湖工酶工程第三章

1、第三章第三章 酶的分離工程酶的分離工程酶工程酶工程第三章第三章 酶的分離工程酶的分離工程 酶的分離工程是指酶的提取和分離純化的過(guò)程，酶的分離工程是指酶的提取和分離純化的過(guò)程，即將酶從生物細(xì)胞或培養(yǎng)物等含酶原料中提取出來(lái)，即將酶從生物細(xì)胞或培養(yǎng)物等含酶原料中提取出來(lái)，再與雜質(zhì)分開(kāi)，從而獲得能滿足使用需求的一定純度再與雜質(zhì)分開(kāi)，從而獲得能滿足使用需求的一定純度的酶制品的過(guò)程。的酶制品的過(guò)程。 酶的分離純化過(guò)程一般包括四個(gè)階段：酶的分離純化過(guò)程一般包括四個(gè)階段：預(yù)處理預(yù)處理、粗分離粗分離、細(xì)分離細(xì)分離、成品化成品化。第三章第三章 酶的分離工程酶的分離工程酶工程酶工程第一節(jié)第一節(jié) 預(yù)預(yù) 處處 理理 胞

2、內(nèi)酶胞內(nèi)酶( (合成后分布在細(xì)胞內(nèi)的酶）；合成后分布在細(xì)胞內(nèi)的酶）；胞外酶（胞外酶（合成合成后分布在細(xì)胞外的酶）后分布在細(xì)胞外的酶）一、發(fā)酵液的預(yù)處理一、發(fā)酵液的預(yù)處理 加熱加熱 降低發(fā)酵液的粘度，使某些雜質(zhì)變性，使發(fā)降低發(fā)酵液的粘度，使某些雜質(zhì)變性，使發(fā)酵液容易過(guò)濾。酵液容易過(guò)濾。 凝聚凝聚 在溶液中加入電解質(zhì)，使非目標(biāo)產(chǎn)物凝聚成在溶液中加入電解質(zhì)，使非目標(biāo)產(chǎn)物凝聚成較大的顆?；蚰z團(tuán)，更容易沉降或過(guò)濾。較大的顆?；蚰z團(tuán)，更容易沉降或過(guò)濾。第三章第三章 酶的分離工程酶的分離工程酶工程酶工程 絮凝絮凝 利用高分子聚合物的橋聯(lián)作用，將膠體粒子利用高分子聚合物的橋聯(lián)作用，將膠體粒子聯(lián)結(jié)成網(wǎng)狀絮凝團(tuán)的

3、過(guò)程。聯(lián)結(jié)成網(wǎng)狀絮凝團(tuán)的過(guò)程。聚丙烯酰胺聚丙烯酰胺 添加助濾劑添加助濾劑 使膠體粒子吸附在固體助濾劑上，隨使膠體粒子吸附在固體助濾劑上，隨助濾劑一起被截留。助濾劑一起被截留。硅藻土和珍珠巖硅藻土和珍珠巖第三章第三章 酶的分離工程酶的分離工程酶工程酶工程二、細(xì)胞破碎二、細(xì)胞破碎（一）機(jī)械破碎法（一）機(jī)械破碎法實(shí)驗(yàn)室操作方法實(shí)驗(yàn)室操作方法工業(yè)上使用方法工業(yè)上使用方法搗碎法搗碎法研磨法研磨法勻漿法勻漿法撞擊破碎機(jī)法撞擊破碎機(jī)法大容量球磨機(jī)法大容量球磨機(jī)法高壓勻漿器法高壓勻漿器法第三章第三章 酶的分離工程酶的分離工程酶工程酶工程（二）物理破碎法（二）物理破碎法溫差法溫差法：反復(fù)凍融法：反復(fù)凍融法壓差法

4、壓差法：高壓沖擊法、突然降壓法、滲透壓變化法：高壓沖擊法、突然降壓法、滲透壓變化法超聲波法超聲波法：空穴作用：空穴作用（三）化學(xué)破碎法（三）化學(xué)破碎法有機(jī)溶劑破碎法有機(jī)溶劑破碎法：甲苯、丙酮、丁醇、氯仿等：甲苯、丙酮、丁醇、氯仿等表面活性劑破碎法表面活性劑破碎法：Triton、Tween等等第三章第三章 酶的分離工程酶的分離工程酶工程酶工程（四）酶促破碎法（四）酶促破碎法外加酶法外加酶法：溶菌酶、葡聚糖酶、幾丁質(zhì)酶、纖維素酶：溶菌酶、葡聚糖酶、幾丁質(zhì)酶、纖維素酶自溶法自溶法：溫度、：溫度、pH、離子強(qiáng)度等、離子強(qiáng)度等第三章第三章 酶的分離工程酶的分離工程酶工程酶工程第二節(jié)第二節(jié) 酶的提取酶的提

5、取一、酶的提取方法一、酶的提取方法（一）鹽溶液提取法（一）鹽溶液提取法 0.020.5mol/L（二）酸溶液提取法（二）酸溶液提取法 pH 26 酵母醇脫氫酶酵母醇脫氫酶 0.5mol/L磷酸氫二鈉溶液；枯草桿菌磷酸氫二鈉溶液；枯草桿菌堿性磷酸酶堿性磷酸酶 0.1mol/L氯化鎂溶液氯化鎂溶液胰蛋白酶和胰凝乳蛋白酶胰蛋白酶和胰凝乳蛋白酶 0.12mol/L硫酸溶液硫酸溶液第三章第三章 酶的分離工程酶的分離工程酶工程酶工程（三）堿溶液提取法（三）堿溶液提取法 pH 812 （四）有機(jī)溶劑提取法（四）有機(jī)溶劑提取法 乙醇、丙酮、丁醇乙醇、丙酮、丁醇細(xì)菌細(xì)菌L-天冬酰胺酶天冬酰胺酶 pH11.012

6、.5堿性堿性溶液溶液 琥珀酸脫氫酶、膽堿酯酶、細(xì)胞色素氧化酶用丁醇琥珀酸脫氫酶、膽堿酯酶、細(xì)胞色素氧化酶用丁醇提取提取第三章第三章 酶的分離工程酶的分離工程酶工程酶工程二、影響酶提取的主要因素二、影響酶提取的主要因素（一）溫度（一）溫度 在不影響酶活力的前提下，適當(dāng)提高溫度在不影響酶活力的前提下，適當(dāng)提高溫度（二）（二）pH 在保持酶穩(wěn)定的前提下，遠(yuǎn)離酶的等電點(diǎn)在保持酶穩(wěn)定的前提下，遠(yuǎn)離酶的等電點(diǎn)（三）攪拌（三）攪拌 適當(dāng)攪拌，但速度不能過(guò)快適當(dāng)攪拌，但速度不能過(guò)快（四）污染（四）污染 低低pH和低溫下操作和低溫下操作（五）提取液的體積（五）提取液的體積 原料體積原料體積35倍，少量多次倍，少

