葡萄糖異構(gòu)酶

1、葡萄糖異構(gòu)酶研究概況摘要：葡萄糖異構(gòu)酶(glucose isomerase，GI)能催化D葡萄糖至D果糖的異構(gòu)化反應(yīng)，是工業(yè)上大規(guī)模從淀粉制備高果糖漿的關(guān)鍵酶，目前國內(nèi)外眾多科研機(jī)構(gòu)和企業(yè)正在進(jìn)行葡萄糖異構(gòu)酶研究和應(yīng)用。葡萄糖異構(gòu)酶的研究主要包括菌種的篩選、發(fā)酵條件的優(yōu)化以及酶的固定化生產(chǎn)等方面。關(guān)鍵字：葡萄糖異構(gòu)酶 菌種 分離 純化 固定化一、葡萄糖異構(gòu)酶簡介 葡萄糖異構(gòu)酶(Gl)又稱D-木糖異構(gòu)酶（D-xylose isomerase），為一種水溶性酶。1957年在嗜水假單胞菌中最早發(fā)現(xiàn)了GI，它能催化D一葡萄糖至D一果糖的異構(gòu)化反應(yīng)，特別是在果葡糖漿的生產(chǎn)中，是工業(yè)上大規(guī)模從淀粉制備高果

2、糖漿(high fructose cord syrup，HFCS)的關(guān)鍵酶，并且該酶還能夠?qū)⒛揪厶钱悩?gòu)化為木酮糖，再經(jīng)微生物發(fā)酵后生產(chǎn)乙醇。應(yīng)用這種酶可以使葡萄長期以來糖漿中90%以上的糖分轉(zhuǎn)化為果精，使甜度大大提高，因而可用淀粉作原料生產(chǎn)出食用性良好的葡果糖漿。為了解決食糖供應(yīng)不足，六十年代末期以來，葡萄糖異構(gòu)酶的生產(chǎn)與應(yīng)用的研究引起了人們的重視。二、產(chǎn)葡萄糖異構(gòu)酶的微生物產(chǎn)葡萄糖異構(gòu)酶的菌株很多，主要有沙門氏菌、大腸桿菌、枯草桿菌屬、葡萄球菌屬、鏈霉菌屬及其他菌屬。大多數(shù)是從土壤中分離出來的。放線菌具有葡萄糖異構(gòu)酶產(chǎn)量多，酶的熱穩(wěn)定性好等優(yōu)點(diǎn)，并且在酶反應(yīng)時(shí)不需要添加砷酸鹽或錳鹽等有毒物質(zhì)

3、。分離異構(gòu)酶產(chǎn)生菌，一般采用木糖作唯一碳源，如吉村貞彥等使用D木糖1%、酵母膏0.1 %、磷酸氮二鉀0.05 %、硫酸鎂0.025 %、硫酸錳0.001 %和碳酸鈣0.2 %組成培養(yǎng)基，在含有10毫升上述培養(yǎng)基的試管中，接入土樣。45培養(yǎng)24小時(shí)，連續(xù)富集培養(yǎng)三次，然后于加入2 %瓊脂的上述培養(yǎng)中，進(jìn)行平板分離，移入斜面，再進(jìn)行搖瓶發(fā)酵，測定葡萄糖異構(gòu)酶活力。除土壤分離新菌種外，另外對原有菌種進(jìn)行強(qiáng)烈因子處理。如Bengtson用亞硝基胍或紫外線誘變Streptomyces ATCC 21175能顯著提高酶活，經(jīng)處理的菌種酶活力為518單位/毫升，而不處理的僅有3 18單位/毫升。請預(yù)覽后下載

