核醫(yī)學教學課件：第六章 體外分析

1、 以放射性核素或其他非放射性物質(zhì)標記以放射性核素或其他非放射性物質(zhì)標記 的配體的配體(Ligand)為示蹤劑，以配體和結(jié)為示蹤劑，以配體和結(jié) 合體的結(jié)合反應為基礎(chǔ)，在試管內(nèi)進行合體的結(jié)合反應為基礎(chǔ)，在試管內(nèi)進行 的微量生物活性物質(zhì)的檢測技術(shù)。的微量生物活性物質(zhì)的檢測技術(shù)。 體外分析技術(shù)建立的基礎(chǔ)體外分析技術(shù)建立的基礎(chǔ): 配體配體-結(jié)合體結(jié)合體 抗原抗原-抗體的免疫結(jié)合反應；抗體的免疫結(jié)合反應； 配基配基-受體的結(jié)合反應；受體的結(jié)合反應； 底物底物-催化酶之間的酶促反應；催化酶之間的酶促反應； 激素激素-激素結(jié)合球蛋白的結(jié)合反應。激素結(jié)合球蛋白的結(jié)合反應。 方法學基礎(chǔ)：結(jié)合反應動力學規(guī)律方法學基

2、礎(chǔ)：結(jié)合反應動力學規(guī)律 體 外 分 析 技 術(shù) 體外放射分析體外放射分析 體外非放射分析體外非放射分析 放射性競爭放射性競爭 結(jié)合分析結(jié)合分析 放射性非競放射性非競 爭結(jié)合分析爭結(jié)合分析 radioimmunoassay, immunoradiometric assay, Dr. Yalow （一）競爭抑制結(jié)合反應：（一）競爭抑制結(jié)合反應： 放射免疫分析是在體外條件下，由足量的放射免疫分析是在體外條件下，由足量的 非標記抗原（非標記抗原（Ag）與定量的標記抗原（與定量的標記抗原（*Ag） 對限量的特異性抗體（對限量的特異性抗體（Ab）的競爭抑制結(jié)合的競爭抑制結(jié)合 反應。反應。 Ag-Ab +

3、Ag *Ag Ab Ag + + *Ag-Ab + *Ag (B)(F) 4*Ag與與Ag 免疫活性相同免疫活性相同 4*AgAg Ab Ag= * Ag , AgAb=*AgAb Ag *Ag , *AgAb (B) *Ag(F) Ag *Ag , *AgAb (B) *Ag (F) Ag*AgAb*AgAbAgAb*Ag + + + + + + + + + + + + + + + + +Ag 標準曲線的繪制方法標準曲線的繪制方法 用一系列已知濃度的標準抗原和一定量的標記抗原在用一系列已知濃度的標準抗原和一定量的標記抗原在 一定條件下同限量的特異性抗體進行反應；一定條件下同限量的特異性抗體進

4、行反應； 在反應達到平衡后，利用適當?shù)姆蛛x方法分離在反應達到平衡后，利用適當?shù)姆蛛x方法分離B和和F； 分別測量分別測量B和和F的放射性；的放射性； 用反應變量（如用反應變量（如B/F）作為縱坐標，反應劑量作為橫坐作為縱坐標，反應劑量作為橫坐 標（即一系列標準抗原）作一條曲線，就得到不同濃標（即一系列標準抗原）作一條曲線，就得到不同濃 度的標準抗原對反應變量的競爭抑制曲線，這就是劑度的標準抗原對反應變量的競爭抑制曲線，這就是劑 量反應曲線。量反應曲線。 Ag 2550100 200 400 800 *Ag Ab分離分離B、F B%=B/(B+F) F%=F/(B+F) R=B/F B1% B2%

5、 B3% B4% B5% B6% 123456 濃度濃度 B% 標標 準準 曲曲 線線 未知樣品的測量未知樣品的測量 Ag 2550100 200 400 800 *Ag Ab分離分離B、F B1% B2% B3% B4% B5% B6% 123456 B% ？ B% F% B/F Calibration Curve 60 I. 標準抗原與待測抗原、標記抗原具有基本標準抗原與待測抗原、標記抗原具有基本 相同的免疫活性，即質(zhì)同。相同的免疫活性，即質(zhì)同。 他們的化學結(jié)構(gòu)和化學性質(zhì)要相同，對特他們的化學結(jié)構(gòu)和化學性質(zhì)要相同，對特 異性抗體的親和力要相同。并且，標準抗異性抗體的親和力要相同。并且，標準