7、量多次第三章第三章 酶的分離工程酶的分離工程酶工程酶工程第三節(jié)第三節(jié) 酶的分離純化酶的分離純化 將目標(biāo)產(chǎn)物酶與各種雜質(zhì)成分相互分離的過(guò)程成為酶的將目標(biāo)產(chǎn)物酶與各種雜質(zhì)成分相互分離的過(guò)程成為酶的分離純化。分離純化。 目的目的： 除雜；除雜； 濃縮。濃縮。 原理原理：利用目標(biāo)產(chǎn)物酶與各種雜質(zhì)成分在物理、化學(xué)及：利用目標(biāo)產(chǎn)物酶與各種雜質(zhì)成分在物理、化學(xué)及生物學(xué)性質(zhì)上的差異。生物學(xué)性質(zhì)上的差異。 評(píng)價(jià)指標(biāo)評(píng)價(jià)指標(biāo)： 收率；收率； 純化倍數(shù)；純化倍數(shù)； 重現(xiàn)性。重現(xiàn)性。 檢測(cè)方法檢測(cè)方法：快速、方便、有效。：快速、方便、有效。 方法方法：離心、沉淀、過(guò)濾與膜分離、萃取、層析、電泳。：離心、沉淀、過(guò)濾與膜

8、分離、萃取、層析、電泳。第三章第三章 酶的分離工程酶的分離工程酶工程酶工程一、離心分離一、離心分離（一）離心機(jī)的種類（一）離心機(jī)的種類用途：用途：制備、分析及分析制備、分析及分析制備兩用離心機(jī)制備兩用離心機(jī)結(jié)構(gòu)：結(jié)構(gòu)：管式、碟片式、轉(zhuǎn)鼓式、吊蘭式管式、碟片式、轉(zhuǎn)鼓式、吊蘭式轉(zhuǎn)速：轉(zhuǎn)速：低速低速 轉(zhuǎn)速轉(zhuǎn)速 8000r/min ，相對(duì)離心力，相對(duì)離心力1110104 4g高速高速 轉(zhuǎn)速轉(zhuǎn)速 (1(1 2.5 )10104 4 r/min ，相對(duì)離心力相對(duì)離心力 1104 1105 g超速超速 轉(zhuǎn)速轉(zhuǎn)速 ( ( 2.5 12 )104 r/min ，相對(duì)離心力相對(duì)離心力 5105 g第三章第三章 酶

9、的分離工程酶的分離工程酶工程酶工程（二）離心分離方法（二）離心分離方法差速離心：差速離心：通過(guò)控制不同的轉(zhuǎn)速，使不同顆粒大小的物質(zhì)先通過(guò)控制不同的轉(zhuǎn)速，使不同顆粒大小的物質(zhì)先后沉降，從而使不同顆粒大小的物質(zhì)得以分離。后沉降，從而使不同顆粒大小的物質(zhì)得以分離。密度梯度離心：密度梯度離心：最大密度小于目標(biāo)物質(zhì)最大密度小于目標(biāo)物質(zhì)等密度梯度離心：等密度梯度離心：最大密度大于于目標(biāo)物質(zhì)最大密度大于于目標(biāo)物質(zhì)密度梯度離心密度梯度離心等密度梯度離心等密度梯度離心第三章第三章 酶的分離工程酶的分離工程酶工程酶工程二、沉淀分離二、沉淀分離 通過(guò)改變某些條件或添加某種試劑，使酶的溶解度降低，通過(guò)改變某些條件或添

10、加某種試劑，使酶的溶解度降低，以沉淀的形式從溶液中析出，從而與其它溶質(zhì)分離的技術(shù)。以沉淀的形式從溶液中析出，從而與其它溶質(zhì)分離的技術(shù)。 蛋白質(zhì)分子表面是由一系些分布不均勻的荷電區(qū)、親水區(qū)蛋白質(zhì)分子表面是由一系些分布不均勻的荷電區(qū)、親水區(qū)和疏水區(qū)所組成。和疏水區(qū)所組成。 蛋白質(zhì)是兩性電解質(zhì)，在不同蛋白質(zhì)是兩性電解質(zhì)，在不同pH條件下帶有不同的電荷。條件下帶有不同的電荷。 蛋白質(zhì)溶液是膠體溶液，維持其膠體溶液穩(wěn)定性的因素有蛋白質(zhì)溶液是膠體溶液，維持其膠體溶液穩(wěn)定性的因素有兩個(gè)：兩個(gè)： 蛋白質(zhì)分子周?chē)乃瘜?；蛋白質(zhì)分子周?chē)乃瘜樱?同種電荷的排斥作用。同種電荷的排斥作用。第三章第三章 酶的分離工

11、程酶的分離工程酶工程酶工程（一）鹽析沉淀法（一）鹽析沉淀法 通過(guò)加入高濃度無(wú)機(jī)鹽，使酶的溶解度降低，從而使之通過(guò)加入高濃度無(wú)機(jī)鹽，使酶的溶解度降低，從而使之從溶液中沉淀析出的過(guò)程或現(xiàn)象稱為從溶液中沉淀析出的過(guò)程或現(xiàn)象稱為鹽析沉淀鹽析沉淀。 破壞了蛋白質(zhì)分子表面的水化層，使蛋白質(zhì)分子表面破壞了蛋白質(zhì)分子表面的水化層，使蛋白質(zhì)分子表面的疏水基團(tuán)暴露，蛋白質(zhì)分子通過(guò)疏水作用相互聚集而沉淀；的疏水基團(tuán)暴露，蛋白質(zhì)分子通過(guò)疏水作用相互聚集而沉淀； 無(wú)機(jī)鹽中和了蛋白質(zhì)分子表面的電荷，使蛋白質(zhì)分子之間無(wú)機(jī)鹽中和了蛋白質(zhì)分子表面的電荷，使蛋白質(zhì)分子之間的電荷排斥作用消失，蛋白質(zhì)分子的聚集作用增強(qiáng)。的電荷排斥作

12、用消失，蛋白質(zhì)分子的聚集作用增強(qiáng)。機(jī)理：機(jī)理：第三章第三章 酶的分離工程酶的分離工程酶工程酶工程IlogS鹽溶鹽溶鹽析鹽析00.150.2MlogS = - KsIKs 鹽析常數(shù)，與蛋白質(zhì)和鹽的種類有關(guān)。鹽析常數(shù)，與蛋白質(zhì)和鹽的種類有關(guān)。 Ks越大，鹽析效果越好。越大，鹽析效果越好。 與蛋白質(zhì)種類及溫度和與蛋白質(zhì)種類及溫度和pH有關(guān)的常數(shù)。有關(guān)的常數(shù)。 常用的無(wú)機(jī)鹽：常用的無(wú)機(jī)鹽：(NH4)2SO4，NaCl，Na2SO4影響因素：無(wú)機(jī)鹽的種類和濃度，溫度，影響因素：無(wú)機(jī)鹽的種類和濃度，溫度，pH值值第三章第三章 酶的分離工程酶的分離工程酶工程酶工程（二）等電點(diǎn)沉淀法（二）等電點(diǎn)沉淀法 通過(guò)調(diào)