4、！三、葡萄糖異構(gòu)酶發(fā)酵條件3.1 碳源對形成葡萄糖異構(gòu)酶的影響葡萄糖異構(gòu)酶是一種誘導(dǎo)酶，一般需要在培養(yǎng)基中加入木糖一類物質(zhì)，才能促進(jìn)酶的形成。但木糖價(jià)格昂貴，不易實(shí)現(xiàn)工業(yè)化生產(chǎn)。高崎義幸研究可用麩皮代替木糖進(jìn)行培養(yǎng)，又用棉籽殼與玉米芯的酸水解物代替木糖也收到好的效果。Park等認(rèn)為酸水解玉米芯或麩皮作為誘導(dǎo)劑，能促進(jìn)酶的形成，而用堿水解卻不產(chǎn)酶。高崎義幸指出麩皮浸出液( 100，2小時(shí))，在pH5.0，80，用-淀粉酶處理后能增加S. albu YT4酶活及縮短發(fā)酵時(shí)間。又認(rèn)為木二糖比木糖作為誘導(dǎo)物更有效，當(dāng)培養(yǎng)基有木二糖或木聚糖和木糖共存時(shí)，酶活力更顯著增加。高崎義幸在培養(yǎng)鏈霉菌時(shí)，添加0.

5、2 %木二糖到含有0.5 %木聚糖的培養(yǎng)基中，PH7.0 ，30，培養(yǎng)33小時(shí)，與不加木二糖相比，酶活力能成倍增長。有些研究者報(bào)道在培養(yǎng)基中加人葡萄糖、山梨醇能維持一定pH，同時(shí)山梨醇能增加產(chǎn)酶量。3.2氮源對生產(chǎn)葡萄糖異構(gòu)酶的影響高崎義幸認(rèn)為玉米漿、酪素酸解液及酶解液對鏈霉菌產(chǎn)生葡萄糖異構(gòu)酶較合適。多數(shù)都采用玉米漿作為氮源，也有使用硝酸銨、磷酸銨等作為氮源。Heady為促進(jìn)酶產(chǎn)量，培養(yǎng)S.olivochromogenes ATCC 21114時(shí)，在培養(yǎng)基中加入甘氨酸及硝酸銨，能顯著刺激酶活，增加酶量兩倍多。四、葡萄糖異構(gòu)酶的分離純化4.1葡萄糖異構(gòu)酶的提取酶的提取是指在一定條件下，用適當(dāng)?shù)娜?/p>

6、劑處理細(xì)胞破碎后的含酶原料，使酶充分地溶解到提取液中的過程。葡萄糖異構(gòu)酶主要是胞內(nèi)酶，可以直接用其菌體，進(jìn)行反應(yīng)。提取胞內(nèi)酶，首先要做的工作就是破碎細(xì)胞（細(xì)胞壁、細(xì)胞膜），然后將含有酶活性的部分用過濾或離心的方法去除殘留細(xì)胞以及細(xì)胞碎片，從而進(jìn)一步得到澄清的溶液。再采用逐步逐級分離和濃縮等步驟將所得的無細(xì)胞提取液純化。常用破碎處理法：請預(yù)覽后下載！1、 機(jī)械破碎法：指利用搗碎機(jī)、研磨器或勻漿器等將細(xì)胞破碎開來；2、 物理破碎法：指利用溫度差、壓力差或超聲波等將細(xì)胞破碎開來；3、 化學(xué)破碎法：指利用甲醛、丙酮等有機(jī)溶劑或表面活性劑作用于細(xì)胞膜，使細(xì)胞膜的結(jié)構(gòu)遭到破壞或透性發(fā)生改變；4、 酶學(xué)破碎

7、法：指選用合適的酶，使細(xì)胞壁遭到破壞，進(jìn)而在低滲溶液中將原生質(zhì)體破碎開來。4.2純酶的分離純化4.2.1DEAE-纖維素離子交換層析 離子交換柱層析粗酶液經(jīng)過DEAE纖維素DE52柱(3x11cm)層析分離，當(dāng)上樣量使柱飽和后，用含有不同濃度NaCl的0.02摩爾/磷酸鈉緩沖液梯度洗脫并收集活力峰，SePhadexG200柱層析，將離子交換所得活性組分適當(dāng)濃縮，加至平衡后的SephadexG200柱(2X10oem)上，Zsonm監(jiān)測下收集活力峰，圓盤電泳檢測為均一帶。4.2.2 SePhadex凝膠過濾在離子交換柱層析分離的基礎(chǔ)上，將所收集的活性組分透析濃縮后，分別在SephadexG150