6、抗 原與待測抗原所處的介質(zhì)條件要相同。原與待測抗原所處的介質(zhì)條件要相同。 II.標準抗原的定量要準確：標準抗原的定量要準確： 整個整個RIA分析系統(tǒng)的定量基礎(chǔ)就是標準抗原的量，分析系統(tǒng)的定量基礎(chǔ)就是標準抗原的量， 因此標準抗原的定量一定要準確，即與國家規(guī)定的因此標準抗原的定量一定要準確，即與國家規(guī)定的 標準品相比有良好的可比性。標準品相比有良好的可比性。 只有保證標準抗原的準確定量，才能保證只有保證標準抗原的準確定量，才能保證RIA分析分析 系統(tǒng)的準確度和精確度。系統(tǒng)的準確度和精確度。 III.標準抗原必須高純度：標準抗原必須高純度： 標準抗原應該含有盡可能少的化學雜質(zhì)，以避免標準抗原應該含有

7、盡可能少的化學雜質(zhì)，以避免 雜質(zhì)對反應和計量的影響。雜質(zhì)對反應和計量的影響。 IV.標準抗原的穩(wěn)定性要好：標準抗原的穩(wěn)定性要好： 要保證在試劑盒的運輸、儲存和在實驗過程中應要保證在試劑盒的運輸、儲存和在實驗過程中應 該不發(fā)生降解，分離、破壞等。該不發(fā)生降解，分離、破壞等。 標記抗原的要求標記抗原的要求 I. 質(zhì)同，即標記抗原與標準抗原、待測抗原的化學性質(zhì)同，即標記抗原與標準抗原、待測抗原的化學性 質(zhì)和免疫活性要相同。質(zhì)和免疫活性要相同。 II. 標記抗原要有適當高的放射性比活度。標記抗原要有適當高的放射性比活度。 比活度高則在允許的相同的測量統(tǒng)計誤差的前提下，所使用比活度高則在允許的相同的測量

8、統(tǒng)計誤差的前提下，所使用 的標記抗原的量必然減少，那么在反應中與之競爭的待測抗的標記抗原的量必然減少，那么在反應中與之競爭的待測抗 原的量也相應減少，方法的靈敏度就提高了。原的量也相應減少，方法的靈敏度就提高了。 但過高的比活度，也會引起諸如輻射自分解和免疫活性受損但過高的比活度，也會引起諸如輻射自分解和免疫活性受損 的問題的問題。 III.標記抗原要有足夠高的放射化學純度，一般要大于標記抗原要有足夠高的放射化學純度，一般要大于95%。 放射化學純度不高，可能使一些放射性的雜質(zhì)對放射化學純度不高，可能使一些放射性的雜質(zhì)對RIA的免的免 疫反應和動力學參數(shù)產(chǎn)生影響。疫反應和動力學參數(shù)產(chǎn)生影響。

9、由于存在放射性核素的衰變，因此在長期儲存后的標記抗由于存在放射性核素的衰變，因此在長期儲存后的標記抗 原一般要經(jīng)過重新提純后才能再次使用。原一般要經(jīng)過重新提純后才能再次使用。 IV.標記抗原的穩(wěn)定性要好：標記抗原的穩(wěn)定性要好： 和標準抗原相比，標記抗原由于有了放射性核素和標準抗原相比，標記抗原由于有了放射性核素 射線的影響，更容易發(fā)生分解。射線的影響，更容易發(fā)生分解。 在標記抗原的儲存上，應遵循標記化合物的保存在標記抗原的儲存上，應遵循標記化合物的保存 原則即低溫、降低比放射性、清除自由基等。原則即低溫、降低比放射性、清除自由基等。 包括多克隆抗體和單克隆抗體。包括多克隆抗體和單克隆抗體。 抗