13、節(jié)溶液的通過(guò)調(diào)節(jié)溶液的pH值，使其達(dá)到酶或蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)，值，使其達(dá)到酶或蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)，從而使酶或蛋白質(zhì)從溶液中沉淀析出的過(guò)程或現(xiàn)象稱為從而使酶或蛋白質(zhì)從溶液中沉淀析出的過(guò)程或現(xiàn)象稱為等電等電點(diǎn)沉淀點(diǎn)沉淀。 等電點(diǎn)時(shí)，蛋白質(zhì)分子所帶的凈電荷為零，蛋白質(zhì)分子等電點(diǎn)時(shí)，蛋白質(zhì)分子所帶的凈電荷為零，蛋白質(zhì)分子之間的同種電荷排斥作用消失，蛋白質(zhì)分子的聚集作用增強(qiáng)。之間的同種電荷排斥作用消失，蛋白質(zhì)分子的聚集作用增強(qiáng)。機(jī)理：機(jī)理：第三章第三章 酶的分離工程酶的分離工程酶工程酶工程注意：注意： 調(diào)調(diào)pH值，避免局部過(guò)酸或過(guò)堿，以防止酶變性或失活；值，避免局部過(guò)酸或過(guò)堿，以防止酶變性或失活；只適用于疏水性

14、較強(qiáng)的蛋白，親水性很強(qiáng)的蛋白，單靠等電只適用于疏水性較強(qiáng)的蛋白，親水性很強(qiáng)的蛋白，單靠等電點(diǎn)不能使其完全沉淀。點(diǎn)不能使其完全沉淀。特點(diǎn)：特點(diǎn)： 操作簡(jiǎn)便，無(wú)需后續(xù)脫鹽操作。操作簡(jiǎn)便，無(wú)需后續(xù)脫鹽操作。第三章第三章 酶的分離工程酶的分離工程酶工程酶工程（三）有機(jī)溶劑沉淀法（三）有機(jī)溶劑沉淀法 通過(guò)加入一定濃度的有機(jī)溶劑（乙醇、丙酮），使酶或通過(guò)加入一定濃度的有機(jī)溶劑（乙醇、丙酮），使酶或蛋白質(zhì)從溶液中沉淀析出的過(guò)程或現(xiàn)象稱為蛋白質(zhì)從溶液中沉淀析出的過(guò)程或現(xiàn)象稱為有機(jī)溶劑沉淀法有機(jī)溶劑沉淀法。 降低水溶液的介電常數(shù)，蛋白質(zhì)分子之間的引力增加，降低水溶液的介電常數(shù)，蛋白質(zhì)分子之間的引力增加，蛋白質(zhì)分

15、子相互聚集而沉淀。蛋白質(zhì)分子相互聚集而沉淀。機(jī)理：機(jī)理：第三章第三章 酶的分離工程酶的分離工程酶工程酶工程特點(diǎn)：特點(diǎn)： 優(yōu)點(diǎn)：優(yōu)點(diǎn)：有機(jī)溶劑密度較低，沉淀易于分離；沉淀物不需有機(jī)溶劑密度較低，沉淀易于分離；沉淀物不需進(jìn)行脫鹽處理；有機(jī)溶劑易蒸發(fā)除去；沉淀物色澤較好。進(jìn)行脫鹽處理；有機(jī)溶劑易蒸發(fā)除去；沉淀物色澤較好。 缺點(diǎn)：缺點(diǎn)：有機(jī)溶劑容易導(dǎo)致蛋白質(zhì)變性失活，且易燃易爆，有機(jī)溶劑容易導(dǎo)致蛋白質(zhì)變性失活，且易燃易爆，故必須在低溫條件下進(jìn)行操作，且沉淀物應(yīng)迅速與有機(jī)溶故必須在低溫條件下進(jìn)行操作，且沉淀物應(yīng)迅速與有機(jī)溶劑分離，以減少酶的變性失活率。劑分離，以減少酶的變性失活率。第三章第三章 酶的分離

16、工程酶的分離工程酶工程酶工程（四）選擇性變性沉淀法（四）選擇性變性沉淀法 選擇一定的條件使溶液中的雜蛋白變性沉淀而目標(biāo)蛋白選擇一定的條件使溶液中的雜蛋白變性沉淀而目標(biāo)蛋白不受影響的方法稱為不受影響的方法稱為選擇性變性沉淀法選擇性變性沉淀法。 選擇性變性方式：選擇性變性方式：熱變性熱變性，pH變性變性和和有機(jī)溶劑變性有機(jī)溶劑變性注意：注意： 先充分了解目標(biāo)蛋白的穩(wěn)定性，嚴(yán)格控制條件，使雜蛋先充分了解目標(biāo)蛋白的穩(wěn)定性，嚴(yán)格控制條件，使雜蛋白變性沉淀的同時(shí)，目標(biāo)蛋白不受影響。白變性沉淀的同時(shí)，目標(biāo)蛋白不受影響。第三章第三章 酶的分離工程酶的分離工程酶工程酶工程（五）其它沉淀方法（五）其它沉淀方法非離

17、子性聚合物沉淀法：非離子性聚合物沉淀法： PEG機(jī)理機(jī)理： 與有機(jī)溶劑相似與有機(jī)溶劑相似聚電解質(zhì)沉淀法：聚電解質(zhì)沉淀法：機(jī)理機(jī)理： 絮凝作用絮凝作用第三章第三章 酶的分離工程酶的分離工程酶工程酶工程三、過(guò)濾與膜分離三、過(guò)濾與膜分離 利用過(guò)濾介質(zhì)或膜的膜孔截留作用使不同大小、不同形利用過(guò)濾介質(zhì)或膜的膜孔截留作用使不同大小、不同形狀和不同特性的物質(zhì)相互分離的技術(shù)或方法。狀和不同特性的物質(zhì)相互分離的技術(shù)或方法。（一）粗濾（一）粗濾 利用過(guò)濾介質(zhì)截留懸浮液中直徑大于利用過(guò)濾介質(zhì)截留懸浮液中直徑大于2m的顆粒，從而的顆粒，從而使固液分離使固液分離的技術(shù)或方法。的技術(shù)或方法。過(guò)濾介質(zhì)過(guò)濾介質(zhì)：濾紙、濾布、

18、纖維、陶瓷等：濾紙、濾布、纖維、陶瓷等過(guò)濾方法過(guò)濾方法：常壓過(guò)濾、加壓過(guò)濾、減壓過(guò)濾：常壓過(guò)濾、加壓過(guò)濾、減壓過(guò)濾第三章第三章 酶的分離工程酶的分離工程酶工程酶工程（二）微濾和超濾（二）微濾和超濾微濾微濾：用于懸浮液中粒徑為：用于懸浮液中粒徑為0.22um大小顆粒的分離。大小顆粒的分離。操作壓力：操作壓力：0.050.5 MPa過(guò)濾介質(zhì)：過(guò)濾介質(zhì)：高分子薄膜、微孔陶瓷膜高分子薄膜、微孔陶瓷膜超濾超濾：用于溶液中大小為：用于溶液中大小為2nm0.2um的溶質(zhì)分子的相互的溶質(zhì)分子的相互 分離。分離。操作壓力：操作壓力：0.10.5 MPa第三章第三章 酶的分離工程酶的分離工程酶工程酶工程超濾膜要求