8、和SephadexG200兩種介質(zhì)上進(jìn)行了分離實(shí)驗(yàn)，選用最適柱長及柱內(nèi)徑。以產(chǎn)酶菌株：玫瑰紅336變異株分離純化為例進(jìn)行以下闡述：酶的分離純化過程：(l) 酶的抽提：將所制得的丙酮干粉按50 m L/ g 干粉之比加入0.05 mol/L，pH7.8的磷酸緩沖液，磁力攪拌3 h后離心15min(400 r/min)得上清為粗酶液。若要提高產(chǎn)率，可以進(jìn)行多次抽提。(2) DEAE52 纖維素柱層析：粗酶液直接上DEAE52 纖維素柱，依次用0.05mol/L磷酸緩沖液配制的0.1，0.15，0.2，0.3 mol/L NaCl溶液(pH7.5 )洗脫，收集0.2 mol/LNaCl溶液的洗脫峰，

9、必要時(shí)可再收集0.3 mol/L NaCl洗脫下來的活力峰( 見圖1 )。請預(yù)覽后下載！ (3) 硫酸銨分級：將收集的酶液用固體硫酸鐵調(diào)至飽和度為0.3，在5攪拌1h，離心(10000 r/min)得上清后再用硫酸鐵調(diào)至飽和度為0.45，5下攪拌l h 后，離心得有酶活力的沉淀。加0.05 mol/L，pH7.5磷酸緩沖液溶解后，透析過夜。與一般做法不同，硫酸鐵分級安排在DEAE52纖維素處理后，避免了硫酸銨用量大、雜蛋白濃度低使硫酸銨分級不易處理的弊端。抽提液經(jīng)DEAE纖維素層析后樣品體積小、雜蛋白濃度低，可以選擇較窄的硫酸銨飽和度區(qū)間。(4) DEAESephadex A50柱層析：上步所

10、得酶液上DEAESephadex A50柱，用0.05 mol/L 磷酸緩沖液(PH 7.8)配制的0.1 0 .5 mol/L NaCl溶液進(jìn)行連續(xù)梯度洗脫,收集0.35 0.48 mol/L濃度范圍的洗脫液(見圖2 )(5) SePhadex G20柱層析：將上步收集的酶液經(jīng)聚乙二醇反透析濃縮后，取35mL上Sephadex G200柱，用0.05mol/L，pH7.5整磷酸緩沖液洗脫，收集活力峰(見圖3)。請預(yù)覽后下載！(6) 丙酮干粉法與超聲波法比較：與前人提純GI不同的是我們在細(xì)胞破碎時(shí)采用丙酮干粉法取代了常規(guī)的超聲波和自溶法。在活力收率相近的基礎(chǔ)上，比活有較大的提高，說明雜蛋白量減

11、少。同時(shí)OD280/OD260大于1.0，說明核酸污染較?。ㄒ姳?） 以上各層析過程均在5下進(jìn)行，各步提純的數(shù)據(jù)見表2。采用7%聚丙烯酞胺凝膠對純化酶進(jìn)行電泳分析，結(jié)果證實(shí)是均一的( 見圖4)，此圖也顯示了各提純階段樣品電泳后的情形。請預(yù)覽后下載！5、 葡萄糖異構(gòu)酶的固定化葡萄糖異構(gòu)酶固定化技術(shù)在工業(yè)和生物技術(shù)的應(yīng)用中有多種優(yōu)勢，包括可以反復(fù)使用，反應(yīng)產(chǎn)物易于從生物催化劑中分離，酶穩(wěn)定性的改善，在填充床反應(yīng)器的連續(xù)操作和酶物質(zhì)的選擇。近年來固定化葡萄糖異構(gòu)酶越來越多地被用于工業(yè)化生產(chǎn)果葡糖漿中，主要因?yàn)樗麄儗H值、極端溫度和有機(jī)溶劑具有較好的耐受性。工業(yè)上使用固定化異構(gòu)酶進(jìn)行異構(gòu)化反應(yīng)時(shí)具有