10、體的質(zhì)量之間關(guān)系到抗體的質(zhì)量之間關(guān)系到RIA分析方法的靈敏度分析方法的靈敏度 和特異性。和特異性。 多克隆抗體一般是用抗原免疫年輕、健康的純種多克隆抗體一般是用抗原免疫年輕、健康的純種 小動物（一般是羊或兔子）而誘發(fā)產(chǎn)生的抗血清。小動物（一般是羊或兔子）而誘發(fā)產(chǎn)生的抗血清。 制備的方法成熟、簡便、生產(chǎn)量大；但是里面成制備的方法成熟、簡便、生產(chǎn)量大；但是里面成 份復雜，免疫反應的動力學規(guī)律復雜。份復雜，免疫反應的動力學規(guī)律復雜。 單克隆抗體是通過雜交瘤技術(shù)篩選制備的，成份單克隆抗體是通過雜交瘤技術(shù)篩選制備的，成份 單一、穩(wěn)定、特異性強；但成本較高。單一、穩(wěn)定、特異性強；但成本較高。 抗體的要求（

11、抗體的要求（三高三高） 2. 交叉反應率：交叉反應率： 指抗體識別相應抗原類似物的能力，反應了抗體的指抗體識別相應抗原類似物的能力，反應了抗體的 特異性。特異性。 在生物體內(nèi)的復雜環(huán)境中，許多生物活性物質(zhì)都有在生物體內(nèi)的復雜環(huán)境中，許多生物活性物質(zhì)都有 很多相似的類似物，例如甲狀腺素中就有很多相似的類似物，例如甲狀腺素中就有T3、T4、 rT3等，雌激素里又有雌二醇、雌三醇等。等，雌激素里又有雌二醇、雌三醇等。 交叉反應率越低，則說明抗體與抗原類似物的交叉交叉反應率越低，則說明抗體與抗原類似物的交叉 反應就越小，其識別抗原類似物的能力就越強，特反應就越小，其識別抗原類似物的能力就越強，特 異性

12、就越強。異性就越強。 常用常用50%置換法來測定交叉反應的百分率。置換法來測定交叉反應的百分率。 即將被測物質(zhì)和其類似物，分別作競爭抑制曲線，即將被測物質(zhì)和其類似物，分別作競爭抑制曲線， 比較兩者在其結(jié)合率為零管結(jié)合率（比較兩者在其結(jié)合率為零管結(jié)合率（B/B0=50%） 時的劑量響應濃度，其比值即為交叉反應百分率，時的劑量響應濃度，其比值即為交叉反應百分率， 也就是該抗體對被測物某種類似物的相應活力。也就是該抗體對被測物某種類似物的相應活力。 （三）特異性分離方法（三）特異性分離方法 （一）誤差的分類和來源：（一）誤差的分類和來源： （二）質(zhì)量控制（二）質(zhì)量控制 質(zhì)量控制就是使用合適的方法以檢

13、查、表示和消除質(zhì)量控制就是使用合適的方法以檢查、表示和消除 來自試劑藥盒和測量體系的誤差，并使這種誤差來自試劑藥盒和測量體系的誤差，并使這種誤差 降低到某一允許水平。降低到某一允許水平。 具體作用有：具體作用有： 1檢查誤差的程度，決定測定結(jié)果的取舍。檢查誤差的程度，決定測定結(jié)果的取舍。 2識別誤差的來源并消除其原因。識別誤差的來源并消除其原因。 3改進測定方法的設(shè)計以提高質(zhì)量。改進測定方法的設(shè)計以提高質(zhì)量。 回收管內(nèi)加入的已知量 對照管測量值回收管測量值 回收率 （3）健全性評價：）健全性評價： 主要用于評價標準品與待測樣品的免疫活性是否一主要用于評價標準品與待測樣品的免疫活性是否一 致。致

14、。 用反應緩沖液將樣品稀釋成不同的劑量，繪制樣品用反應緩沖液將樣品稀釋成不同的劑量，繪制樣品 稀釋曲線，如果樣品與標準品免疫活性相同，得到稀釋曲線，如果樣品與標準品免疫活性相同，得到 的曲線應該是一組平行的曲線，所以又稱為平行性的曲線應該是一組平行的曲線，所以又稱為平行性 實驗。實驗。 3. 靈敏度（靈敏度（sensitivity）：）： 是指是指RIA方法剛能與不含有標準抗原的零標準管在方法剛能與不含有標準抗原的零標準管在 統(tǒng)計學上區(qū)別開來的抗原最低劑量，即該統(tǒng)計學上區(qū)別開來的抗原最低劑量，即該RIA方法方法 的最小可檢測量。的最小可檢測量。 確定靈敏度的方法主要有：確定靈敏度的方法主要有：