19、超濾膜要求：較大的透過(guò)速率和較好的選擇性；一定的機(jī)械：較大的透過(guò)速率和較好的選擇性；一定的機(jī)械 強(qiáng)度；耐熱、耐腐蝕及不易染菌；耐高溫滅菌；強(qiáng)度；耐熱、耐腐蝕及不易染菌；耐高溫滅菌； 廉價(jià)。廉價(jià)。膜材料膜材料：聚丙烯晴、醋酸纖維素、硝酸纖維素、聚砜、聚偏：聚丙烯晴、醋酸纖維素、硝酸纖維素、聚砜、聚偏 氟乙烯。氟乙烯。膜裝置膜裝置：板框式、圓管式、螺旋卷式、中空纖維式、毛細(xì)管：板框式、圓管式、螺旋卷式、中空纖維式、毛細(xì)管 式式超濾特點(diǎn)超濾特點(diǎn)：分離過(guò)程中無(wú)相變化，可在常溫和低壓下操作，條：分離過(guò)程中無(wú)相變化，可在常溫和低壓下操作，條 件溫和，對(duì)酶蛋白活性影響較小；設(shè)備簡(jiǎn)單，成本件溫和，對(duì)酶蛋白活性

20、影響較小；設(shè)備簡(jiǎn)單，成本 低，能耗少；工藝流程簡(jiǎn)單，易于操作和管理，適低，能耗少；工藝流程簡(jiǎn)單，易于操作和管理，適 于大量樣品的處理。只能用于粗分離，分辨率較于大量樣品的處理。只能用于粗分離，分辨率較 低，只能將分子量相差低，只能將分子量相差10倍以上的分子完全分開(kāi)。倍以上的分子完全分開(kāi)。第三章第三章 酶的分離工程酶的分離工程酶工程酶工程（三）透析（三）透析 以濃度差作為傳質(zhì)推動(dòng)力，利用透析膜的膜孔截留作用以濃度差作為傳質(zhì)推動(dòng)力，利用透析膜的膜孔截留作用使不同大小溶質(zhì)分子相互分離的技術(shù)或方法。使不同大小溶質(zhì)分子相互分離的技術(shù)或方法。特點(diǎn)：特點(diǎn)： 以濃度產(chǎn)作為傳質(zhì)推動(dòng)力，以濃度產(chǎn)作為傳質(zhì)推動(dòng)力，

21、透過(guò)通量很小，分辨率不高，透過(guò)通量很小，分辨率不高，主要用于樣品的脫鹽，且局限主要用于樣品的脫鹽，且局限于實(shí)驗(yàn)室，難以大規(guī)模使用。于實(shí)驗(yàn)室，難以大規(guī)模使用。透析示意圖透析示意圖第三章第三章 酶的分離工程酶的分離工程酶工程酶工程四、萃取分離四、萃取分離 利用樣品中各組分在兩相中溶解度或分配比的不同來(lái)實(shí)利用樣品中各組分在兩相中溶解度或分配比的不同來(lái)實(shí)現(xiàn)目標(biāo)產(chǎn)物的分離和純化的技術(shù)或方法稱為萃取分離?，F(xiàn)目標(biāo)產(chǎn)物的分離和純化的技術(shù)或方法稱為萃取分離。 根據(jù)兩相的狀態(tài)，萃取可分為：根據(jù)兩相的狀態(tài)，萃取可分為：液夜萃取液夜萃取、液固萃取、液固萃取、液氣萃取、超臨界流體萃取。液氣萃取、超臨界流體萃取。 液夜萃

22、取：有機(jī)溶劑萃取、液夜萃取：有機(jī)溶劑萃取、雙水相萃取雙水相萃取、反膠團(tuán)萃取反膠團(tuán)萃取、液膜萃取。液膜萃取。第三章第三章 酶的分離工程酶的分離工程酶工程酶工程（一）雙水相萃?。ㄒ唬╇p水相萃取 某些親水性高分子聚合物在水溶液中混合達(dá)到一定的濃某些親水性高分子聚合物在水溶液中混合達(dá)到一定的濃度后，可自發(fā)形成分別富含有兩種不同聚合物的兩個(gè)相，由度后，可自發(fā)形成分別富含有兩種不同聚合物的兩個(gè)相，由于兩個(gè)相都是水溶液（相），稱為于兩個(gè)相都是水溶液（相），稱為雙水相系統(tǒng)雙水相系統(tǒng)。利用雙水相。利用雙水相系統(tǒng)進(jìn)行的萃取稱為系統(tǒng)進(jìn)行的萃取稱為雙水相萃取雙水相萃取。 特點(diǎn)特點(diǎn)：可用于酶或蛋白質(zhì)等生物大分子的萃取，

23、操作條：可用于酶或蛋白質(zhì)等生物大分子的萃取，操作條件溫和，不易導(dǎo)致目標(biāo)產(chǎn)物的變性失活，可從細(xì)胞破碎液中件溫和，不易導(dǎo)致目標(biāo)產(chǎn)物的變性失活，可從細(xì)胞破碎液中直接萃取胞內(nèi)目標(biāo)產(chǎn)物，相平衡時(shí)間短。成本較高，選擇性直接萃取胞內(nèi)目標(biāo)產(chǎn)物，相平衡時(shí)間短。成本較高，選擇性不高，分離后產(chǎn)物濃度低。不高，分離后產(chǎn)物濃度低。第三章第三章 酶的分離工程酶的分離工程酶工程酶工程成相物成相物A成相物成相物B聚丙稀乙二醇聚丙稀乙二醇甲氧基聚乙二醇、葡萄糖、磷酸鉀、硫酸葡聚糖鈉鹽甲氧基聚乙二醇、葡萄糖、磷酸鉀、硫酸葡聚糖鈉鹽聚乙二醇聚乙二醇聚乙烯醇、聚蔗糖、葡聚糖、磷酸鉀、硫酸鎂、硫酸鈉、甲聚乙烯醇、聚蔗糖、葡聚糖、磷酸鉀

24、、硫酸鎂、硫酸鈉、甲酸鈉、酒石酸鉀鈉酸鈉、酒石酸鉀鈉聚丙二醇聚丙二醇甲基聚丙二醇、聚乙二醇、聚乙烯醇、聚乙烯吡咯烷酮、羥甲基聚丙二醇、聚乙二醇、聚乙烯醇、聚乙烯吡咯烷酮、羥丙基葡聚糖、葡聚糖丙基葡聚糖、葡聚糖甲基纖維素甲基纖維素葡聚糖、羧甲基葡聚糖、羧甲基葡聚糖鈉鹽葡聚糖、羧甲基葡聚糖、羧甲基葡聚糖鈉鹽甲氧基聚乙二醇甲氧基聚乙二醇磷酸鉀磷酸鉀乙基羥乙基纖維素乙基羥乙基纖維素葡聚糖葡聚糖羥丙基葡聚糖羥丙基葡聚糖葡聚糖葡聚糖聚蔗糖聚蔗糖葡聚糖葡聚糖聚吡咯烷酮聚吡咯烷酮甲基纖維素甲基纖維素表表3-4 3-4 常見(jiàn)的雙水相體系常見(jiàn)的雙水相體系第三章第三章 酶的分離工程酶的分離工程酶工程酶工程1. 萃取