12、許多優(yōu)點(diǎn)：由于固定化異構(gòu)酶不溶于水，產(chǎn)物的提純分離大為簡化，用于食品加工，不影響產(chǎn)品風(fēng)味；酶在固定化后，穩(wěn)定性增加，可長期使用和連續(xù)反應(yīng)，從而提高產(chǎn)品質(zhì)量，工廠的規(guī)模減小，自動化程度增加。因?yàn)槠咸烟钱悩?gòu)酶沒有一種特定的固定化方法，所以固定化必須要謹(jǐn)慎對待。5.1固定化葡萄糖異構(gòu)酶的影響因素 在固定化生產(chǎn)中，PH、溫度、氧氣濃度、金屬離子、底物純度以及副產(chǎn)物等因素都會影響酶的活性，從而影響酶的固定化的效果?，F(xiàn)列舉幾個因素及其他們的作用如下：請預(yù)覽后下載！5.2固定化葡萄糖異構(gòu)酶載體材料 目前固定化葡萄糖異構(gòu)酶的載體材料種類繁多，按其組成可以分為高分子載體、無機(jī)載體和磁性高分子微球等。高分子載體又

13、分為天然高分子載體和合成高分子載體。5.2.1天然高分子載體天然多糖類化合物由于無毒，傳質(zhì)性能好和豐富易得等特點(diǎn)較適合擔(dān)當(dāng)酶的固定化載體材料，主要有殼聚糖、淀粉和海藻酸鈉等。(1)殼聚糖及其衍生物殼聚糖 (Chitosan)是一種由甲殼素經(jīng)化學(xué)改性得到的天然高分子材料，多以戊二醛為交聯(lián)劑的形式擔(dān)當(dāng)酶的固定化載體。宋箭等采用殼聚糖絮凝明膠包埋戊二醛交聯(lián)固定化葡萄糖異構(gòu)酶細(xì)胞。采用該法，菌絲體回收方便，產(chǎn)品質(zhì)量穩(wěn)定，收率高，固定化酶活力約8000單位/克絕干。產(chǎn)品機(jī)械強(qiáng)度好，轉(zhuǎn)化能力穩(wěn)定。(2)海藻酸鹽海藻酸是一種天然的陰離子型聚電解質(zhì)多糖，主要來源于海洋植物，無毒，具有良好的生物降解性和相容性。

14、海藻酸(Alginate)不僅可與一價(jià)的Na+或K+結(jié)合為海藻酸鈉或海藻酸鉀，還可以與許多二價(jià)和三價(jià)陽離子結(jié)合如：海藻酸鈣和海藻酸胺等，是較為理想的載體。但在含多價(jià)陰離子溶液及高濃度電解質(zhì)溶液中海藻酸鈣凝膠不穩(wěn)定、Ca+離子易脫落，使其應(yīng)用受到限制。為了克服以上缺點(diǎn)，Hayrettin.T.等研究了游離酶和固定化酶的各種特性，發(fā)現(xiàn)固化酶可以在很長一段時(shí)間內(nèi)保持活性而且穩(wěn)定性能也得到了較大的提高。(3)淀粉接枝聚合物淀粉廣泛存在于各種植物成熟的果實(shí)中，具有可生物降解、無毒性等特點(diǎn)。用其作為酶的固定化載體不僅固定化方法簡單，且對酶有一定的保護(hù)作用，易接枝，并對酶熱處理一段時(shí)間后，酶的活力最大可提高

15、40%，這為工業(yè)應(yīng)用提供了一條新途徑。葛玉斌等以多孔球狀淀粉接枝共聚物為載體，以對p一硫酸酷己颯基苯胺 (SESA)為載體活化劑，采用重氮化法共價(jià)偶聯(lián)共固定糖化酶和葡萄糖異構(gòu)酶，該共固定雙酶體系適用于各種類型的淀粉底物，其催化效率是天然酶體系的1.6倍。請預(yù)覽后下載！(4) 絲素膜家蠶絲纖維可作為固定化載體是由于其特殊的氨基酸組合和結(jié)晶結(jié)構(gòu)。絲素膜做固定化載體具有獨(dú)特的優(yōu)點(diǎn)：使酶的pH穩(wěn)定性、熱穩(wěn)定性大大提高；酶的最適pH值和最適溫度發(fā)生偏移；有利于改變pH值和溫度有效控制酶促反應(yīng)和分解反應(yīng)、提高反應(yīng)速度；同時(shí)絲素蛋白膜制備簡便、來源廣、價(jià)格便宜、固定化方法簡單。朱祥瑞等將脫膠蠶絲用稀堿溶液處