15、 同一樣品同一樣品10次測量結(jié)果的次測量結(jié)果的B/B090的劑量的平的劑量的平 均值作為最小可測量。均值作為最小可測量。 以以10次測量結(jié)果的次測量結(jié)果的B0管結(jié)合率均值減去管結(jié)合率均值減去2SD（標（標 準差）的結(jié)合率的劑量對應值為最小可測量。準差）的結(jié)合率的劑量對應值為最小可測量。 4. 特異性：特異性： 方法的特異性主要取決于抗體的特異性。方法的特異性主要取決于抗體的特異性。 用用 抗體的交叉反應率來表示?？贵w的交叉反應率來表示。 5. 穩(wěn)定性：穩(wěn)定性： 測量結(jié)果的穩(wěn)定性可以通過劑量反應曲線的各測量結(jié)果的穩(wěn)定性可以通過劑量反應曲線的各 個參數(shù)的穩(wěn)定性來間接反映。個參數(shù)的穩(wěn)定性來間接反映。

16、 如標準曲線的斜率和截距，零標準管結(jié)合率的如標準曲線的斜率和截距，零標準管結(jié)合率的 75%、50%、25%處的劑量值處的劑量值(ED75、ED50、ED25 等等)。 五、五、RIA的方法學的方法學 （一）反應方式：（一）反應方式： 1. 平衡加樣法：也稱一步法，是將非標記抗原、平衡加樣法：也稱一步法，是將非標記抗原、 標記抗原和抗體同時加入反應體系進行反應。標記抗原和抗體同時加入反應體系進行反應。 優(yōu)點：使非標記抗原、標記抗原兩者與抗體優(yōu)點：使非標記抗原、標記抗原兩者與抗體 有相同的反應幾率，操作方便，精密度較好，有相同的反應幾率，操作方便，精密度較好， 穩(wěn)定性好。穩(wěn)定性好。 缺點：反應時間

17、長，靈敏度較差。缺點：反應時間長，靈敏度較差。 2. 順序加樣法：先將非標記抗原與抗體溫育反應一定順序加樣法：先將非標記抗原與抗體溫育反應一定 時間（時間（624小時），形成抗原抗體復合物后，然后小時），形成抗原抗體復合物后，然后 再加入標記抗原短時間（再加入標記抗原短時間（14小時）溫育后中止反小時）溫育后中止反 應。應。 優(yōu)點：使非標記抗原與抗體結(jié)合的幾率比標記抗原優(yōu)點：使非標記抗原與抗體結(jié)合的幾率比標記抗原 高，提高了非標記抗原的競爭能力，提高了方法的高，提高了非標記抗原的競爭能力，提高了方法的 靈敏度。靈敏度。 3. 添加劑：添加劑： 0.5牛血清白蛋白：減少反應試管對微量抗原、牛血清

18、白蛋白：減少反應試管對微量抗原、 抗體的吸附?？贵w的吸附。 0.01mol/l EDTA鈉鹽：多功能的螯合劑，可以去除鈉鹽：多功能的螯合劑，可以去除 樣品中的鈣鎂離子。樣品中的鈣鎂離子。 0.05疊氮鈉：防腐劑。疊氮鈉：防腐劑。 RIA的操作一般包括加樣、孵育、分離、測量和數(shù)據(jù)處的操作一般包括加樣、孵育、分離、測量和數(shù)據(jù)處 理理5個部分。個部分。 1. 加樣：注意所有的試管加樣總體積要保持一致，所加樣：注意所有的試管加樣總體積要保持一致，所 處的介質(zhì)環(huán)境也要一致。處的介質(zhì)環(huán)境也要一致。 2. 孵育：根據(jù)不同的分析對象孵育的溫度和時間不同，孵育：根據(jù)不同的分析對象孵育的溫度和時間不同， 一般是一般是37。 3. 分離：選擇好的分離方法進行分離。分離：選擇好的分離方法進行分離。 4.