25、原理萃取原理 利用樣品中不同溶質(zhì)組分在兩相中溶解度或分配比的不利用樣品中不同溶質(zhì)組分在兩相中溶解度或分配比的不同來(lái)實(shí)現(xiàn)不同組分的相互分離。同來(lái)實(shí)現(xiàn)不同組分的相互分離。2. 影響因素影響因素 （1）成相聚合物的種類和濃度。）成相聚合物的種類和濃度。 （2）成相聚合物的分子量。）成相聚合物的分子量。 （3）電解質(zhì)、溫度和）電解質(zhì)、溫度和pH。 （4）酶的分子量、電荷性以及外加電場(chǎng)等。）酶的分子量、電荷性以及外加電場(chǎng)等。第三章第三章 酶的分離工程酶的分離工程酶工程酶工程（二）反膠團(tuán)萃?。ǘ┓茨z團(tuán)萃取微水相微水相反膠團(tuán)反膠團(tuán)有機(jī)相有機(jī)相水相水相反膠團(tuán)萃取示意圖反膠團(tuán)萃取示意圖 表面活性劑分子在有機(jī)表

26、面活性劑分子在有機(jī)溶劑中達(dá)到一定的濃度后，溶劑中達(dá)到一定的濃度后，可自發(fā)地形成疏水性尾部朝可自發(fā)地形成疏水性尾部朝外親水性頭部朝內(nèi)，含有水外親水性頭部朝內(nèi)，含有水分子內(nèi)核，納米級(jí)透明的熱分子內(nèi)核，納米級(jí)透明的熱力學(xué)穩(wěn)定的聚集體，稱為力學(xué)穩(wěn)定的聚集體，稱為反反膠團(tuán)膠團(tuán)。利用反膠團(tuán)進(jìn)行的萃。利用反膠團(tuán)進(jìn)行的萃取稱為取稱為反膠團(tuán)萃取反膠團(tuán)萃取。第三章第三章 酶的分離工程酶的分離工程酶工程酶工程1. 萃取原理萃取原理 利用酶或蛋白質(zhì)等電解質(zhì)與反膠團(tuán)中表面活性劑分子親利用酶或蛋白質(zhì)等電解質(zhì)與反膠團(tuán)中表面活性劑分子親水性頭部所帶荷電基團(tuán)之間的水性頭部所帶荷電基團(tuán)之間的靜電作用靜電作用以及反膠團(tuán)的以及反膠團(tuán)

27、的空間排空間排阻作用阻作用來(lái)促使目標(biāo)產(chǎn)物向反膠團(tuán)中溶解。來(lái)促使目標(biāo)產(chǎn)物向反膠團(tuán)中溶解。2. 操作過(guò)程操作過(guò)程微水相微水相反膠團(tuán)反膠團(tuán)有機(jī)相有機(jī)相水相水相 （1）正萃取）正萃取 （2）反萃?。┓摧腿〉谌碌谌?酶的分離工程酶的分離工程酶工程酶工程3. 影響因素影響因素 （1）水相）水相pH值。值。 （2）離子強(qiáng)度。）離子強(qiáng)度。 （3）表面活性劑和助表面活性劑。）表面活性劑和助表面活性劑。 （4）溫度和相比。）溫度和相比。 （5）蛋白質(zhì)的種類和濃度。）蛋白質(zhì)的種類和濃度。第三章第三章 酶的分離工程酶的分離工程酶工程酶工程五、層析分離五、層析分離 又稱色譜分離，利用溶液中不同的溶質(zhì)組分與又稱色譜分

28、離，利用溶液中不同的溶質(zhì)組分與固定相固定相之之間相互作用的不同，使得不同的溶質(zhì)組分隨間相互作用的不同，使得不同的溶質(zhì)組分隨流動(dòng)相流動(dòng)相通過(guò)固定通過(guò)固定相時(shí)的移動(dòng)速度不同，從而使不同的溶質(zhì)組分得以相互分離。相時(shí)的移動(dòng)速度不同，從而使不同的溶質(zhì)組分得以相互分離。層析方法層析方法分離依據(jù)分離依據(jù)層析方法層析方法分離依據(jù)分離依據(jù)凝膠層析凝膠層析 分子量與形狀分子量與形狀親和層析親和層析親和力親和力吸附層析吸附層析 吸附力吸附力層析聚焦層析聚焦等電點(diǎn)等電點(diǎn)分配層析分配層析 分配系數(shù)分配系數(shù)疏水層析疏水層析弱疏水作用弱疏水作用離子交換層析離子交換層析 離子交換離子交換反相層析反相層析強(qiáng)疏水作用強(qiáng)疏水作用表

29、表3-5 3-5 層析分離方法層析分離方法第三章第三章 酶的分離工程酶的分離工程酶工程酶工程梯度混合器梯度混合器樣品貯液器樣品貯液器層析柱層析柱恒流泵恒流泵蛋白核酸檢測(cè)儀蛋白核酸檢測(cè)儀自動(dòng)部分收集器自動(dòng)部分收集器記錄儀記錄儀柱層析過(guò)程裝置示意圖柱層析過(guò)程裝置示意圖第三章第三章 酶的分離工程酶的分離工程酶工程酶工程（一）凝膠層析（一）凝膠層析 又稱凝膠過(guò)濾層析、凝膠滲透層析、分子篩層析、分又稱凝膠過(guò)濾層析、凝膠滲透層析、分子篩層析、分子排阻層析。以各種顆粒狀的多孔凝膠作為固定相，利用子排阻層析。以各種顆粒狀的多孔凝膠作為固定相，利用溶質(zhì)分子量的差異進(jìn)行分離的層析分離法，稱為溶質(zhì)分子量的差異進(jìn)行分

30、離的層析分離法，稱為凝膠層析凝膠層析。凝膠顆粒凝膠顆粒常用的凝膠介質(zhì)：葡聚糖凝膠、瓊脂糖凝膠、聚丙烯常用的凝膠介質(zhì)：葡聚糖凝膠、瓊脂糖凝膠、聚丙烯 酰胺凝膠等酰胺凝膠等特點(diǎn)：特點(diǎn)：操作簡(jiǎn)單，樣品回收率高，不需操作簡(jiǎn)單，樣品回收率高，不需 要再生。分離速度慢，上樣量有要再生。分離速度慢，上樣量有 限。限。第三章第三章 酶的分離工程酶的分離工程酶工程酶工程混合樣品混合樣品小分子小分子中等分子中等分子大分子大分子凝膠層析示意圖凝膠層析示意圖1. 層析原理層析原理 在凝膠層析柱中具有凝膠顆在凝膠層析柱中具有凝膠顆粒內(nèi)部微孔和凝膠顆粒間隙兩種粒內(nèi)部微孔和凝膠顆粒間隙兩種孔道結(jié)構(gòu)。當(dāng)樣品溶液流過(guò)層析孔道結(jié)