16、理后制成多孔的堿化絲素，分別經(jīng)物理吸附和戊二醛交聯(lián)方法制得固定化酶，經(jīng)對固定化酶性質(zhì)的研究表明，堿化絲素和絲素粉末均能較好地固定葡萄糖異構(gòu)酶。5.2.2有機(jī)高分子合成載體與低分子有機(jī)化合物相比，高分子合成載體具有很多寶貴性能，如機(jī)械強(qiáng)度大、可塑性強(qiáng)、耐熱耐磨、耐溶劑、耐腐蝕、彈性高，使高分子材料具有非常廣泛的應(yīng)用。劉建忠等用大孔徑聚丙烯睛樹脂固定化葡萄糖異構(gòu)酶。聚丙烯睛樹脂（PAN)的孔徑是葡萄糖異構(gòu)酶分子的2倍，且具有高比表面積，因此非常有利于Gl分子的吸附固定化。固定化葡萄糖異構(gòu)酶(IGI)最適反應(yīng)溫度比天然酶提高15。5.2.3無機(jī)載體與有機(jī)材料相比，無機(jī)載體有，具有較高的機(jī)械強(qiáng)度、較好

17、的穩(wěn)定性、無毒、微生物不易分解、耐酸堿等優(yōu)點(diǎn)。常見的無機(jī)載體材料有氧化鋁、硅膠、玻璃等。 多孔玻璃或無機(jī)硅藻土由于不容易被微生物降解，具有較高的熱穩(wěn)定性和成本較低等優(yōu)點(diǎn)，被固定化研究所重視。（1）硅載體及多孔二氧化硅目前在這一方面，經(jīng)表面處理過的硅載體應(yīng)用前景很好。已研究出的硅載體在固定化酶的方法有五種：通過金屬鍵結(jié)合；用環(huán)氧交聯(lián)劑結(jié)合；多聚賴氨酸吸附法；用含氨基的硅烷試劑結(jié)合；凝膠薄層包埋法。 Perminova L.v等，在單糖(葡萄糖和果糖)的異構(gòu)化實(shí)驗(yàn)中，采用包埋法以二氧化硅凝膠為載體固定化，對異構(gòu)化過程中葡萄糖異構(gòu)酶活性和穩(wěn)定性進(jìn)行了研究，同時(shí)對不同的無機(jī)載體固定化制成的生物催化劑進(jìn)

18、行了比較，實(shí)驗(yàn)表明，得到的葡萄糖異構(gòu)酶的最大活性為10U/g。請預(yù)覽后下載?。?）氧化鋁載體陳永生等以低堆比的大孔氧化鋁為核心，經(jīng)化學(xué)修飾制成固定化葡萄糖異構(gòu)酶。該氧化鋁載體具有大孔容、低堆比，優(yōu)良的孔結(jié)構(gòu)和表面性質(zhì)。有機(jī)膜經(jīng)過化學(xué)修飾在氧化鋁表面牢固結(jié)合，且官能團(tuán)與酶結(jié)合能力較強(qiáng)。（3）陶瓷載體Kovalenko G.A等對單糖在未受損及未成長的煙草節(jié)桿菌細(xì)胞(產(chǎn)葡萄糖異構(gòu)酶)的懸浮液中異構(gòu)化的動力學(xué)進(jìn)行了研究，液面下培養(yǎng)的煙草節(jié)桿菌通過吸附含碳的泡沫陶瓷獲得生物催化劑，葡萄糖異構(gòu)酶的活性在 70、14h的使用中相當(dāng)穩(wěn)定并保留原有活性，得到的固定化細(xì)胞的最大活性為2U/g。6、 葡萄糖異構(gòu)酶

