shù)簡(jiǎn)介：temperature increasesfluorescencedecreasestm graph fluorescence intensity vs. temperature graph fluorescence intensity vs. temperature decreasing fluorescence recorded decreasing fluorescence recorded - due to increasing temperature - due to increasing temperature - due to denatu

38、ration - due to denaturation and release of sgi and release of sgi tm is the point of inflection on the melting curve tm is the point of inflection on the melting curvesybr green i sybr green i 融解曲線分析融解曲線分析熒光強(qiáng)度值熒光強(qiáng)度值隨溫度變化速率隨溫度變化速率對(duì)溫度作圖對(duì)溫度作圖(-di/dt)-didttmsybr green i sybr green i 融解曲線分析融解曲線分析sybr gr

39、een i sybr green i 融解曲線分析融解曲線分析10,000 copies非特異性產(chǎn)物非特異性產(chǎn)物目的產(chǎn)物目的產(chǎn)物目的產(chǎn)物目的產(chǎn)物10 copies10,000 copies10 copies0 copies 溶解曲線溶解曲線擴(kuò)增曲線擴(kuò)增曲線1. 95oc for 15 min2. 94oc for 10 sec3. 63oc for 15 sec4. 72oc for 30 sec5. plate read6. 84oc for 1 sec7. plate read8. go to line 2 39 more times9. melting curve from 65oc t

40、o 95oc, read every 0.2oc, hold 1 sec.sybr green i sybr green i 融解曲線分析融解曲線分析10,000 copies10 copies0 copies 溶解曲線溶解曲線1. 95oc for 15 min2. 94oc for 10 sec3. 63oc for 15 sec4. 72oc for 30 sec5. plate read6. 84oc for 1 sec7. plate read8. go to line 2 39 more times9. melting curve from 65oc to 95oc, read e

41、very 0.2oc, hold 1 sec.擴(kuò)增曲線擴(kuò)增曲線sybr green i sybr green i 融解曲線分析融解曲線分析 進(jìn)行可靠的定量實(shí)驗(yàn)需要對(duì)引物對(duì)進(jìn)行優(yōu)化設(shè)計(jì)進(jìn)行可靠的定量實(shí)驗(yàn)需要對(duì)引物對(duì)進(jìn)行優(yōu)化設(shè)計(jì) 用于優(yōu)化擴(kuò)增產(chǎn)物產(chǎn)量和特異性的參數(shù)用于優(yōu)化擴(kuò)增產(chǎn)物產(chǎn)量和特異性的參數(shù)- 引物設(shè)計(jì)引物設(shè)計(jì) - 擴(kuò)增片段選擇擴(kuò)增片段選擇- 試劑的濃度試劑的濃度- 循環(huán)條件循環(huán)條件l 變性溫度和退火溫度變性溫度和退火溫度real-time pcrreal-time pcr體系優(yōu)化體系優(yōu)化利用動(dòng)態(tài)溫度梯度功能一次實(shí)現(xiàn)退火溫度的優(yōu)化利用動(dòng)態(tài)溫度梯度功能一次實(shí)現(xiàn)退火溫度的優(yōu)化real-time

42、pcrreal-time pcr體系優(yōu)化體系優(yōu)化45oc55oc65oc溶解曲線溶解曲線擴(kuò)增曲線擴(kuò)增曲線1. 95oc for 15 min2. 94oc for 10 sec3. gradient from 45oc to 65oc for 15 sec4. 72oc for 30 sec5. 83oc for 1 sec6. plate read7. go to line 2 39 more times8. melting curve from 65oc to 95oc, readevery 0.2oc, hold 1 sec.real-time pcrreal-time pcr體系優(yōu)化體系優(yōu)化提綱提綱 pcrpcr簡(jiǎn)介簡(jiǎn)介 熒光定量熒光定量pcrpcr技術(shù)原理技術(shù)原理 熒光化學(xué)物質(zhì)簡(jiǎn)介熒光化學(xué)物質(zhì)簡(jiǎn)介 多重多重pcrpcr與內(nèi)參照基因與內(nèi)參照基因 定量方法定量方法 定量定量pcrpcr技術(shù)延伸技術(shù)延伸 熔解曲線分析