31、構(gòu)。當(dāng)樣品溶液流過(guò)層析柱時(shí)，小分子溶質(zhì)可通過(guò)擴(kuò)散進(jìn)柱時(shí)，小分子溶質(zhì)可通過(guò)擴(kuò)散進(jìn)入凝膠內(nèi)部微孔中，移動(dòng)速度慢，入凝膠內(nèi)部微孔中，移動(dòng)速度慢，而大分子溶質(zhì)只能在凝膠顆粒間而大分子溶質(zhì)只能在凝膠顆粒間隙移動(dòng)，移動(dòng)速度快，從而使得隙移動(dòng)，移動(dòng)速度快，從而使得不同分子量的溶質(zhì)相互分離。不同分子量的溶質(zhì)相互分離。第三章第三章 酶的分離工程酶的分離工程酶工程酶工程2. 操作過(guò)程操作過(guò)程 （1）裝柱）裝柱 均勻，無(wú)氣泡均勻，無(wú)氣泡 （2）上樣）上樣 適量，一般為床體積的適量，一般為床體積的10%，不超過(guò)，不超過(guò)30% （3）洗脫）洗脫 恒定洗脫，流速要慢恒定洗脫，流速要慢第三章第三章 酶的分離工程酶的分離工程

32、酶工程酶工程（二）吸附層析（二）吸附層析 以各種固體吸附劑作為固定相，利用溶質(zhì)分子與吸附以各種固體吸附劑作為固定相，利用溶質(zhì)分子與吸附劑之間吸附作用力的差異進(jìn)行分離的層析分離法，稱為劑之間吸附作用力的差異進(jìn)行分離的層析分離法，稱為吸吸附層析附層析。 特點(diǎn)：特點(diǎn)：吸附劑種類豐富，可再生，設(shè)備簡(jiǎn)單，成本低。吸附劑種類豐富，可再生，設(shè)備簡(jiǎn)單，成本低。但分辨率相對(duì)較低。但分辨率相對(duì)較低。 常用吸附劑：常用吸附劑：硅膠，硅藻土，活性炭，羥基磷灰石，硅膠，硅藻土，活性炭，羥基磷灰石，氧化鋁，磷酸鈣，碳酸鹽，陶土等。氧化鋁，磷酸鈣，碳酸鹽，陶土等。 常用洗脫劑：常用洗脫劑：石油醚，環(huán)己烷，四氯化碳，三氯甲烷

33、，石油醚，環(huán)己烷，四氯化碳，三氯甲烷，甲苯，苯，二氯甲烷，乙醚、丙酮、正丙醇、乙醇、甲醇、甲苯，苯，二氯甲烷，乙醚、丙酮、正丙醇、乙醇、甲醇、水、吡啶、乙酸等。水、吡啶、乙酸等。第三章第三章 酶的分離工程酶的分離工程酶工程酶工程1. 層析原理層析原理 溶質(zhì)與固體吸附劑之間主要依靠范德華力產(chǎn)生吸附作溶質(zhì)與固體吸附劑之間主要依靠范德華力產(chǎn)生吸附作用。用。2. 洗脫方法洗脫方法 （1）溶劑洗脫法）溶劑洗脫法 洗脫展開(kāi)法洗脫展開(kāi)法 （2）置換洗脫法）置換洗脫法 （3）前沿洗脫法）前沿洗脫法 迎頭分析法迎頭分析法第三章第三章 酶的分離工程酶的分離工程酶工程酶工程（三）分配層析（三）分配層析 利用樣品中不

34、同組分在兩相間分配系數(shù)的不同來(lái)實(shí)現(xiàn)利用樣品中不同組分在兩相間分配系數(shù)的不同來(lái)實(shí)現(xiàn)不同組分相互分離的層析分離法。不同組分相互分離的層析分離法。 分配層析：紙層析、薄層層析分配層析：紙層析、薄層層析流流動(dòng)動(dòng)相相中中溶溶質(zhì)質(zhì)濃濃度度固固定定相相中中溶溶質(zhì)質(zhì)濃濃度度分分配配系系數(shù)數(shù) 第三章第三章 酶的分離工程酶的分離工程酶工程酶工程（四）離子交換層析（四）離子交換層析 以各種離子交換劑作為固定相，利用荷電溶質(zhì)與離子以各種離子交換劑作為固定相，利用荷電溶質(zhì)與離子交換劑之間離子交換能力或靜電作用力的不同使不同的荷交換劑之間離子交換能力或靜電作用力的不同使不同的荷電溶質(zhì)相互分離的層析分離法。電溶質(zhì)相互分離的

35、層析分離法。1. 層析原理層析原理 不同的荷電溶質(zhì)，所帶電荷性和電荷量不同，與離子不同的荷電溶質(zhì)，所帶電荷性和電荷量不同，與離子交換劑的離子交換力或靜電吸附力不同，洗脫的難易程度交換劑的離子交換力或靜電吸附力不同，洗脫的難易程度不同，從而使不同的荷電溶質(zhì)得以相互分離。不同，從而使不同的荷電溶質(zhì)得以相互分離。第三章第三章 酶的分離工程酶的分離工程酶工程酶工程2. 離子交換劑的選擇與處理離子交換劑的選擇與處理可交換可交換離子離子陰離子交換劑陰離子交換劑陽(yáng)離子交換劑陽(yáng)離子交換劑離子交換樹(shù)脂離子交換樹(shù)脂載體載體離子交換纖維素離子交換纖維素離子交換凝膠離子交換凝膠陰離子交換劑陰離子交換劑陽(yáng)離子交換劑陽(yáng)離

36、子交換劑氯型氯型羥型羥型鈉型鈉型氫型氫型R NH4+ Cl-R NH4+ OH-R COO- Na +R COO- H +第三章第三章 酶的分離工程酶的分離工程酶工程酶工程3. 離子交換層析的操作過(guò)程離子交換層析的操作過(guò)程 （1）裝柱）裝柱 均勻，無(wú)氣泡和裂縫均勻，無(wú)氣泡和裂縫 （2）上樣）上樣 樣品溶液應(yīng)控制適宜的樣品溶液應(yīng)控制適宜的pH和較低的鹽濃度和較低的鹽濃度 （3）洗脫）洗脫 增加離子強(qiáng)度的梯度洗脫法增加離子強(qiáng)度的梯度洗脫法 （4）再生）再生 高濃度鹽溶液洗脫或轉(zhuǎn)型高濃度鹽溶液洗脫或轉(zhuǎn)型第三章第三章 酶的分離工程酶的分離工程酶工程酶工程（五）親和層析（五）親和層析 利用生物分子與偶聯(lián)

37、有親和配基的固定相之間的特異利用生物分子與偶聯(lián)有親和配基的固定相之間的特異而可逆的親和作用力的不同使不同的生物分子相互分離的而可逆的親和作用力的不同使不同的生物分子相互分離的層析分離法。層析分離法。 生物親和作用生物親和作用是指生物分子對(duì)之間所具有的特異而可是指生物分子對(duì)之間所具有的特異而可逆的相互作用力?？蓪⑵渲械娜魏我环N生物分子與水不溶逆的相互作用力。可將其中的任何一種生物分子與水不溶性載體結(jié)合，用來(lái)分離另外一種生物分子。與載體結(jié)合的性載體結(jié)合，用來(lái)分離另外一種生物分子。與載體結(jié)合的生物分子稱為生物分子稱為配基（體）配基（體）。 常用的親和載體：葡聚糖凝膠、常用的親和載體：葡聚糖凝膠、瓊脂