19、的固定化方法目前已報(bào)道的對于葡萄糖異構(gòu)酶的固定化方法已發(fā)表近百種，但在工業(yè)中應(yīng)用的只有七八種，包括包埋、吸附及細(xì)胞凝聚等。固定化在很多情況下都能夠完成，但總會在某種程度上影響酶活性。歸納起來大致可以分為四種：包埋法、交聯(lián)法、結(jié)合法和物理吸附法。6.1包埋法酶被裹在凝膠的細(xì)格子中或被半透性的聚合物膜包圍而成為格子型和微膠囊型兩種。包埋法制備固定化酶除包埋水溶性酶外還常包埋細(xì)胞，制成固定化細(xì)胞。酶經(jīng)過包埋法固定化后，比較耐受溫度及pH的變化，最適pH往往稍有移位，對底物專一性沒有任何改變，實(shí)際使用效率提高幾十倍(如5一磷酸二酯酶的工業(yè)應(yīng)用)甚至幾百倍(如青霉素酸化酶的工業(yè)應(yīng)用)。另外，采用包埋法固

20、定化酶的動力學(xué)行為會受到擴(kuò)散阻力會而發(fā)生改變，使酶的活性降低。包埋法會導(dǎo)致嚴(yán)重的擴(kuò)散限制，這樣就減弱了酶的表觀活性，但是仍然有很多酶被包埋于載體網(wǎng)格中，顯示出了包埋法同其他酶固定化方法一樣甚至更好的保持的酶活，因?yàn)榕c共價(jià)法相比，包埋法往往非常溫和，因此這種方法對于用共價(jià)法固定化容易失活的酶來說非常有用的。6.2交聯(lián)法請預(yù)覽后下載！交聯(lián)法是采用雙功能試劑或多功能試劑進(jìn)行酶分子之間的交聯(lián)，使酶分子和雙功能試劑或者多功能之間形成共價(jià)鍵，得到三維交聯(lián)網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)。常用的雙功能試劑有戊二醛，乙二胺、順丁烯二酸醉、雙偶氮苯。其中應(yīng)用最廣泛的是戊二醛。6.3結(jié)合法 結(jié)合法是通過物理或者化學(xué)過程，使之通過共價(jià)鍵或

21、離子鍵與酶結(jié)合的固定化方法。用該法制備固定化酶時(shí)，須按照酶的種類及性質(zhì)選擇合適的載體和固載方法，因?yàn)樗x的載體種類和固載方法對酶的擔(dān)載量和反應(yīng)性能有很大的影響。一般而言，載體的親水性基團(tuán)越多，表面積越大，固載的酶量越多，所得到的固定化酶的活性就越高。因?yàn)槊阜肿邮巧锎蠓肿樱ǔＪ走x葡聚糖、纖維素、多糖類衍生物和聚丙烯酞胺凝膠等有機(jī)高分子載體，可根據(jù)酶的性質(zhì)和固定化方法選擇合適的無機(jī)載體如5102、A1203、2102、TioZ和分子篩等，因?yàn)樗麄兿鄬Ρ容^便宜，使用過程中不容易溶脹，流體力學(xué)性質(zhì)好，機(jī)械強(qiáng)度較高。根據(jù)結(jié)合形式不同，結(jié)合法可分為共價(jià)結(jié)合法和離子結(jié)合法。6.4物理吸附法 物理吸附法是

22、將酶蛋白通過范德華力等弱相互作用吸附在不溶于水的載體表面上對酶進(jìn)行固定化的方法。常用的吸附劑有活性炭、氧化鋁、硅藻土、多孔陶瓷、多孔玻璃、硅膠及輕基磷灰石等。 劉建忠等用大孔徑聚丙烯睛樹脂通過物理吸附法固定化葡萄糖異構(gòu)酶，由于其高的比表面積，使得葡萄糖異構(gòu)酶很好地吸附于載體上。用物理吸附法固定化酶的過程中，酶蛋白的活性中心不易受到破壞，酶的高級結(jié)構(gòu)變化也不明顯，從載體對酶的適應(yīng)性來講，此方法較好，但缺點(diǎn)是酶與載體的相互作用很弱，被吸附的酶分子極易從載體表面脫落下來，所以在使用過程中受到一定的限制。綜上所述，酶的各種固定化方法都有其各自的優(yōu)缺點(diǎn)，但其反應(yīng)過程大同小異，如下所示為固定化葡萄糖異構(gòu)酶反應(yīng)器的見圖：請預(yù)覽后下載！參考文獻(xiàn)：1 Snehalata H. Bhosale, Mala B. Rao, and Vasanti V. Deshpande.Molecular and industrial