38、糖凝膠瓊脂糖凝膠、聚丙烯、聚丙烯酰胺凝膠、纖維素等酰胺凝膠、纖維素等第三章第三章 酶的分離工程酶的分離工程酶工程酶工程1. 層析原理層析原理 當(dāng)樣品溶液通過(guò)偶聯(lián)有親和配基的固定相時(shí)，目標(biāo)產(chǎn)當(dāng)樣品溶液通過(guò)偶聯(lián)有親和配基的固定相時(shí)，目標(biāo)產(chǎn)物與親和配基作用吸附在固定相上，其它雜質(zhì)成分不能吸物與親和配基作用吸附在固定相上，其它雜質(zhì)成分不能吸附而流出，再將吸附在固定相上的目標(biāo)產(chǎn)物洗脫下來(lái)，即附而流出，再將吸附在固定相上的目標(biāo)產(chǎn)物洗脫下來(lái)，即可實(shí)現(xiàn)目標(biāo)產(chǎn)物與雜質(zhì)成分的分離?？蓪?shí)現(xiàn)目標(biāo)產(chǎn)物與雜質(zhì)成分的分離。 親和作用力本質(zhì)親和作用力本質(zhì)：靜電作用、疏水作用、金屬配位作：靜電作用、疏水作用、金屬配位作用、氫鍵

39、作用、弱共價(jià)鍵作用、結(jié)構(gòu)互補(bǔ)作用等用、氫鍵作用、弱共價(jià)鍵作用、結(jié)構(gòu)互補(bǔ)作用等第三章第三章 酶的分離工程酶的分離工程酶工程酶工程2. 親和層析方法親和層析方法 （1）共價(jià)親和層析共價(jià)親和層析 二硫鍵（二硫鍵（SS）弱共價(jià)鍵）弱共價(jià)鍵 （2）免疫親和層析免疫親和層析 以抗原或抗體中的一方為配基以抗原或抗體中的一方為配基 （3）金屬離子親和層析金屬離子親和層析 金屬離子與電負(fù)性原子配位鍵金屬離子與電負(fù)性原子配位鍵 （4）染料親和層析染料親和層析 以與輔酶結(jié)構(gòu)類似的染料為配基以與輔酶結(jié)構(gòu)類似的染料為配基 （5）凝集素親和層析凝集素親和層析 凝集素能特異性與糖基結(jié)合凝集素能特異性與糖基結(jié)合 （6）核酸親

40、和層析核酸親和層析 堿基互補(bǔ)或核酸與結(jié)合蛋白的作用堿基互補(bǔ)或核酸與結(jié)合蛋白的作用 （7）串聯(lián)親和層析串聯(lián)親和層析 蛋白質(zhì)與蛋白質(zhì)之間的相互作用蛋白質(zhì)與蛋白質(zhì)之間的相互作用第三章第三章 酶的分離工程酶的分離工程酶工程酶工程（六）層析聚焦（六）層析聚焦 以多緩沖離子交換劑作為固定相，根據(jù)酶等兩性電解以多緩沖離子交換劑作為固定相，根據(jù)酶等兩性電解質(zhì)的等電點(diǎn)的不同使不同的生物物質(zhì)相互分離的層析分離質(zhì)的等電點(diǎn)的不同使不同的生物物質(zhì)相互分離的層析分離法。法。（七）疏水（相互作用）層析（七）疏水（相互作用）層析 以偶聯(lián)有弱疏水配基的凝膠作為固定相，利用酶或蛋以偶聯(lián)有弱疏水配基的凝膠作為固定相，利用酶或蛋白質(zhì)

41、的疏水基團(tuán)與疏水配基之間的弱疏水性相互作用的不白質(zhì)的疏水基團(tuán)與疏水配基之間的弱疏水性相互作用的不同使不同的生物物質(zhì)相互分離的層析分離法。同使不同的生物物質(zhì)相互分離的層析分離法。特點(diǎn)：特點(diǎn)：高鹽濃度上樣，低鹽濃度洗脫。高鹽濃度上樣，低鹽濃度洗脫。第三章第三章 酶的分離工程酶的分離工程酶工程酶工程（八）高效液相色譜（八）高效液相色譜 優(yōu)點(diǎn)優(yōu)點(diǎn)： 色譜柱效高，壽命長(zhǎng)，可重復(fù)使用；色譜柱效高，壽命長(zhǎng)，可重復(fù)使用； 分離分離效率高，分析速度快；效率高，分析速度快； 可自動(dòng)進(jìn)樣和在線分析，自動(dòng)化可自動(dòng)進(jìn)樣和在線分析，自動(dòng)化程度高；程度高； 樣品用量少。樣品用量少。 缺點(diǎn)缺點(diǎn)：設(shè)備要求高，運(yùn)行成本高。：設(shè)備

42、要求高，運(yùn)行成本高。 高壓輸液系統(tǒng)高壓輸液系統(tǒng) 儲(chǔ)液罐、高壓輸液泵、梯度淋洗裝置儲(chǔ)液罐、高壓輸液泵、梯度淋洗裝置 進(jìn)樣系統(tǒng)進(jìn)樣系統(tǒng) 手動(dòng)進(jìn)樣、自動(dòng)進(jìn)樣手動(dòng)進(jìn)樣、自動(dòng)進(jìn)樣 分離系統(tǒng)分離系統(tǒng) 色譜柱、柱溫箱色譜柱、柱溫箱 檢測(cè)系統(tǒng)檢測(cè)系統(tǒng) 紫外檢測(cè)器、熒光檢測(cè)、示差檢測(cè)、電化學(xué)檢測(cè)、紫外檢測(cè)器、熒光檢測(cè)、示差檢測(cè)、電化學(xué)檢測(cè)、 二極管陣列檢測(cè)二極管陣列檢測(cè) 5. 數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)系統(tǒng)組成：系統(tǒng)組成：第三章第三章 酶的分離工程酶的分離工程酶工程酶工程（九）灌注色譜（九）灌注色譜 有效解決了傳統(tǒng)液相色譜的流速、分辨率及分離容量有效解決了傳統(tǒng)液相色譜的流速、分辨率及分離容量三者之間的矛盾，使得生

43、物大分子的快速、高效及大量分三者之間的矛盾，使得生物大分子的快速、高效及大量分離稱為可能。離稱為可能。 其核心技術(shù)在于色譜介質(zhì)的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)。其核心技術(shù)在于色譜介質(zhì)的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)。第三章第三章 酶的分離工程酶的分離工程酶工程酶工程六、電泳分離六、電泳分離 帶電粒子在電場(chǎng)中向著與自身所帶電荷相反的電極定帶電粒子在電場(chǎng)中向著與自身所帶電荷相反的電極定向移動(dòng)的過(guò)程成為向移動(dòng)的過(guò)程成為電泳電泳。 電泳分離電泳分離則是利用不同的荷電溶質(zhì)所帶電荷性、電荷則是利用不同的荷電溶質(zhì)所帶電荷性、電荷量不同，顆粒大小和形狀的不同，在電場(chǎng)中的移動(dòng)方向和量不同，顆粒大小和形狀的不同，在電場(chǎng)中的移動(dòng)方向和移動(dòng)速度不同，從而使不同

44、的荷電溶質(zhì)得以相互分離。移動(dòng)速度不同，從而使不同的荷電溶質(zhì)得以相互分離。 影響帶電粒子在電場(chǎng)中移動(dòng)速率的因素：電荷量、緩影響帶電粒子在電場(chǎng)中移動(dòng)速率的因素：電荷量、緩沖液沖液pH值、離子強(qiáng)度、電場(chǎng)強(qiáng)度、分子大小和形狀、電滲、值、離子強(qiáng)度、電場(chǎng)強(qiáng)度、分子大小和形狀、電滲、支持介質(zhì)的孔徑。支持介質(zhì)的孔徑。第三章第三章 酶的分離工程酶的分離工程酶工程酶工程（一）紙電泳（一）紙電泳以層析濾紙（條）作為支持介質(zhì)的電泳技術(shù)。以層析濾紙（條）作為支持介質(zhì)的電泳技術(shù)。（二）薄層電泳（二）薄層電泳 將淀粉、纖維素、瓊脂或硅膠等支持介質(zhì)物在玻璃、塑將淀粉、纖維素、瓊脂或硅膠等支持介質(zhì)物在玻璃、塑料板上鋪成薄層，再

45、來(lái)進(jìn)行電泳的分離技術(shù)。料板上鋪成薄層，再來(lái)進(jìn)行電泳的分離技術(shù)。（三）薄膜電泳（三）薄膜電泳 以醋酸纖維素等高分子物質(zhì)制成的薄膜作為支持介質(zhì)的以醋酸纖維素等高分子物質(zhì)制成的薄膜作為支持介質(zhì)的電泳技術(shù)。電泳技術(shù)。 特點(diǎn)：簡(jiǎn)便、快速、區(qū)帶清晰、靈敏度高、易于定量、特點(diǎn)：簡(jiǎn)便、快速、區(qū)帶清晰、靈敏度高、易于定量、便于保存；分辨率不及凝膠和薄層電泳高。便于保存；分辨率不及凝膠和薄層電泳高。第三章第三章 酶的分離工程酶的分離工程酶工程酶工程（四）凝膠電泳（四）凝膠電泳 以各種多孔凝膠作為支持介質(zhì)進(jìn)行的電泳技術(shù)。凝膠電以各種多孔凝膠作為支持介質(zhì)進(jìn)行的電泳技術(shù)。凝膠電泳兼有分子篩和電泳的雙重功效。泳兼有分子篩

46、和電泳的雙重功效。常用的凝膠介質(zhì)：常用的凝膠介質(zhì)：聚丙烯酰胺凝膠聚丙烯酰胺凝膠、瓊脂糖凝膠、瓊脂糖凝膠凝膠電泳：垂直管狀電泳、垂直板狀電泳凝膠電泳：垂直管狀電泳、垂直板狀電泳與凝膠層析的不同點(diǎn)：與凝膠層析的不同點(diǎn)： 凝膠是整體的，所有帶電粒子都在凝膠內(nèi)部網(wǎng)孔中移凝膠是整體的，所有帶電粒子都在凝膠內(nèi)部網(wǎng)孔中移動(dòng)；動(dòng)； 凝膠是現(xiàn)做先用的；凝膠是現(xiàn)做先用的；分子量越小，移動(dòng)速度越快。分子量越小，移動(dòng)速度越快。第三章第三章 酶的分離工程酶的分離工程酶工程酶工程聚丙烯酰胺凝膠的制備：聚丙烯酰胺凝膠的制備： 聚丙烯酰胺凝膠是以丙烯酰胺（聚丙烯酰胺凝膠是以丙烯酰胺（CH2=CH-CONH2）為單體，）為單體

47、，以以N,N-甲叉雙丙烯酰胺（甲叉雙丙烯酰胺（CH2=CH-CONH2-CH2-HNCO-CH=CH2）為交聯(lián)劑，在過(guò)硫酸銨和四甲基乙二胺（為交聯(lián)劑，在過(guò)硫酸銨和四甲基乙二胺（TEMED) )的催化下合的催化下合成的多孔凝膠。成的多孔凝膠。 改變單體丙烯酰胺的濃度可改變凝膠孔徑的大小。交改變單體丙烯酰胺的濃度可改變凝膠孔徑的大小。交聯(lián)劑濃度一般為丙烯酰胺總濃度的聯(lián)劑濃度一般為丙烯酰胺總濃度的25%。 先將所需的緩沖液、單體、交聯(lián)劑、催化劑制成高濃先將所需的緩沖液、單體、交聯(lián)劑、催化劑制成高濃度的儲(chǔ)備液冰箱中保存，制膠時(shí)根據(jù)所需濃度進(jìn)行稀釋，度的儲(chǔ)備液冰箱中保存，制膠時(shí)根據(jù)所需濃度進(jìn)行稀釋，混合

48、均勻后注入到凝膠管或凝膠板中，靜置即可凝固成膠?；旌暇鶆蚝笞⑷氲侥z管或凝膠板中，靜置即可凝固成膠。第三章第三章 酶的分離工程酶的分離工程酶工程酶工程丙烯酰胺丙烯酰胺適用分離物質(zhì)適用分離物質(zhì)相對(duì)分子量相對(duì)分子量25蛋白質(zhì)蛋白質(zhì) 510657.5蛋白質(zhì)蛋白質(zhì)5105 51067.510蛋白質(zhì)蛋白質(zhì)105 51051015蛋白質(zhì)蛋白質(zhì)5104 1051520蛋白質(zhì)蛋白質(zhì)104 51042030蛋白質(zhì)蛋白質(zhì)10425核酸核酸105 106510核酸核酸104 1051020核酸核酸104凝膠濃度與適用的分子量范圍凝膠濃度與適用的分子量范圍第三章第三章 酶的分離工程酶的分離工程酶工程酶工程1. 連續(xù)凝

49、膠電泳連續(xù)凝膠電泳整個(gè)凝膠柱或凝膠板的組成是連續(xù)一致的（一樣的）。整個(gè)凝膠柱或凝膠板的組成是連續(xù)一致的（一樣的）。2. 不連續(xù)凝膠電泳不連續(xù)凝膠電泳 整個(gè)凝膠柱或凝膠板是由樣品整個(gè)凝膠柱或凝膠板是由樣品膠、濃縮膠和分離膠幾層不同組成膠、濃縮膠和分離膠幾層不同組成的凝膠層所組成。的凝膠層所組成。 具有樣品濃縮作用，可提高電具有樣品濃縮作用，可提高電泳的分離效果。泳的分離效果。分離膠分離膠連續(xù)凝膠電泳連續(xù)凝膠電泳分離膠分離膠濃縮膠濃縮膠不連續(xù)凝膠電泳不連續(xù)凝膠電泳第三章第三章 酶的分離工程酶的分離工程酶工程酶工程濃縮膠：濃縮膠：Acr 2 5%, pH 6.7-6.8 Tris-HCl分離膠：分離膠：Acr 8 15%, pH 8.8-8.9 Tris-HCl電極緩沖液：電極緩沖液： pH 8.3 Tris-GlypIGly = 5.97分離膠分離膠濃縮膠濃縮膠Cl-Gly-第三章第三章 酶的分離工程酶的分離工程酶工程酶工程3. 梯度凝膠電泳梯度凝膠電泳 采用由上而下濃度逐漸升高、孔徑逐漸減小的梯度凝采用由上而下濃度逐漸升高、孔徑逐漸減小的梯度凝膠進(jìn)行電泳。膠進(jìn)行電泳。4. SDS-聚丙烯